BIOTECHNOLOGIA 3 WYKŁAD

Dwie fazy cyklu życiowego faga

Wegetatywna, wewnątrzkomórkowa - fag jest niewykrywalny morfologicznie, wnioskujemy o jego obecności po zmianach zachodzących w komórce, zaczyna on syntetyzować związki drobnocząsteczkowe i wykorzystywać energię dla własnych celów.

Po metabolizmie bakteriofaga i to, co się dzieje z komórką bakterii można rozpoznać istnienie bakteriofaga w bakterii.

Bakteriofag w którymś momencie życia może wbudować się do DNA bakteryjnego i wówczas mówimy o fazie spoczynkowej.

Następny moment jest taki, że fag otacza się kapsydem i siedzi sobie w komórce. Kiedy wbuduje się do DNA i przejdzie w stadium profaga, dalej będzie w fazie spoczynkowej.

Odpowiedź komórki bakteryjnej:

Odpowiedź lityczna: objawia się wówczas, gdy zakażający fag przechodzi w stadium wegetatywne i namnaża się, tworząc nowe, kompletne cząstki faga. Uwalniane w czasie lizy bakteryjnej. Udowodniono, że liza jest powodowana kierowaniem komórki na drogę apoptozy

Odpowiedź lizogenną: fag zakażający nie tworzy stadium faga wegetatywnego lecz w formie profaga przechodzi w rodzaj symbiozy z komórką bakteryjną, stając się częścią jej genomu, komórka taka przekazuje profaga komórkom potomnym.

DNA przekazywane dla kolejnych komórek. W przypadku głodzenia bakterii, mogą się wyzwolić procesy wybudowywania się bakteriofaga z genomu bakteryjnego. Podobnie promieniowanie UV indukuje procesy wybudowywania się profaga z genomu bakteryjnego. Proces ten jest znany i używany w laboratorium do indukcji bakteriofaga.

Zanim bakteriofag dostanie się do komórki bakteryjnej, to musi znaleźć ją. Musi występować ścisła specyficzność między bakteriofagiem, a powierzchnią bakteryjną. NA powierzchni bakterii muszą być pola receptorowe, gdzie specyficznie przyłączają się bakteriofagi.

Bakteriofagi niespecyficzne mogą odnajdować kilka lub kilkanaście pól receptorowych.

Do takich miejsc należą pilie - wyrostki na powierzchni komórki, łączące mikroby w procesie koniugacji. Pilie płciowe są receptorem dla bakteriofagów męskich. Należą do nich -

bakteriofag f, fag MS2 - typowe przykłady bakteriofagów płciowych, które atakują pilie płciowe. Mogą atakować tylko te komórki, które te pilie zawierają (są takie komórki, które zawierają pilie, ale i takie, które ich nie zawierają). Bakterie typu męskiego są więc narażone na fagi typu płciowego. Pilie płciowe i cały system, który prowadzi do przekazania DNA od dawcy do biorcy jest zakodowany na plazmidzie F, który ma szereg genów kodujących pilie płciowe i system przenoszenia DNA od dawcy do biorcy.

Narażone bakterie są F+ i typu Hfr, które posiadają plazmid F, ale zintegrowany z chromosomem. Tak więc geny kodujące pilie płciowe są...

Pola receptorowe mogą istnieć i na powierzchni komórki bakteryjnej. Struktura ściany komórkowej u bakterii składa się z 3 zasadniczych warstw: błona zewnętrzna, przestrzeń peryplazmatyczna i błon komórkowa.

Błona zewnętrzna jest to lipopolisacharyd (LPS), który wchodzi w skład błony zewnętrznej łącznie z lipidem A. Lipid A, + rdzeń, którym jest łańcuch składający się z 5 cukrów i łańcuch polisacharydów stanowiący resztę. LPS połączony jest z białkami Omp (białka out of membrane).

Np. OmpC i F, OmpA. Białko LamB - poryna (białko przepuszczające coś do wnętrza komórki). Białka OmpC i F to główne poryny błony zewnętrznej, które stanowią strukturę złożoną z 3 podjednostek, a w środku występuje kanał hydrofilowy, przez który do komórki dostają się substancje pokarmowe (poryny niespecyficzne), sole mineralne... i antybiotyki.

Dzięki temu, że poryny te mogą przenosić drobiny o różnej wielkości, wykorzystano szereg barwników o określonej wielkości, aby stwierdzić rozmiar poryn. Działało to jak sito molekularne. LamB jest poryną dla bakteriofaga lambda. Jest to bakteriofag znany z tego, że jest bakteriofagiem transdukującym. Białko LamB jest receptorem dla tego faga i bakteriofag rozpoznaje je.

Białka OmpA nie jest poryną, ale jest receptorem dla szeregu różnych bakterii. Nie znamy funkcji tego białka, ale są to receptory dla wielu (mało istotnych dla biotechnologii) fagów.

OmpA jest receptorem dla bakteriofagów typu P. Jest to bakteriofag istotny w biotechnologii - transdukujący.

