Podłoże genetyczne zespołu Downa

Do powstawania abberacji chromosomowych dochodzi podczas gametogenezy lub bardzo wczesnych podziałów zygoty

Czynniki zaburzające podziały komórkowe:

• Promieniowanie jonizujące

• Czynniki chemiczne

• Hornony

• Wirusy

• Inne czynniki fizyczne i chemiczne (pole elektromagnetyczne)

Monosomie autosomów zawsze są letalne. Trisomie dużych chromosomów też. Tylko niewielki % trisomii 21, 13 i 18 chromosomu rodzi się żywych

1866- pierwszy opis kliniczny- J. Down

1956- zidentyfikowanie trisomii 21 jako przyczyny zespołu Downa

Cechy fenotypowe:

• Fałd nakątny

• Skośne oczy

• Plamki Brunshwilda okalające tęczówkę

• Nisko osadzone małżowiny uszne

• Opóźnienie rozwoju umysłowego

• Niski wzrost

• Niska nasada nosa

• Duży, pobrużdżony, wysunięty język

• Małpia bruzda

• Krótka szyja

• Spłaszczona potylica

• Otwarte, duże usta

• Rozszerzony nos

• Obniżone napięcie mięśniowe

• Szeroki odstęp między paluchem a pozostałymi palcami stopy

• Wady wrodzone: serca- 40%- najczęściej przeciekowe, zwężenia przewodu pokarmowego- 3-5%, przepukliny

• Niedorozwój tarczycy

• Zaburzenia rozwoju cielesno-płciowego

• Niezstąpienie jąder, niepłodność u chłopców

• Kobiety- płodne

• Przewodzeniowa utrata słuchu

• Zaburzenia narządu wzroku

• Objawy neurologiczne

• Progeria- szybsze skracanie telomerów, upośledzenie naprawy DNA)

• Niska odporność nieswoista (zwiększona aktywnośćdysmutazy ponadtlenkowej rozkłada nadtlenki komórek fagocytujących, zwiększona dawka białka SIOOβ, zwiększone wiązanie cynku aktywność grasicy, chemotaksja neutrofilów)

• Niska odporność komórkowa- słaba aktywacja limfocytów T

• Zwiększona podatność na nowotwory (białaczki), ale bardziej wrażliwe na leczenie

• Dzieci- mniej podatne na nowotwory narządowe

95%- przypadkowa mutacja, 1-5%- przekazywane przez rodziców

dysmorfia- nieprawidłowy wygląd

fenotyp- całokształt- wygląd, budowa i funkcjonowanie organizmu

95%- klasyczna trisomia; 1-3%- mozaika

ryzyko urodzenia dziecka z klasyczną trisomią wzrasta wraz z wiekiem matki (po 35 r.ż.= 1/50), ale najwięcej dzieci z klasyczną trisomią jest rodzonych przez matki w wieku 25-28 lat, bo wtedy w ogóle najwięcej dzieci (1/700, ale jeśli już jedno ma zespół Downa, to 1/50).

Przyczyny zwiększonego ryzyka urodzenia dziecka z klasyczną trisomią 21:

<35 r.ż (II dziecko)

• Skłonność do nierozdzielności chromosomów

• Ukryta mozaika (1-5% komórek)

• Mozaika gonadalna- wszystkie komórki mają prawidłowy kariotyp, ale komórki gonad mają albo w całości albo częściowo kariotyp z trisomią 21

> 35 r.ż

• Akumulacja błędów genetycznych w „starej” komórce jajowej

• Zmniejszenie zdolności odrzucania zygot płodów 21+

Ryzyko dla krewnych II i III sopnia nie większe niż ryzyko populacyjne

Trisomia translokacyjna- 4% przypadków

• Połączenie abberacji liczbowej ze strukturalną

• Powstaje de novo

• Odziedziczona po rodzicu- nosicielu translokacji robertsonowskiej zrównoważonej chromosomu 21 na inny( najczęściej 14, ale może być też 13, 18 i 21) utrata ramion krótkich nie powoduje zmian fenotypowych

Jeśli rodzic jest nosicielem ryzyko poczęcia dziecka z zespołem Downa wynosi 1/6. ryzyko urodzenia- teoretycznie 1/3, ale empirycznie 10-15% jeśli nosicielką jest matka, kilka %, gdy ojciec [kariotyp dziecka 46 XX/46XY t(13,21)(q10,q10)+21]. Przy translokacji 13/21 może też urodzić się dziecko z zespołem Patau

Ryzyko urodzenia się dziecka z trisomią translokacyjną przez rodzica nosiciela:

