OZNACZANIE AKTYWNOŚCI ENZYMÓW

na przykładzie pepsyny

Zadania kolokwialne:

1. Podział enzymów

2. Budowa enzymów

3. Jednostki aktywności enzymów- od czego zależy aktywność enzymów

4. Inhibitory reakcji enzymatycznych

5. Regulacja reakcji enzymatycznych

6. Metoda Lowry'ego

7. Metoda Ansona

Cel: oznaczenie stężenia peptydów będących produktami reakcji proteolizy metodą Lowry'ego. Wykreślenie krzywej kalibracyjnej w układzie absorbancji od ilości białka (albuminy). Określenie czystości preparatu pepsyny.

Ćw. 1 Oznaczanie aktywności pepsyny wobec hemoglobiny metodą Ansona

Wykonanie

Część 1. Hydroliza (potrzebne 15 probówek, 15 korków i 2 statywy, 15 kolbek małych, 5 lejków (1 dla danej ilości pepsyny w 3 powtórzeniach i 1 dla trzech prób kontrolnych) i 15 bibułek, wykonuje 1 część osób z podgrupy 1) Roztwór pepsyny1 = 75mg w 100 ml wody dest.

Do czterech probówek szklanych w trzech powtórzeniach dodać kolejno 0,2; 0,3; 0,4 i 0,5 ml roztworu pepsyny a następnie po 1 ml 5% roztworu hemoglobiny i dopełnić do 5 ml buforem o pH 2,2. Próby inkubować przez 30 min w 37 ºC. Równolegle inkubować trzy próby kontrolne zawierające tylko roztwór pepsyny (0,5 ml) i dopełniamy do 4 ml buforem o pH 2,2. Po inkubacji do wszystkich prób dodać po 5 ml 20% roztworu TCA, a do prób kontrolnych ponadto 1 ml roztworu hemoglobiny. Próby przetrzymać w temp pokojowej przez 5 min mieszając, a następnie przesączyć przez bibułę do kolbek stożkowych (15 kolbek małych).

Oznaczenie produktów hydrolizy (tyrozyny i tryptofanu) (15 kolbek przesączu prób badanych i kontrolnych + 1 kolbka próby odniesienia, wykonuje 1 część osób z podgrupy 1)

Do 0,5 ml klarownego przesączu (prób badanych i kontrolnych) dodać 2 ml wody destylowanej a następnie 5 ml 0,5 M roztworu NaOH i 0,5 ml rozcieńczonego (1:1,5) odczynnika Folina-Ciocalteu. Natychmiast dokładnie wymieszać i po 10 min odczytać absorbancję przy długości fali 720 nm wobec 1 próby odniesienia/ślepej (przygotowanej w analogiczny sposób jak próby badane zawierające jednakże zamiast ekstraktu 0,5 ml 10% TCA) i dopiero dalej pomiar 3 prób kontrolnych i 12 badanych.

Część 2. Przygotowanie krzywej wzorcowej tyrozyny (potrzebne 6 kolbek, wykonuje 2 część osób z podgrupy 1, sporządza swoją inną próbę odniesienia)

Do próbówek dodać kolejno 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 ml wzorcowego roztworu tyrozyny co odpowiada kolejno 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 µmol tyrozyny. Uzupełnić partię do objętości 0,5 ml 0,2 N roztworem HCl. Równocześnie przygotować próbę odniesienia/ślepą (zawierającą tylko 0,5 ml 0,2 N roztworu HCl). Dalej postępować jak w przypadku oznaczania produktów hydrolizy (do wszystkich 6 prób) dodać: 2 ml wody destylowanej, a następnie 5 ml 0,5 M roztworu NaOH i 0,5 ml rozcieńczonego (1:1,5) odczynnika Folina-Ciocalteu. Dokładnie wymieszać i po 10 min odczytać absorbancję przy długości fali 720 nm wobec próby odniesienia/ślepej = auto zero.

Wykreślić krzywą kalibracyjną w układzie absorbancji od ilości tyrozyny (oś x - stężenie tyrozyny w ml/µmol, oś y - absorbancja).

