Równanie Michaelisa-Menten
Dla trzystopniowej nieodwracalnej reakcji enzymatycznej 4.3.3:
E + S
ES
EP
E + P 4.3.3
gdzie k+1, k-1, k+2 i k+3 - odpowiednie stałe szybkości reakcji.
Przyjmując, że najpowolniejszą częścią procesu jest etap przejścia kompleksu enzym-substrat [ES] do kompleksu enzym-produkt [EP] ze stałą k+2 < (k+1, k-1, k+3), tym samym określa się za pomocą k+2 szybkość całej reakcji:
v = k+2 [ES] 4.3.4
Michaelis i Menten w 1913, a potem Briggs i Haldane w 1925 pokazali, zakładając że wkrótce po rozpoczęciu reakcja dochodzi do stacjonarnego stężenia [ES], że spełniona jest zależność:
4.3.5
zwana równaniem Michaelisa-Menten, gdzie:
[S], stężenie substratu; [E0], całkowite stężenie enzymu;
Vmax = k+2[E0], maksymalna szybkość reakcji enzymatycznej;
, stała Michaelisa, stężenie substratu dla którego szybkość reakcji wynosi połowę Vmax.
Graficzną interpretację pokazano na Rysunku 4.1 Jest to funkcja hiperboliczna o asymptotach Vmax i -Km. Stała Km jest ważnym parametrem w enzymologii. Przy założeniu, że k-1 >> k+2, jest ona w przybliżeniu równa stałej dysocjacji (Kd) kompleksu ES do enzymu i substratu.
4.3.6
Dla większości reakcji enzymatycznych powyższe założenie jest prawdziwe. Ale nie jest spełnione, gdy powstanie kompleksu ES wymaga wiązania kowalencyjnego.
Ponieważ szybkość maksymalna jest proporcjonalna do stężenia enzymu E0, wprowadzono więc stałą katalityczną kcat, zwana również liczbą obrotów, równą:
4.3.7
Dla przypadku [ES] = [E0] i stanu stacjonarnego mamy v = Vmax i kcat = k+2. Im Km jest mniejsza, tym substrat ma większe powinowactwo do centrum aktywnego, a równowaga pierwszej części procesu jest przesunięta w kierunku kompleksu ES i ten ostatni nasyca się przy niskich stężeniach substratu, dochodząc do Vmax.
Jeżeli reakcja enzymatyczna ma więcej substratów niż jeden, to każdy z nich ma swoją wartość Km. Jeżeli w środowisku reakcji jest wiele substratów enzymu, to będą one konkurować o miejsce aktywne enzymu tym lepiej, im niższa jest ich stała Km. Wartość Km zależy poza tym od temperatury i pH środowiska.
Aby określić Km i Vmax, prowadzi się pomiar v przy różnych stężeniach substratu. Dobrze jest mieć pomiary zarówno poniżej Km (2-5 razy mniej niż Km), jak i powyżej (2-5 razy więcej niż Km) Km. Jeżeli wartość Km jest znana w przybliżeniu, łatwo zaplanować odpowiednie stężenia substratu. Jeżeli nie, to trzeba na bieżąco dopasowywać kolejne stężenia substratu, aby mieć efektywnie rozłożone punkty pomiarowe wzdłuż krzywej z Rysunku 4.1. Czasami trudno jest zrobić pomiar, dla którego osiąga się wartość Vmax, bo nawet przy stężeniu równym 15ႴKm szybkość reakcji osiąga zaledwie wartości 90 % Vmax, a przyrządy absorpcyjne pozwalają na pomiar absorbancji < 3.5. Dlatego parametry kinetyczne Km i Vmax, wyznaczane są poprzez fitowanie wzoru 4.3.5 do punktów doświadczalnych. Dla oka ludzkiego łatwiej jest oceniać przebiegi liniowe niż hiperboliczne, dlatego wtedy, gdy jeszcze nie było komputerów, wprowadzono wiele różnych liniowych prezentacji graficznych równania Michaelisa-Menten. Niektóre z nich podano na Rysunku 4.2, a wzory które ich opisują to odpowiednio: wzór 4.3.8.A dla transformacji Lineweavera-Burkea pokazanej na Rysunek 4.2 A, wzór 4.3.8.B dla transformacji pokazanej na Rysunek 4.2 B, oraz wzór 4.3.8.C dla transformacji Eadie-Hofstee pokazanej na Rysunek 4.2 C.
4.3.8.A
4.3.8.B
4.3.8.C
Korzystając z równania 4.3.8.B, a szczególnie z 4.3.8.A, należy zachować szczególna ostrożność w zakresie niskich stężeń substratu [S]. Korzystając natomiast z równania 4.3.8.C, trzeba się liczyć z możliwości wystąpienia nieliniowości plotu (Rysunek 4.2 C) ponieważ wartość mierzonej szybkości reakcji (v) jest zazwyczaj obarczona większym błędem niż stężenie substratu [S], a występuje ona na obu osiach współrzędnych.
Jeżeli do fitowania używamy komputera oraz nieliniowej metody najmniejszych kwadratów, najdokładniejsze parametry fitowania dostaje się stosując wzór 4.3.5 (Hammes i inni, 1982).
Prędkość reakcji katalizowanej przez enzymy oligomeryczne (np. PNP) jest bardziej skomplikowaną funkcja stężenia substratów. Zazwyczaj wynika to ze zjawiska kooperatywności, tzn. asocjacja substratu z centrum aktywnym jednego monomeru, objawia się zwiększeniem lub zmniejszeniem powinowactwa substratu do centrum aktywnego sąsiedniego monomeru. Odpowiednio nazywa się to kooperatywnością dodatnią lub ujemną. Pod wpływem kooperatywności następują zmiany strukturalne lub elektrostatyczne (rozkład ładunku) w sąsiedniej podjednostce. W przypadku kooperatywności następują odchylenia od kinetyki hiperbolicznej. Dla kooperatywności dodatniej hiperbola przechodzi w funkcję sigmoidalną. Dla prezentacji typu Edie-Hofstee, dodatnia lub ujemna kooperatywność powodują odpowiednio wypukłość lub wklęsłość funkcji liniowej. Badane w tej pracy enzymy PNP są oligomeryczne, oraz niektóre z nich posiadają negatywną kooperatywność (zob. rozdz. 2.3).
Gdy enzym ma więcej niż jeden substrat, określenie wartości Km i Vmax dla danego substratu możliwe jest tylko pod warunkiem, że pozostałe substraty będą uczestniczyły w stężeniach nasycających, tj. w zakresie stężeń o 5-10 razy większych od wartości ich Km. Interpretacja otrzymanych parametrów dla reakcji wielosubstratowych jest inna niż dla modelu Michaelisa-Menten, ponieważ są one funkcjami wielu stałych szybkości reakcji.