• Niezależne od wieku

• Zwiększone ryzyko dla krewnych II i III stopnia rodzinne nosicielstwo translokacji

• Jeżeli nosicielstwo dotyczy translokacji 21/21 nie ma szans na urodzenie zdrowego dziecka

Diagnostyka:

FISH- tylko we wstępnej diagnostyce, nie można na tym oprzeć rozpoznania nosicielstwa

- kariotyp konstytucyjny- limfocyty T

- liczba analizowanych metafaz 20-100

- kariotypowanie komórek pochodzących z innego listka zarodkowego (najczęściej fibroblasty- wycinek ze skóry)

badanie molekularne FISH i PCR- może wykryć, jeśli potrojony jest tylko fragment chromosomu)

region krytyczny dla zespołu Downa- 22q22.2-22q22.3- zawiera około 30 genów

APP- białko prekursorowe amyloidu- zlokalizowane w regionie krytycznym; amyloid gromadzi się w mózgu u osób chorych na Alzheimera, u osób z zespołem Downa więcej amyloidu

Ekspresja genów zlokalizowanych w tym rejonie jest taka sama, ale trzecia kopia oddziałuje na inne geny

Metody badań: prążkowanie GTG i FISH

- w 10-15% rozpoznanie kliniczne zespołu Downa fałszywie dodatnie

- rozpoznanie zespołu Downa- jedynie na podstawie badań genetycznych

- konieczność ustalenia mechanizmu powstania zespołu Downa wpłuw na wielkość ryzyka genetycznego

- fenotyp behawioralny

- leczenie objawowe

-rehabilitacja ogólnorozwojowa, wczesne usprawnianie

karcinogeneza

większość nowotworów złośliwych ma pochodzenie klonalne

1. zdolność do nadmiernej, niekontrolowanej proliferacji (autokrynna regulacja wzrostu, brak wrażliwości na czynniki supresorowe)

2. inwazyjność

3. immortalizacja- zdolność do nieograniczonego przeżywania i wzrostu

4. brak funkcjonalnego zróżnicowania

5. zdolność do tworzenia przeżutów( metastaz) czyli odłączanie się fragmentu od nowotworu, wchłanianie do naczyń limfatycznych lub krwionośnych, przenoszenie droga krwi/ chłonki, zasiedlenie odległego narządu

transformacja nowotworowa- wynik akumulacji mutacji genetycznych komórek prawidłowych

- każdemu z etapów mogą odpowiadać niewielkie zmiany w genomie komóki

- aby komórka mogła ulec pełnej transformacji nowotworowej musi mieć utrwalone mutacje w kilku lub kilkunastu genach (wielouderzeniowa koncepcja karcinogenezy- Knudson, siatkówczak)

- w miarę dorastania wzrasta liczba i różnorodność zmutowanych komórek

- mutacje genetyczne mogą powstawać w linii zarodkowej ( zmieniona forma jednego z genów odpowiedzialnych za powstanie nowotworów), może być przekazana potomstwu i predysponować do rozwoju nowotworu

dysplazja- nieprawidłowości w budowie tkanki

hiperplazja- przerost tkanki

Fazy:

1. inicjacja transformacji czynnikiem rakotwórczym w pojedynczej komórce- pierwsze trwałe i nieodwracalne zmiany w genomie: głównie dotyczy genów sterujących prawidłowym przebiegiem cyklu komórkowego, w konsekwencji powstaje nowy klon

2. promocja- kolejne mutacje prowadzą do dalszych uszkodzeń molekularnych, utrata łączności z komórkami prawidłowymi, pojawienie się inwazyjności, następuje klonalny wzrost komórek do stanu widocznej klinicznie zmiany o charakterze zwykle łagodnym; mechanizm promocji nie jest ostatecznie poznany, ale alkohol, nikotyna, UV, dieta mogą stymulować podziały komórek wcześniej zainicjowanych

3. progresja- nabywanie przez komórki zdolności do nieograniczonego wzrostu (komórka staje się autonomiczna)

4. przerzutowanie- końcowy etap, mechanizm molekularny jest nieznany

Geny kodujące białka: kontroli cyklu komórkowego, różnicowania, proliferacji, apoptozy, naprawy uszkodzeń DNA.

