Politechnika Rzeszowska

Wydział Chemiczny

Katedra Biochemii i Biotechnologii

INŻYNIERIA GENETYCZNA

Opracowała:

Katarzyna Lecka - Szlachta

Rzeszów 2010

SPIS TREŚCI

REGULAMIN PRACOWNI

1. W laboratorium należy przebywać w fartuchu ochronnym; płaszcze zostawić w szatni uczelni;

2. Do wszystkich prac z mikroorganizmami należy używać jednorazowych rękawiczek ochronnych;

3. Na sali ćwiczeń nie wolno jeść, pić, palić, a także żuć gumy, długie włosy należy związać;

4. Należy ściśle przestrzegać procedur, pracować jedynie w wyznaczonych miejscach i słuchać zaleceń prowadzącego;

5. W czasie wykonywania ćwiczeń przestrzegać zasad pracy jałowej, ostrożnie obchodzić się z materiałem badanym, wszelkie czynności związane z posiewami wykonywać przy zapalonym palniku, założone hodowle dokładnie opisywać;

6. Przed rozpoczęciem pracy i po jej zakończeniu miejsce pracy przemyć dokładnie środkiem dezynfekującym (70% alkoholem etylowym);

7. Probówki i kolbki z hodowlami oraz szalki Petriego powinny być zawsze zamknięte; otwieramy je tylko na czas pobrania materiału i natychmiast zamykamy;

8. Z pracowni nie wolno wynosić na zewnątrz hodowli mikroorganizmów, preparatów, odczynników, szkła laboratoryjnego;

9. Odpady powinny być pozostawiane w miejscach oznaczonych lub wskazanych przez prowadzącego;

10. Drobny sprzęt metalowy (np. ezy, pincety) należy zarówno przed, jak i po użyciu, opalić w palniku w celu zniszczenia drobnoustrojów;

11. Wszelkie próbki mikrobiologiczne muszą być odpowiednio opisane i oznakowane;

12. Odpady (np. płynne hodowle bakteryjne) jak i drobny sprzęt plastykowy (np. ezy jednorazowego użytku) neutralizuje się płynem zabijającym bakterie, grzyby i wirusy (Domestos, Vircon) przez 30 minut;

13. Po zakończeniu pracy należy umyć ręce i uporządkować stoły, sprawdzić czy zostały zgaszone palniki spirytusowe;

ORGANIZACJA ĆWICZEŃ

Każdy zespół otrzymuje kolisty plazmid puC19 i insert

Zadaniem zespołu jest wprowadzenie i sklonowanie insertu w plazmidzie puC19 w celu późniejszego sekwencjonowania insertu

PLAN REALIZACJI:

TYDZIEŃ 1

• Trawienie enzymami restrykcyjnym: plazmidu pUC19 i inaktywacja enzymu

• Elektroforeza na agarozie o niskim punkcie topnienia (LMP, Low Melting Point)

TYDZIEŃ 2

• Odzyskanie DNA z żelu agarozowego o niskiej temperaturze topnienia.

• Oczyszczanie DNA plazmidowego

• Defosforylacja końców

• Oczyszczanie DNA plazmidowego

TYDZIEŃ 3

• Ligacja plazmidu pUC19 z insertem

• Przygotowanie komórek kompetentnych E.coli Mach 1^TH T1^R

• Przygotowanie podłoża selekcyjnego z 1% ampicyliną i X-gal

• Transformacja komórek kompetentnych

• Analiza transformantów bakteryjnych

• Kolokwium końcowe - zaliczenie ćwiczeń

Kryteria oceny

Do zaliczenia ćwiczeń wymagane jest uzyskanie pozytywnych ocen za:

• Aktywność intelektualną na zajęciach

• Działalność manualna na zajęciach

• Uzyskane wyniki

• Kolokwium zaliczeniowe

Literatura pomocnicza

• Instrukcje do ćwiczeń dostarczone przez prowadzącego

• Słomski R., (2008) Analiza DNA, Wyd. Uniwersytety Przyrodniczego w Poznaniu

• Bednarek I., (2009) Inżynieria genetyczna i terapia genowa. Zagadnienia podstawowe i aspekty praktyczne. Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach

• Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. (2001) Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press.

• Sandy B. Primrose, Richard M. Twyman, Robert W. Old (2002) Principles of Gene Manipulation. Wiley Blackwell; 6 edition

WSTEP

Klonowanie DNA oznacza namnożenie określonego odcinka DNA w komórkach gospodarza, najczęściej bakterii Escherichia coli, przy zastosowaniu odpowiedniego wektora. Techniki klonowania polegają na wprowadzeniu do komórki biorcy ściśle określonego odcinka DNA dawcy (zawierającego jeden lub kilka genów) w celu zmienienia właściwości biorcy.

Schemat klonowania przebiega w następujących etapach:

1. DNA donorowy - przeznaczony do klonowania musi być wyizolowany z komórek dawcy lub zsyntetyzowany za pomocą reakcji PCR

2. DNA donorowy i wektor poddaje się trawieniu enzymem (enzymami) restrykcyjnym, dzięki czemu powstają komplementarne do siebie końce (lepkie lub tępe).

