Jonoselektywne elektrody membranowe (ISE)

Potencjometria bezpośrednia w diagnostyce laboratoryjnej

∙ oznaczenia stężenia elektrolitów w płynach ustrojowych

- kationy: H,K,Na,Ca,Mg, amony

- aniony:

F,Cl, wodorowęglowe

Ogniwo pomiarowe

-elektroda pomiarowa ( wskaźnikowa) której potencjał elektryczny zależy od aktywności oznaczanego jonu w roztworze badanym (najczęściej elektrody jonoselektywne ISE

-elektroda odniesienia ( porównawcza), której potencjał jest stały w warunkach pomiaru (najczęściej elektroda chlorosrebrowa)

SEM ogniwa zanurzonego w r-rze badanym zależy od aktywności (stężęnia) oznaczanego

jonu (stosuje się zwykle 1 kombinowaną elektrodę w 1 obwodzie)

Elektrody pomiarowe = ISE

∙cecha wspólna = obecność membrany selektywnie oddziałującej z oznaczanymi jonami

Oddziaływanie to jest źródłem potencjału elektrycznego elektrody

Część membranoa najważniejsza, zewnętrznie styka się z r-rem badanym, a wewnątrz styka się roztworem elektrolitu ( ciecz, żel), który ma jony na które metoda (elektroda) jest czuła i elektroda wyprowadzająca)

Membrana bezpośrednio połączona z przewodem wyprowadzającym , bądź pośrednio przez płytkę z tym przewodem.

Zalety potencjometrii bezpośredniej z wykorzystaniem ISE

∙ szeroki zakres prostoliniowości (zależność SEM od stężenia, linia prosta w szerokim zakresie stężeń)

∙ bardzo niskie granice oznaczalności i wykrywalności

∙ wysoka selektywność (konkretny jak w układach wieloelektrodowych, zdeterminowane obecności ą elektrody)

Podział ISE

I ISE z membranami stałymi

II ISE z membranami ciekłymi

III ISE z membranami podwójnymi

I ISE z membranami stałymi (do pomiaru pH)

1. Szkło o składzie warunkującym czułość elektrody na określone kationy (H⁺, K⁺, Na⁺, NH4⁺) - zwykle w jonometrii

2. Nieorganiczne sole (halogenki , siarczki) w formie monokryształu, sprasowanego materiału krystalicznego lub rozproszonego w obojętnej matrycy (żywica lilikanowa)

Przykłady

- fluorek lantaru LaF₃ - elektroda czuła na aniony fluorkowe

-halogenki srebra (Agi, AgCl, AgBr)elektroda czuła na jony srebra oraz aniony Cl^-, Bi^-, I^-

-siarczek srebra elektroda czuła na jony srebra i aniony siarkowe

-siarczek srebra + siarczki metali ciężkich , elektroda czuła jw.+ kationy metali (Pb, Hg, Cd)

II ISE z membranami ciekłymi

Obojętna chemicznie porowata matryca (PCV, octan celulozy, ;polietylen, żywica silikonowa, materiał ceramiczny) zwilżona rozpuszczalnikiem organicznym zawierającym hydrofobowy związek oddzieł.z ozn. Jonem ( kationit, anionit, zw. kompleksujący obojętny nośnik = jonofor)

Przykład :

- Walinomycyna - jonofor, zdolny do selektywności o wiąza K⁺ i przenoszenia ich poza błony biologiczne

- membrana z PCV impregnowana antybiotykiem walinomycyną - ISE czuła na jony K⁺.

III ISE z membranami podwójnymi

∙ elektrody enzymatyczne

∙ elektrody gazowe

Przykłady elektrody enzymatycznej

-ISE do oznaczania mocznika w płynach ustrojowych

∙ Budowa - elektroda szklana czuła na jony NH₄⁺, pokryta warstwą membranową zawierającą enzym ureazę

∙ działanie - pod wpływem ureazy zawartej w próbce mocznik ulega rozkładowi z wytworzeniem jonów NH₄⁺, których stężenie odpowiada stężeniu mocznika, a na które reaguje zminą potencjału elektroda szklana.

Przykłady elektrody hazowej

Elektroda do oznaczania CO1 we krwi

∙ Budowa: elektroda szklana czuła na jony H+ mieszczona w zbiorniku wypełnionym buforem o ściśle określonym pH. Dno zbiornika stykające się z próbką badaną stanowi membrana z tlenem lub polietylen, przepuszczalna dla CO₂

∙ działanie : gaz dyfunduje do wnętrza zbiornika z buforem zmieniając jego pH, co rejestruje elektroda szklana

CO₂ + H₂0 H⁺ + HCO₃ ^-

Selektywność ISE

∙ im mniejsza wartość k, tym ISE bardziej selektywna

∙ miarą selektywności ISE jest wartość współczynnika selektywności k określonego względem konkretnego jonu interferującego

∙ ISE nie są idealne selektywnie na wartość potencjały może wpływać obecność innych jonów w roztworze badanym.