Nowotwory złośliwe- na skutek mutacji w 3 podstawowych typach genów : geny supresji nowotworowej, protoonkogeny, geny naprawy DNA

Procesy naprawcze:

• apoptoza

• telomery

• upośledzenie procesów kontroli wierności replikacji ( xeroderma pigmentosum, zespół Blooma, ataksja teleangiektazja)

antyonkogeny: regulują proliferację. Ich produkty: w błonie komórkowej, cytoplazmie lub jądrze komórki. Geny supresorowe są identyfikowane na podstawie ich braku. Zmiana jest widoczna dopiero przy uszkodzeniu 2 alleli (ilość białka produkowana przez 1 allel przeważnie jest wystarczająca). Efekt działania recesywny. Pierwszą mutacją w genie supresorowym jest zmiana zasady lub delecja, drugim- utrata funkcji drugiego allela w komórce somatycznej

BRCA1- gen supresorowy, jego mutacja predysponuje do rozwoju: raka piersi, jelita grubego i jajnika. Do 80 r.ż ryzyko rozwoju raka w odziedziczoną mutacją w tym genie wynosi 90%

Każde locus genów supresorowych odpowiada za rozwój różnych typów nowotworów:

Retinoblastoma 13q14, 11p13

Nefroblastoma 11p15

z. Recklinghausena 11p15, 17q11

dziedziczny rak jajnika i piersi 17q21

dziedziczny rak piersi 13q12

polipowatość jelit 5q21

Protoonkogeny: onkogeny komórkowe, wysoce konserwatywne, zmiany w genomie: mutacja punktowa, translokacja (chłoniak Burkita), punkt złamania (gen Philadelphia), amplifikacja protoonkogenem; pośrednie działanie wirusów (HPV rak szyjki macicy)

Terapia genowa

- leczenie przyczyn, wprowadzenie genu terapeutycznego lub oligonukleotydu do łańcucha DNA komórek uszkodzonych

warunkiem powodzenia jest uzyskanie ekspresji wprowadzonego genu

germinalna- w komórkach rozrodczych

somatyczna- defekt genetyczny nie jest usuwany, można uzyskac przywrócenie lub zwmocnienie utraconej lub osłabionej funkcji genu, można uzyskać supresję działąnia takiego genu

1. gen terapeutyczny- powinien utrzymywać się w komórkach docelowych ekspresja na poziomie zapewniającym odpowiednie stężenie białka terapeutycznego

a) kompensacja defektu,- najczęściej stosowany w chorobach spowodowanych mutacjami recesywnymi. Polega na wprowadzeniu do komórek docelowych prawidłowego genu. Ograniczenia to: wielkość genu, wydajność transferu leku do komórek docelowych, możliwośćprzypadkowej integracji transgenu z genomem komórki, czas utrzymywania się transgenu w komórce docelowej, powodzenie terapi zależy głównie od wektora. Wprowadzenie genu przez: plazmidowy DNA (nagi DNA,kompleksy ze związkami kationowymi) lub wirusowy RNA (zrekombinowane wirusy).Etapy: 1) przygotowanie genu pod kontrolą promotora (aktyny), 2) przygotowanie wektora (czas ekspresji zależy od długości życia komórki), 3) wybór i przygotowanie komórek docelowych)

sposoby wprowadzanie genów:

- in vivo: doguzowo, domięśniowo,do krwioobiegu; muszą być wprowadzane w sposób swoisty wykorzystując tropizm, za pomocą nośników mających odpowiednie ligandy

Dla zapewnienia swoistej ekspansji transgenów, która powinna odbywać się wyłącznie w komórkach docelowych, geny umieszcza się w wektorach aksjomatycznych.

Ex vivo- pobiera się komórki pacjenta, namnaża, modyfikuje genetycznie i wprowadza znów do organizmu pacjenta. Geny wprowadza się wyłącznie do określonych komórek docelowych. Nie dostają się one do surowicy.

Nie zawsze wprowadza się geny do komórek docelowych.np w hemofilii- można zmusić inne komórki do produkcji białka terapeutycznego

b) eliminacja komórek- przy HIV i nowotworach. Zabijanie komórek nowotworowych:

bezpośrednie- gen kodujący toksyczne białko wprowadzany jest do komóreki tylko w komórkach nowotworowych (dzieki swoistym dla nowotworu promotorom) ulega ekspresji. Toksyczne białko zabija komórki nowotworowe.