Obliczenia

Z krzywej wzorcowej tyrozyny należy wyznaczyć równanie krzywej kalibracji y(Abs.) = ax+b. R²=korelacja, należy dodać linię trendu (w Excelu).

Od absorbancji prób badanych odjąć absorbancję próby kontrolnej i z krzywej wzorcowej odczytać zawartość tyrozyny: czyli x (stężenie tyrozyny umol/ml) = (y-b)/a).

Przy obliczaniu x (stężenie tyrozyny) należy uwzględnić rozcieńczenie i zrobić x 10 bo 10-krotne. Aktywność proteolityczną wyrazić w µmol tyrozyny/mg białka x 30 min.

Ćw. 2. Oznaczenie czystości preparatu enzymatycznego (pepsyny) metodą Lowry'ego

Odczynnik A - 2 % roztwór Na₂CO₃ w 0.1 M

Odczynnik B₁ - 1 % CuSO₄

Odczynnik B₂ - 2 % roztwór winianu sodowo-potasowego

Odczynnik C - zmieszać 0,5 ml odczynnika B₁, 0,5 ml odczynnika B₂ oraz 50 ml odczynnika A.

Odczynnik C przygotować 30 min przez oznaczeniem.

Odczynnik D - odczynnik Folina-Ciocalteu'a (1:1,5)

Roztwór pepsyny2 = roztwór pepsyny 1 rozcieńczony 100 x

Wykonanie:

Część 1. Oznaczanie zawartości pepsyny (potrzebne 4 probówki, 4 korki i 1 statyw, wykonuje 1 część osób z podgrupy 2)

Do 1 ml badanej próby (pepsyny2) dodać 5 ml odczynnika C; należy wykonać 3 powtórzenia. Po dokładnym wymieszaniu, zawartość probówek pozostawić w temperaturze pokojowej na 10 min. Następnie dodać 0,5 ml odczynnika D. Po 30 min zmierzyć absorbancję przy długości fali 660 nm wobec próby odniesienia przygotowanej w analogiczny sposób jak próby badane, z tym że w miejsce roztworu pepsyny dodać 1 ml wody.

Część 2. Przygotowanie krzywej wzorcowej albuminy: (potrzebne 6 probówek, 6 korków i 1 statyw, wykonuje 2 część osób z podgrupy 2)

Do probówek dodać kolejno 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 i 1 ml wzorcowego roztworu albuminy i uzupełnić wodą do 1 ml. Równocześnie przygotować próbę odniesienia/ślepą, która zamiast roztworu białka zawiera 1 ml wody destylowanej. Dalej postępować analogicznie jak w przypadku badanych prób: dodać 5 ml odczynnika C. Po dokładnym wymieszaniu, zawartość probówek pozostawić w temperaturze pokojowej na 10 min. Następnie dodać 0,5 ml odczynnika D. Po 30 min zmierzyć absorbancję przy długości fali 660 nm wobec próby odniesienia/ślepej.

Obliczenia:

Z krzywej wzorowej odczytać zawartość białka w rozcieńczonych próbach (było 100 krotne) (podstawić do wzoru uzyskanego z krzywej wzorcowej albuminy).

Należy obliczyć ilość białka w całej masie nierozcieńczonego roztworu pepsyny, czyli uzyskany wynik * 100.

Następnie należy określić czystość preparatu wg. wzoru: (próba/75)*100%

Oznaczanie aktywności pepsyny metodą Ansona

Metoda oznaczania aktywności pepsyny używanej podczas oznaczania zawartości azotu rozpuszczalnego po traktowaniu pepsyną w rozcieńczonym kwasie chlorowodorowym.

Zasada metody: Potraktowanie hemoglobiny roztworem pepsyny w rozcieńczonym kwasie chlorowodorowym. Strącenie niezhydrolizowanej frakcji protein kwasem trichlorooctowym. Przesączenie, a następnie dodanie wodorotlenku sodu i odczynnika Folin-Ciocalteu. Pomiar absorbancji roztworu przy długości fali 720 nm i odczyt odpowiadającej ilości tyrozyny z krzywej kalibracyjnej.