Bakteriofag Lambda jest specyficzny co do miejsca w trakcie transdukcji. W trakcie cyklu litycznego wbudowuje się za każdym razem w TO SAMO miejsce w chromosomie. W trakcie transdukcji bakteriofag przynosi DNA z okolicy miejsca, w którym się wbudowuje. Bakteriofag P jest niespecyficzny i np. fag P1 wbudowuje się w dowolne miejsce na chromosomie E. coli. Przy jego pomocy można przenosić elementy DNA od dawcy do biorcy z dowolnego miejsca w chromosomie.

Musi nastąpić nadtrawienie struktury właściwej ściany komórkowej - zbudowanej z mureiny. Musi zadziałać jakiś enzym fagowy, który rozpuści mureinę i pozwoli na dostanie się DNA do cytoplazmy. Szereg bakteriofagów produkuje po przyłączeniu się do powierzchni cały szereg enzymów: muraminidazy, których akcja polega na tym, że lizują elementy mureiny w ścianie komórkowej. Dopiero po tym rozpuszczeniu możliwe jest wstrzyknięcie DNA do wnętrza komórki. Znaną muraminidazą jest lizozym z naszych oczu. U nas jest to wstępna ochrona przeciwbakteryjna.

U bakteriofaga takie działanie nazywamy fagową strzykawką - nóżka się kurczy i DNA wstrzykiwane do środka. Cząsteczka DNA, która dostaje się do wnętrza komórki ma 2 cechy katalityczne - autokatalityczna - powstaje z niej kilkadziesiąt nowych cząstek.

Heterokatalityczna - wzorzec dla kilkuset cząsteczek białka.

Podczas cyklu rozwojowego faga przebiegają one równolegle.

Pierwsza terapia...

Bruynoghe and Maisin (1921) wyleczyli zakażoną gronkowcami skórę.

Wyizolowano gronkowca ze skóry pacjenta, po indukcji w ultrafiolecie wyindukowano bakteriofaga, który potrafił zlizować w ranie gronkowca.

Choroby leczone przez D'Herelle: czerwonka, cholera, dżuma, tyfus, infekcje skórne, choroby zwierzęce

D'Herelle nie znał jednak zjawiska zyskiwania oporności bakterii, więc leczenie nie było zawsze skuteczne.

Gruzja, biedny kraj - również stosują metody fagowe, bo nie stać ich na antybiotyki.

Wykorzystanie fagów przez lekarzy gruzińskich:

• sterylizacja pomieszczeń operacyjnych

• zakażenia powierzchniowe

• zakażenia pooparzeniowe

• infekcje jelitowe.

Nasi lekarze we Wrocławiu leczą:

• czerwonkę

• biegunkę

• zakażenie krwi

• zapalenie opon mózgowych

• owrzodzenia i zakażenia bakteryjne skóry

• infekcje pooperacyjne

• oparzenia

Wielka Brytania

MRSA (methicillin-resistant Staphylococcus aureus). Są oporne na metycylinę i większość antybiotyków. Szczepy S.aureus odpowiedzialne za główne poważne infekcje szpitalne. Fagi rosnące wewnątrz MRSA są wyjątkowo rzadkie. Naukowcy odkryli faga niszczącego komórki MRSA i opracowują technikę wprowadzania go do opatrunków, ubrań i środków czyszczących.

Profesor Mann stwierdził, że badania laboratoryjne wykazały ochronę myszy przed zakażeniem MRSA.

Firma biotechnologiczna Novolytics opracowuje technologię wykorzystania fagów w walce z MRSA.

USA

Komórki Mycobacterium znajdują się wewnątrz komórek eukariotycznych w fagosomach. Powodują trąd. Żyją w cytoplazmie... bardzo trudne działanie antybiotyków na te bakterie. Ważne jest to, by zastosować element wprowadzający bakteriofagi przeciwko patogenom wewnątrzkomórkowym.

Wirulentny szczep M. smegmatis dostarcza faga litycznego TM4 do komórek. M. avium i M.tuberculosis wewnątrz cytoplazmy komórek eukariotycznych są zabijane przez bakteriofaga.

W USA wykorzystuje się fagi przeciwko pomorom kurcząt.

Wykrycie fagów bakterii Vibrio zakażających ostrygi i powodujących zakażenia u jedzących "owoce morza".

Japonia: wykrycie i badanie faga phiME11 zakażającego S. aureus.

Exponential Biotherapies - Rockville, MD

• ukończenie pierwszej fazy prób klinicznych nad lekiem do zwalczania bakterii VRE (paciorkowców jelitowych opornych na wankomycynę), które każdego roku zabijają tysiące chorych na nowotwory i AIDS.

• Kilkanaście innych zastosowań, włączając rolnictwo (bakteriofagi do walki z Salmonella Shigella i E. coli w produktach mięsnych).

Intralytix - Baltimore. Aleksander Sulakvelidze

Vre - (paciorkowce oporne na wankomycynę). Bakteriofagi do walki z Salmonella, Shigella i E.coli w produktach mięsnych i drobiowych. Listeria, Campylobacter, współpraca z trzema grupami gruzińskimi.

Opatrunek fagowy. Wniosek o opatentowanie bandaża PhagoBioDerm nasączonego bakteriofagiem, leczącym skórę.

Biotechnologia, wykład III, strona 3

---