Pośrednie- uaktywnienie dzięki terapii genowej komórek układu odpornościowego do swoistego zabijania komórek nowotworowych; swoiste zahamowanie angiogenezy w nowotworach

c) nowa cecha fenotypowa- wprowadzenie genów białek nadających komórkom nową fizjologiczną funkcję:

- geny kodujące białka aktywujące komórki układu immunologicznego

- czynniki proangiogenne

- czynniki antyangiogenne

- wielolekooporności (MDR)- transfer do szpiku kostnego pozwala osłonić komórki prawidłowe przed działaniem dużych dawek cytostatyków

- tzw. Szczepionki DNA- wprowadzenie in vivo wektora kodującego antygen i wywołanie odporności na patogen

- tzw. Szczepionki RNA

2. terapia oligonukleotydem

a) hamowanie ekspresji genu- na poziomie transkrypcji lub translacji za pomocą antysensów.

Antysensy- oligonukleotydy, których sekwencja jest komplementarna do mRNA lub do sekwencji DNA genu lub jego promotora

Mogą wiązać się z DNA i tworzyć złożone struktury przestrzenne: tripleksy, kompleksy trójpasmowe.

Ograniczenia- zależy od: metod wprowadzania do komórek, stabilności wprowadzonych oligonukleotydów (mogą być aktywowane przez enzymy nukleolityczne), dawki wprowadzonego antysensu

b) korekta mutacji zmutowanego genu- ma charakter stałę,wielkość zmutowanego genu nie ma znaczenia. Do naprawy wykorzystuje się zmutowane oligonukleotydy, fragmenty DNA, rybozymy i chimeryczne oligonukleotydy, zbudowane z rybo- i deoksyrybonukleotydów

Wektor- plazmid lub wirus do którego można wstawić transgen

Wektor ekspresyjny- umożliwia wydajną transkrypcję wbudowanego transgenu

- wirusowe: adenowirusy, retrowirusy, wirusy opryszczki, AAV (wirusy towarzyszące adenowirusom)

-niewirusowe: liposomy kationowe- związki polikationowe, używane po wytworzeniu kompleksu z plazmidowym DNA

Problemy terapii genowej:

- wprowadzanie transportera genu terapeutycznego do organizmu

- układ immunologiczny

- pojemność wektora

- swoista integracja z genomem

- faza cyklu życiowego komórek

- swoiste przyłączenie się do komórek

- niedostateczna wiedza na temat przekazywania sygnału w komórce

Sondy molekularne:

- oligonukleotydowe pochodzenia naturalnego,można je otrzymać przez określone zabiegi molekularne, np. klonowanie

- syntetyzowane chemicznie

Zalety:

• stosunkowo łatwa dostępność

• możliwość dowolnego programowania

• nie ma potrzeby denaturacji,gdyż sonda jest jednoniciowa

• krótki czas hybrydyzacji

• wysoka selektywność

znakowanie sond:

• wprowadzenie radioaktywnego izotopu fosforu zamiast atomów niepromieniotwórczych.

• Dołączenie biotyny i digoksygeniny,wykrywa się w procesach reakcji barwnych

Hybrydyzacja Southern

- izolacja i oczyszczanie

- trawienie

- rozdział elektroforetyczny i denaturacja

- przesączanie z żelu na filtr

- hybrydyzacja z sondą

- ustalanie położenia fragmentów.

Zastosowanie:

• Wykrycie rearanżacji genowych,

• Badanie polimorfizmu długich fragmentów restrykcyjnych DNA

Metoda Nothern

- badanie aktywności genu

- bez trawienia(bo RNA jest jednoniciowe)

Dot-blot: metoda półilościowa, szybka, przesiewowa.

DNA Finger-printing- genetyczny odcisk palca

• Oparta na hybrydyzacji southern, ale inne żele

• Do ustalania ojcostwa

• Różna dla każdego osobnika

• Badania medyczno-sądowe

PCR: technika biologii molekularnej,wysoka czułość, w żelach agarowych lub poliakryloamidowych

Skład mieszanki reakcyjnej:

Matryca DNA, startery, dNTF, MgCl2, polimeraza Taq,bufor

Denaturacja wstępna, cykle denaturacja- liza- synteza, synteza końcowa, przechowywanie

Klonowanie, hybrydyzacja, amplifikacja.

RT-PCR- wyjściową matrycą jest RNA, przepisywana na cDNA i dopiero potem amplifikacja jak w zwykłym PCR

PCR- multiplex- kilka próbek (do 13)

PCR- RFLP-PCR z analizą restrykcyjną: mutacja lub jej brak

Real-time PCR- bez żelu,obraz na ekranie monitora

ASA-PCR: komplementarny tylko do mutacji. Bez cięcia, z użyciem wewnętrznych starterów.