Współczynnik k informuje ile razy stężenie jonu interferującego ( przeszkadzającego) musi być większe od stężenia jonu oznaczanego, aby spowodować 100% błąd oznaczenia tzn., aby potencjał wywołany przez jon interferujący był taki sam jak potencjał wywołany przez jon oznaczony

Np. k=0,0001 oznacza że stężenie jonu przeszkadzającego muis być 10 000 razy wyższe od oznaczanego, aby wytworzyć taki sam potencjał elektrody

kation

|

Potencjał ISE E=E₀ ± ( 0,059/z) log c (stężenie jonu)

Wzór Ernsta | | | |

| | anion Wartościowość jonu

Potencjał elektrody

|

Potencjał jonowy elektrody

Czułość ISE s = ± 0,059/z

Informuje w jakim kierunku i o ile zmieni się potencjał ISE (= SEM ogniwa), jeśli stężęnia oznaczanego jonu wzrośnie 10 razy

Dla M+ wzrost SEm o S[V]

Dla M- spadek SEM o S[V]

Im wyższa bezwzględna wartość S tym ISE bardziej czuła !

Czułość ISE zmniejsza się ze wzrostem wartości jonu

2 : 1 0,059/4 = 55mV

2 : 2 0,059/2 = 29,5mV

2 : 3 0,059/3 = 19mV

Teoretyczna wartość S niemal zawsze różni się od wartości rzeczywistej, której zmienną jest nachylenie charakterystyki ISE

Charakterystyka ISE

Wykres zależności SEM ogniwa pomiarowego zestawionego i testowanej ISE i elektrody odniesienia od stęż. Zon. Jonu (logC lub PC)= krzywa kalibracyjna ISE.

1.Roztwory wzorcowe o wyższym stężeniu

2. Zestawić ogniwo pomiarowe kolejno w każdy 1 (r-ry wzorcowe)

3. Dla każdego rejestrować SEM

Równanie prostej opisującej prostoliniowy odcinek krzywej kalibracyjnej

SEM [Mv] = A ± S log c

A - potencjał formalny ISE wyznaczony względem elektrody odniesienia - stała dla danego ogniwa pomiarowego obejmującego potencjał normalny ISE i potencjał elektrody odniesienia.

Dla kationów :

Wzrost stężenia powoduje wzrost SEM ogniwa pomiarowego

Dla anionów :

Wzrost stężenia powoduje obniżenie SEM ogniwa pomiarowego

UWAGA!! Wzrost stężenia = wzrost wartości logC, ale obniżenie pH

Biosensory = bioczujniki, czujniki biologiczne

Przyrządy zwykle zminiaturyzowane, stosowane w analizie medycznej, biotach., ochronie śr. Do oznaczania zw. biologicznie czynnych

Budowa: sygnał

Subst. Oznaczana (analit | element przetwarzający (sensor, czujnik) ------- rejestracja

^ przetwarzanie sygnału

Biologiczny element detekcyjny

Reakcja agalitu z wartwą receptorową generuje sygnał, który przekształca się przez El. Przetw. Bio.

Warstwa receptorowa= materiał aktywny biologicznie odpowiedzialny za selektywność biosensora

-enzym immunobiologiczny

-przeciwcziala

-zywe mikroorganizmy

- tk. Roślinne i zwierzęce

-organella komórkowe

Biosensory:

-potencjometryczne

-amperometryczne

-optyczne (optoelektryczne)

-termistorowe

-piezoelektryczne

Biosensory enzymatyczne:

- bardzo wysoka selektywność w stosunku do substratu

- procedura immobilizacji :

∙chemicznie (kowalencyjnie) lub fizycznie zw. bezpośrednio z pow. Sensowa

∙fizycznie lub chemicznie

Biosensory mikrobiologiczne

-wykorzystują naturalną aktywność biokatalityczną żywych kom. Bakteryjnych (zaw w nich enzymów)

-bakterie są fiz. Zw. z pow. Sensora po przez unieruchomienie za pomocą membrany, przep. Szklanej dla enzymów.

-duża czułość, ale mała selektywność i długi czas odpowiedzi)

-wrażliwe na obecność w analizowanych próbkach zw. wpływających na szybkość metabolizmu kom. Bakterii = możliwość wykorzystywania do oznaczania trucizn, toksyn i mutagenów.

Biosensory tkankowe:

-cienki plaster tkanki lub izolowane organelle kom. Zmieszczone na końcówce sensora i zabezpieczone porowatą membraną

-lepsza selektywność

-bardzo długi czas życia

Immunosensory:

- oparte na selektywności oddziaływania przeciwciała z antygenem z wytworzeniem stabilnego, termodynamicznego kompleksu (specyficzność detekcji)

-jako wartw. Recept. Biosensora można wykorzystać oba skł. Kompleksu

-wyznaczają pośredni typ. Detekcji, wymagający obecności znaczników (np. fluorescencyjnych) umożliwiających śledzenie reakcji wiązania agalitu z receptorem.