Zasada metody Ansona. Metoda ta polega na pomiarze ilości tyrozyny i tryptofanu zawartych w peptydach uwolnionych przez enzym z substratu (np. kazeina, białka soi). Peptydy te, w odrożnieniu od białek, nie ulegają wytrąceniu pod wpływem 3% kwasu trichlorooctowego. Natomiast wytrącone kwasem białka usuwa się z mieszaniny przez wirowanie lub sączenie.

Enzymatyczną hydrolizę białka (substratu) prowadzi się w pH 8,6 i temp. 37°C. Oznaczenie zawartości tyrozyny i tryptofanu w uwolnionych przez enzym peptydach wykonuje się przy użyciu odczynnika Folina. Końcowa barwa, ktorej natężenie jest wprost proporcjonalne do ilości tyrozyny i tryptofanu w probie, jest wynikiem redukcji odczynnika fosforomolibdenofosforowolframowego (odczynnik Folina) w środowisku zasadowym do błękitu fosforomolibdenowego, zachodzącej pod wpływem wymienionych aminokwasow. Stężenie barwnego produktu w próbie oznacza się mierząc pochłanianie (absorbancję) promieniowania świetlnego o długości fali 720 nm.

Miarą aktywności trypsyny będzie ilość μmoli tyrozyny zawarta w uwolnionych peptydach.

W metodzie Lowry'ego (Lowry i wsp., 1951) ilościowego oznaczania białka wykorzystuje się czułą reakcję, jaką dają wiązania peptydowe i aminokwasy aromatyczne z odczynnikiem fenolowym Folina-Ciocalteu'a.

Metoda ta składa się z 2 etapów:

- w pierwszym zachodzi reakcja biuretowa (tworzenie barwnych kompleksów przez wiązania peptydowe i Cu ²⁺ oraz redukcja jonów miedzi Cu ²⁺ do Cu ⁺ w środowisku zasadowym).

- w drugim etapie metody jony miedzi Cu ⁺ katalizują reakcję utlenienia przebiegającą głównie z udziałem tyrozyny i tryptofanu redukując odczynnik Folina-Ciocalteu, czyli kwasy: fosforomolibdenowy i fosforowolframowy do odpowiednich niebieskich tlenków. Stężenie barwnego kompleksu można mierzyć przy długości fali w zakresie od 500 do 750 nm.

Podobnie jak w innych metodach kolorymetrycznych stężenie białka odczytuje się najczęściej z krzywej wzorcowej. Przy tym dla uzyskania właściwych wyników niezmiernie ważny jest dobór białka wzorcowego do sporządzania tej krzywej. Powinno ono zawierać w cząsteczce zbliżone ilości tyrozyny i tryptofanu w stosunku do badanego białka.

Zaletą metody jest jej znaczna czułość. Można stosować ją bowiem do oznaczenia ilość białka już od 10 g w próbie, a zależność proporcjonalną między intensywnością zabarwienia roztworu, a stężeniem białka obserwuje się nawet przy większych stężeniach - do 1000 g.

Wadą metody jest błąd oznaczenia wynikający z trudności doboru odpowiedniego białka wzorcowego w odniesieniu do białka oznaczanego (np. trypsyna daje 3 razy większe natężenie barwy niż żelatyna, przy tych samych stężeniach wagowych). Inną wadą metody Lowry'ego jest zawyżanie wyników oznaczania w wyciągach niedializowanych z powodu redukcji odczynnika Folina-Ciocalteu przez wolne aminokwasy, niewielkie peptydy, fenole, nitrofenole, w mniejszym stopniu przez puryny i pirymidyny, kwas moczowy, związki zawierające mostki disiarczkowe oraz niektóre detergenty. Z kolei związki takie jak: Zn 2+ , Mg 2+ , (NH 4 ) 2 SO 4 , CCl 3 COOH, HClO 4, aceton, etanol, węglowodany, zależnie od stężenia obniżają intensywność barwy kompleksu.

Podstawy biotechnologii

Ćwiczenie 4

3

---