GeneChip- mikropłytka zawierająca w zdefiniowanych miejscach sondy DNA, zaprojektowane na podstawie znajomości badanego genomu, umożliwiająca jednoczesne odczytanie informacji o strukturze lub ekspresji tysięcy genów. Bez elektroforezy, znakowany materiał, a nie sondy

1. projektowanie i produkcja DNA chip

2. fragmentacja i znakowanie badanego DNA

3. hybrydyzacja

4. usunięcie niezwiązanego materiału

5. wywołanie sygnału hybrydyzacji

6. odczytanie wyniku

sonda fotolitograficzna, do przenoszenia/drukowania/

• drobny ślad biologiczny brama do wiedzy o całym genomie

• automatyzm i szybkość badania

• potencjalne sytuacje: zatrudnienie -elity genetyczne; ubezpieczenia- dyskryminacja; wybór partnera życiowego i embrionu- eugenika

• diagnostyka pre- i postnatalna chorób

• projektowanie leków pod kątemindywidualnego profilu genetycznego pacjenta

• terapia przeciwnowotworowa, poznanie przyczyn nowotworzenia

• rozwój genomiki funkcjonalnej

• rozwój agrobiotechnologii

Płeć

- genetyczna

- gonadalna

- somatyczna

- fenotypowa

- psychoseksualna

- metrykalna

Gen SRY- determinuje rozwój jądra z prapierwotnych komórek,które produkują androgeny. Uruchamia kaskadę genów odpowiadającą za pobudzenie innych genów produkujący czynnik antymuellerowski

W 12 tyg. Ciąży nie powinno już być u płodu elementów drugiej płci

Kariotyp- charakterystyczny zestaw chromosomów

Heteromorfizm chromosomów- niewielkie dziedziczne różnice w budowie chromosomów (zmienność osobnicza). Dotyczy: ramienia długiego chromosomu Y( regiony nieaktywnej transkrypcji), przycentromerowe regiony chromosomów 1,9,16, wszystkich chromosomów akrocentrycznych (NOR i satelity)

Obecność białek zasadowych w histonach ułatwia wiązanie się z DNA. Z 5 histonów,4 mają wysoce konserwatywną budowę.

Chromatyna- jest kompleksem kwasy nukleinowe- białko; widoczna jest w jądrze interfazalnym; skondensowana to heterochromatyna, luźna to euchromatyna.

Podstawową jednostką chromosomu jest nukleosom: białka histonowe oplecione 2,5 raza podwójną helisą DNA. DNA nukleosomu zawiera zawsze taką samą ilość par zasad.

Włókno chromatynowe to solenoid.

W satelitach wiele sekwencji powtórzonych,gł. Sekwencje satelitowe, SINES i LINES

Telomery umożliwiają zlepianie się chromosomów i zapewniają właściwe ułożenie w jądrze komórkowym, chronią chromosomy przed utratą istotnego materiału genetycznego.

Kolejność chromosomów odpowiada ilości informacji genetycznej, którą posiadają.

Mitoza

Synteza DNA komórki eukariotycznej- 84 h (faza S)

Faza G2- cały genom jest podwojony- 4 h

Faza M- faza podziału- niecała 1 h:

1. profaza- stopniowa spiralizacja, kondensacja chromatyny, zanika błona jądrowa

2. metafaza- chromosomy osiągają największy stopień kondensacji, wędrują do płaszczyzny równikowej, formują płytkę metafazalną, powstaje wrzeciono mitotyczne, odłączenie chromatyd siostrzanych (późna metafaza)

3. anafaza- chromatydy wędrują do przeciwległych biegunów, stając się chromosomami potomnymi

4. telofaza- zostaje odtworzona błona jądrowa i jąderko, dekompensacja chomosomów

Mejoza

W I podziale występuje rekombinacja i redukcja liczby chromosomów. Replikacja poprzedza I podział, a rekombinacja zachodzi w I podziale mejotycznym.

I. 1) profaza

a) leptoten- chromosomy widoczne jao długie, cienkie nici

b) zygoten- chromosomy przylegają do siebie tworząc biwalenty

c) pachyten- ulegają kondensacji, zjawisko crossing-over

d) diploten- rozdzielenie się biwalentów, widać połączenia między chromatydami

e) diakineza- terminalizcja chiazm

2) metafaza- chromosomy chomologiczne gromadzą się w płaszczyźnie równikowej

3) anafaza- wędrują do przeciwległych biegunów komórki

Powstają 2 komórki, po 23 chromosomy. Redukcja liczby chromosomów następuje w II podziale.