Biosensory z przetwornikiem potencjometrycznym

∙warstwa receptorowa to najczęściej immunobilizowany enzym

∙ przetworniki ISE czułe na jony których stężenie w próbce zmienia się w wyniku reakcji enzymatycznej (często elektroda szklana)

Mocznik - końcowy produkt degradacji białek w organizmie człowieka.

Znaczenie diagnostyczne poziomu we krwi :

∙ ocena wydolności nerek

∙ kontrola pozanerkowego oczyszczenia krwi ( dializoterapia)

Oznaczenie metabolizmu enzymatycznego pomiar stężenia produkcji hydrolizy mocznika katalizowanej przez ureazę.

Mocznik + H₂O amoniak + CO₂

Biosensory do oznaczania mocznika:

∙ wartwa receptorowa: immobilizowana ureaza

∙przetworniki : np. ISE czuła na NH+ lub H+ (zmiany pH) elektroda gazowa czuła na CO₂ (pozostający w równowadze z jonami HCO^3- i CO₃^2- lub NH₃ (pozostający w równowadze z jonami amonowymi), czuły na jony wodorkowe tranzystor polowy (ISFET)

Schemat ideowy ISFET:

Elektroda odniesienia, bramka, izolator, kanał, membrana jonowymienna, źródło, dren, podłoże.

∙ główny element pomiarowy membrana jonowymienna czuła na określony typ jonów naniesiona na bramkę tranzystora (membrana może być zwizana z enzymem = ENFET)

∙ napięcia sterujące przyłożone do bramki przy określonej wartości potencjału na granicy membrana - roztwór zapewnia określoną wartość mierzonego sygnału wyjściowego

∙ wymiana jonów powoduje skok potencjału na granicy membrana - roztwor.

∙ zmiana sygnału wyjściowego jest proporcjonalna do aktywności oznaczanych jonów

Biosensory z przetwornikiem amperometrycznym :

- warstwa receptorowa: najczęściej enzymy lub mikroorganizmy ( szczepy bakteryjne)

- przetworniki : elektroda tlenowa Clarka lub elektroda rejestrująca nadtlenek wodoru

Przykłady oznaczania z wykorzystaniem biosensorów amperometrycznych

∙ cholesterol oksydaza cholesterolowa /H₂O₂

∙ α - aminokwasy : oksydaza - α- aminokwasy / H₂O₂ lub O₂

∙ amoniak - bakterie nitrujący / tlen

∙ szczawiany : oksydaza szczawianowa / tlen

∙ glukoza : pseudomonas fluorescens / tlen

Elektroda tlenowa Clarka = elektroda amperometryczna

(oznaczanie Cl, H₂S, O₂ = stężenia lub ciśnienia )

∙ wartość mierzonego prądu elektrody amperometrycznej wynika z reakcji wymiany O^- pomiędzy oznaczaną substancją, a elektrodą roboczą (katodą)

Elektroda tlenowa Clarka:

∙ katoda : platyna ∙ anoda : elektroda chlorosrebranowa ∙ elektrolit : nasycony KCl

∙ membrana : 1 przepuszczalna jedynie dla O₂

∙ warstwa oksydazy glukozowej

∙ membrana 2 przepuszczalna dla substratów i produktów reakcji

∙ tlen ulega redukcji na katodzie

∙ prąd na wyjściu zależy od wymiany elektronów między tlenem a katodą.

∙ ubytek tlenu w próbce zmniejsza prąd tlenowy dyfundując w stanie katody.

F-glukoza + O₂ D - glukonolakton + H₂O₂

Amperometryczny biosensor do oznaczania glukozy :

- warstwa receptorowa : oksydaza glukozowa immobilizowana w membranie przepuszczalnej dla glukozy i tlenu (teflon)

- przetwornik : elektroda tlenowa Clarka

∙ spadek natężenia prądu jest proporcjonalny do stężenia glukozy w próbce

∙ odczyt z krzywej kalibracyjnej (pomiar spadku natężenia prądu dla roztworów o różnych stężeniach glukozy.

Natężęnie prądy dla El. Clarka jest < jeżeli zmniejszymy w próbce zawartość substratu dla enzymu.

Biosensory optyczne:

∙ wartwa receptorowa immobilizowana na powierzchni włókna światłowodowego połączonego z przetwornikiem zmniejsza sygnał optycznu na elektrodzie.

∙ detekcja bezpośrednia i reakcja analit - receptor generuje sygnał optyczny lub osłabia już istniejący.

∙ detekcja pośrednia : wykorzystywana np. w optycznych biosensorach do oznaczania glukozy

Budowa optycznego biosensora

∙ mamy białko z gr. Leukin, unieruchamia się dekstran. Wnętrze jest oświetlone. Membrana przepuszczalna dla glukozy. Glukoza wypiera dekstran. Natężenie fluorescencji można mierzyć.

---