Antycypacja= wyprzedzanie- przebieg chorób z wczesnymi objawami cięższy w kolejnych pokoleniach

Mutacje: genowe: substytucje (tranzycja, tranzwersja), insercja, delecja

Chromosomowe inwersja, translokacja, duplikacja, deficjencja

Metody analizy chromosomów:

• 
  HRT- duża rozdzielczość prążkowa chromosomów, uzyskuje się dzięki zwiększeniu w hodowli liczby komórek mitotycznych w stadiach poprzedzających metafazę. Najmniejsza aberracja jaką można wykryć to 2-5 *10 p.z. (bez HRT 7-10)

• ISH- hybrydyzacja in situ

W haploidalnym zestawie chromosomów mitotycznych-ok.400 prążków,w innych fazach-500-1250

Są 3 podstawowe techniki barwienia

• G- cienkie prążki- AT (późno replikujące DNA), jasne odpowiedają regionom wcześnie replikującej się i aktywnej transkrypcyjnie chromatyny; uzyskiwane przez trawienie chromosomów trypsyną (T) a następnie barwienie barwnikiem Giemsy (GTG) lub Wrighta (GTW)

• Q- powstaje w wyniku trawienia chromosomów pochodnymi akrydyny (QFQ)

• R- wzór stanowi odwrotność G, może być uzyskiwany różnymi metodami

Techniki szczegółowe- potwierdzają i identyfikują aberację. Najczęstrze:

- wybarwianie heterochromatyny centromerowej (prążki C)

- Ag-NOR- srebrzenie organizatorów jąderka

- A/DAPI- barwienie distamycyną

Nieaktywny chromosom X późno replikuje DNA, aby go rozróżnić wykorzystuje się technikę RBA, umożliwiającą wybarwienie prążków R. Nieaktywny X wykazuje słabszą fluorescencję, otrzymuje się to dzięki wprowadzeniu do hodowli na ostatnie kilka godzin bromodeoksyurydyny (BrdU)

Zasady:

- w 15-20 metafazach określamy liczbę chromosomów (30-50, gdy podejrzenie aberacji chromosomów płci lub mozaikowatości)

- szczegółowa analiza obrazu prążkowego w 3-5 metafazach

- dostosowanie stopnia rozdzielczości prążkowej do wskazania, które zdecydowało o wykonaniu badania

Opis kariotypu: liczba, chromosomy płci, określenie abberacji chromosomowej:

Aberacje liczbowe np. +21, -21

Aberacje strukturalne: symbol aberacji, chromosom/y którego dotyczy, ramię, region i prążki (np. del(2)(q31-q35) delecja długiego ramienia chromosomu 2 w regionie 3 między punktami 1 i 5)

W przypadku mozaiki- klony komórkowe podawane w kolejności uwzględniającej wielkość komórek- klon prawidłowy podawany jest jako ostatni, w nawiasach podawana jest liczba metafaz w których zostały zaobserwowane; np. mos 45X[15]/ 47XXX [10]/ 46XX [23]

Hybrydyzacja in situ

• Wykrywa specyficzne sekwencje DNA w preparatach cytologicznych

• Połączenie metody cytogenetycznej i molekularnej

• Identyfikacja regionów możliwa dzięki powstaniu w odpowiednich warunkach kompleksów DNA chromosomowego ze specyficzną sondą molekularną.

• Detekcja możliwa jestdzięki wyznakowaniu sondy fluorochromem lub przez zmodyfikowanie jej cząsteczki DNA przez np. wbudowanie do niej biotyny lub dioksygeniny

Sonda- fragment DNA, którego sekwencja nukleotydów ma określoną specyficzność (jest komplementarna do badanego regionu chromosomu)

FISH- wykorzystuje fluorescencję do detekcji sondy; umożliwia identyfikację aberacji również w jądrach interfazalnych. Najczęściej stosowana jest do:

• Identyfikacji addycji chromosomalnych nieznanego pochodzenia,

• Chromosomów markerowych

• Złożonych translokacji

• Zaburzeń różnicowania płci, obojnactwa,

• Metoda z wyboru w detekcji mikrodelecji

Wynik w ciągu 48 h

M-FISH (multicolor)- każda para fluoryzuje na inny kolor

SKY- analiza widmowa kariotypu, nie wymaga hodowli

CGH- technika porównawczej hybrydyzacji genowej

Ryzyko genetyczne: powinno być podawane ilościowo, dotyczy zawsze określonej pary. Jeżeli statystycznie ryzyko wynosi 50% to w rzeczywistości jest ono mniejsze, gdyż często kończy się poronieniem

- wzrost, masa, głowa, dysmorfie celowana diagnostyka DNA i RNA

Analiza rodowodowo- kliniczna

Genotyp- genetyczna budowa jednostki w danym locus

-mniejsze ryzyko powtórzenia jeśli dziedziczenie jest wieloczynnikowe (RZS, choroby stawów), ale największe, gdy:

• Rodzice mają wiele genów wspólnych

• U bliźniąt monozygotycznych ryzyko, że u obu wystąpi choroba- 80%

• Już u krewnych III stopnia ryzyko nie większe niż populacujne

płeć wpływa na ryzyko (nadciśnienie- mężczyźni, RZS kobiety). Jeżeli na RZS choruje mężczyzna to ryzyko w jego rodzinie jest większe.

Ryzyko powtórzenia wady jeśli rodzic ma wadę- 3%, np. rozszczep podniebienia

3% - mały ubytek przedsionkowy

6-7%- duża wada serca, rozszczep wargi i podniebienia ( przy 400 chorobach jedno- i wielogenowych, może współistnieć z defektem w syntezie cholesterolu,monogenowe- zesół Patau)

5%- schizofrenia; 20% gdy oboje rodziców

W 59% etiologia wad wrodzonych nieznana

2-3% noworodków rodzi się z wadą wrodzoną (z czego 6% spowodowana mikrodelecjami)

8%- czynniki środowiskowe

Ok. 10%- czynniki teratogenne: toksoplazmoza, cukrzyca, cytomegalia, alkohol, fenyloketonuria, padaczka, leki obniżające poziom kwasu foliowego.

Malformacje- wada wrodzona wywołana przez pierwotne zaburzenia rozwoju w okresie zarodkowym (proliferacja, różnicowanie, migracja, apoptoza)

Deformacje- jedna wada pociąga następną: np. agenezja nerek mała ilość płynu owodniowego ucisk macicy na płód wady głowy; ucisk na klatkę piersiową zaburzenia oddychania

Przepukliny przy wadach cewy nerwowej

Dysrupcje amputacja wewnątrzmaciczna- gdy włóknik otacza jakąś część ciała

Toidomid- lek przeciwbólowy, uspokajający przebadany na gryzoniach, powodował fokomelię lub amelię u dzieci 20% ciężarnych stosujących lek

Potworniak- bardzo dobrze unaczyniony nowotwór tkanki embrionalnej

Dzieci chorych na cukrzycę- często z przepukliną oponową

Cytomegalia- ognisko zwapnienia w tkance mózgu

Makroglosia- powiększenie języka (w zespole Beckwitha- Wiedemanna: makrosomia, przepuklina pępowinowa, cxzasem asymetria ciała, często nefroblastoma, hiperinsulinemia co 3 m-ce do 3. r.ż. usg jamy brzusznej, markery nowotworowe)

Wodogłowie- poszerzenie komór mózgu

Geny homeoboksowe

HOM- geny homeotyczne u muszki- geny,których mutacje powodują upodobnienie się segmentów jednej części ciała do segmentów innej części ciała, bardzo konserwatywne ewolucyjnie

Mutacje homeotyczne- mutacje, w których jeden schemat rozwojowy jest zastąpiony innym, powoduje, że narząd różnicuje się nieprawidłowo albo tworzy się narząd charakterystyczny dla przylegającego segmentu:

1. typu utraty funkcji- przejęcie funkcji nadzorczej przez inny gen homeotyczny rozwój w danum obszarze struktur charakterystycznych dla innego obszaru ciała

2. typu aktywującego- przejęcie przez dany gen funkcji sterowania częścią ciała, która normalnie nie leży w jego kompetencji

geny homeoboksowe- jedna z grup genów rozwojowych

• przypisują komórkom w różnych częściach ciała konkretną tożsamość przestrzenną wzdłuż osi przednio-tylnej

• występują w DNA wszystkich komórek, ale ich ekspresja zachodzi tylko w tych komórkach,które należą do okolic ciała zawiadywanych przez dany gen

• w danej tkance specyficzny układ ekspresji genów Hox

klasa I- geny HOX/Hox- zlokalizowane w kompleksach Hox A5, Hox B9

klasa II- genu nie-HOX/Hox- zlokalizowane poza głównymi kompleksami- np. Hox 11

Homeobox

• sekwencja homeotyczna (180 nukleotydów)

• decyduje o specyficzności genu

• koduje domenę homeotyczną (60 aminokwasów) odpowiedzialne za wiązanie DNA

• są genami regulatorowymi dla innych genów białka Hox

• geny homeoboksowe jednego gatunku można zastąpić genami innego zwierzęcia

Geny Hox

• 38 genów zawartych w 4 kompleksach: A, B, C, D, wynik podwójnej duplikacji pierwotnego 13-genowego kompleksu

• Stopniowa utrata niektórych genów- żaden z kompleksów nie zawiera wszystkich 13 genów macierzystego kompleksu

• Lokalizacja- chromosomy 2, 7, 12, 17

• Geny paralogiczne (ortologiczne)- zlokalizowany w tych samych miejscach różnych kompleksów u różnych gatunków (podobieństwo w genach w tych samych miejscach a nie w tym samym kompleksie numer a nie litera)

Liniowy porządek genów 3'5'

- odzwierciedlenie

• Kolejność obszarów ciała określanych przez nie wzdłuż osi przednio-tylnej

• Kolejność ich aktywacji i ekspresji w okresie rozwoju zarodkowego

• Stopnia ich wrażliwości na kwas retinowy

- analogiczne u różnych gatunków zwierząt- stwierdzona patologia płodów i osobników dojrzałych porównanie z fenotypem wad wrodzonych u człowieka szukanie odpwoeidniego genu HOX

Zagadka genu Hox A3.

Sterowana mutacja genu Hox A3 u myszy powodowała: nieprawidłowości rozwoju układu krążenia, brak grasicy i przytarczyc, anomalie budowy tarczycy fenotyp podobny do fenotypu zespołu DiGeorga (mikrodelecja 22q11) u człowieka, ale w tym regionie nie stwierdzono obecności genu homeoboksowego.

Hipoteza: gen zlokalizowany w 22q11 moduluje funkcje HOX A3 na chromosomie 7

Geny nie-HOX- ciężkie zespoły:

EMX2- rozszczep mózgowia

MSX2- przedwczesne zarośnięcie kości czaszki degradacja tkanki mózgowej

wyjątkowo rzadkie występowanie zespołów wad wrodzonych spowodowanych mutacjami genów homeoboksowych

1. wysoki stopień homologii między genami paralogicznymi pełna lub prawie pełna kompensacja

2. letalność mutacji genów nie-HOX

geny PAX- homeoboksowe, 360 nukleotydów, nie są zlokalizowane w kompleksach, cechy kodowane w różnych regionach ciała:

PAX 2- ubytki nerwu wzrokowego, dysplazja nerek

PAX3- ekspresja w czasie wczesnej neurogenezy nieprawidłowa migracja komórek pochodzących z pierwotnej cewy nerwowej, zaburzenia funkcji neurologicznych cząstek adhezyjnych (N-CAM)

- zespół Wardenburga I (głuchota, wodoocze, hiperteloryzm, zaburzenia pigmentacji)

PAX6- na 11p13 leży w pobliżu genu WT1- guz wilmsa- brak tęczówki/ gałki ocznej.

Zespół WAGR- zespół Wilmsa+ aniridia+ opóźniony rozwój umysłowy

Geny HOX a integryny:

• lokalizacja genów w podobnych pozycjach tych samych chromosomów.

• Geny integryn- też paralogiczne

• Równoległa ewolucja tych dwóch grup genów

Geny HOX a nowotwory

• Geny homeoboksowe koordynują funkcje wielu genów biorących udział w patogenezie nowotworów

• Nadmierna lub rozregulowana ekspresja genów homeoboksowych kodujących czynniki transkrypcyjne- molekularna podstawa wielu nowotworów

• Niektóre geny homeoboksowe= protoonkogeny komórkowe

Przerzuty

• Tkanki transplantowane- zachowany wzór ekspresji genów homeoboksowych z macierzystego miejsca

• Przerzuty nowotworowe- analogicznie wzór guza pierwotnego, nie zachodzi w nich ekspresja genów homeoboksowych charakterystycznych dla lokalizacji miejsca przerzutu

• Układ ekspresji genów homeoboksowych to wskaźnik histologicznego typu nowotworu pierwotnego

• Rola w diagnostyce nowotworów, zwłaszcza na podstawie przerzutów, gdy nieznany jest typ i pochodzenie nowotworu pierwotnego

Komórka nowotworowa

• Wykazują wzór ekspresji genów homeoboksowych charakterystyczny dla tkanki z której się wywodzą

• Przemieszczają się zgodnie z pozycyjną informacją zawartą w tych genach ( nieprzypadkowa dla danego typu nowotworu lokalizacja przerzutów- tylko do zaprogramowanych w komórkach nowotworowych tkanek i narządów: rak piersi do kości i płuc; rak jajnika do żołądka

6

---