3. Wektor i donorowy DNA (insert) zostają połączone przy udziale ligazy DNA fagaT4 (ligacja).

• Aby zapobiec cyrkularyzacji wektora, przed ligacją można usunąć grupy fosforanowe obecne na końcach 5' liniowego plazmidu, niezbędne w procesie ligacji, przy użyciu fostatazy. Po defosforylacji jedynie wektor z dołączonym insertem może ulec cyrkularyzacji.

• Reakcja defosforylacji nigdy nie zachodzi ze stuprocentową wydajnością. Po ligacji powstają trzy klasy kolistych cząsteczek:

1. odtworzony wektor bez insertu,

2. zamknięte, koliste fragmenty donorowego DNA

3. wektor z insertem (czyli plazmid zrekombinowany)

Transformacja, czyli wprowadzenie DNA do komórek bakterii.

• Bakterie muszą być kompetentne (metody chemiczne, fizyczne)

• Po transformacji bakterie wysiewa się na odpowiednie podłoże selekcyjne (selekcja opiera się na obecności w wektorze genu markerowego, który nadaje transformatom określony fenotyp, np. oporność na antybiotyk)

• Transformanty rosnące na podłożu selekcyjnym będą zawierały pusty wektor albo wektor ze wstawką.

• Zasada klonowania opiera się na założeniu, że do jednej komórki bakteryjnej wnika tylko jedna cząsteczka plazmidu.

5. Selekcja transformantów - wyszukanie pojedynczego klonu zawierającego zrekombinowany plazmid z interesującym nas fragmentem DNA

.

Rys.1. Schemat klonowania na plazmidzie

PODSTAWOWE INFORMACJE O PLAZMIDZIE I SZCZEPIE BAKTERYJNYM

PLAZMID PUC19

Wielkość 2686bp, składa się z następujących elementów genetycznych:

• Gen AMP kodujący β-laktamazę warunkującą odporność na ampicylinę

• Promotor operonu lac wraz fragmentem genu lacZ kodującym
  [Author ID1: at Mon Nov 1 13:16:00 2010 ]N-końcową część β-galaktozydazy (α-peptyd)

• Polilinker wbudowany do kodującej części genu lacZ

Rys.2. Mapa restrykcyjna plazmidu puC19 (http://www.lablife.org/vectordb)

SZCZEP BAKTERYJNY E.coli Mach 1^TH T1^R (Fφ80(lacZ)ΔM15ΔlacX74hsdR,ΔrecA1398 endA1 tonA)

F- mutacja blokująca przekazywanie plazmidu F podczas koniugacji,

lacZΔM15 - mutacja genie lac do selekcji białych/niebieskich kolonii,

hsdR - mutacja poprawiająca wydajność transformacji niemetylowanym DNA uzyskanym metodą PCR, [Author ID1: at Mon Nov 1 14:12:00 2010 ]

ΔrecA1398 - mutacja ograniczająca występowanie rekombinacji homologicznej w klonowanym DNA, [Author ID1: at Mon Nov 1 14:12:00 2010 ]

endA1- mutacja zwiększająca ilość i jakość plazmidu (mutacja w endonukleazie I) [Author ID1: at Mon Nov 1 14:13:00 2010 ]

tonA - mutacja nadająca odporność na fagi T1, T5

One Shot^® Mach1^™-T1^R Chemically Competent E. coli

IZOLACJA DNA PLAZMIDOWEGO Z E.COLI

Plazmidy są zbudowane z dwuniciowych cząsteczek DNA (dsDNA) przyjmujących trzy różne konformacje; forma kolista zrelaksowana OC (ang. Open Circle), kolista superhelikalna, superskręcona CCC (ang. Covalently Closed Circle) oraz w formie liniowej.

Istnieje szereg metod otrzymywania plazmidowego DNA, z którego każda obejmuje trzy etapy:

1. hodowla bakterii niosących plazmid (plazmidy izoluje się najczęściej z hodowli płynnych, w których podłoże uzupełnione jest odpowiednim antybiotykiem)

2. zebranie bakterii i ich liza,

3. oddzielenie plazmidowego DNA od genomowego DNA

We wszystkich metodach izolacji plazmidowego DNA wykorzystuje się dwie istotne różnice pomiędzy DNA genomowym a DNA plazmidowym bakterii:

• DNA genomowy jest wielokrotnie większy od DNA plazmidu,

• Podczas procedury izolacji DNA plazmidowego DNA genomowy zostaje trwale zniszczony, podczas gdy DNA plazmidowy pozostaje w postaci form CCC.

Izolację plazmidowego DNA należy prowadzić ze świeżych hodowli po dokładnym usunięciu medium hodowlanego. Namnażanie hodowli bakteryjnej prowadzi się do osiągnięcia późnej fazy logarytmicznego wzrostu hodowli bakteryjnej (na podstawie pomiaru gęstości optycznej OD Optical Density) przy długości fali λ = 600, W czasie wzrostu logarytmicznego dochodzi do osiągnięcia maksymalnej liczby komórek w hodowli przy jednoczesnej intensywnej replikacji plazmidów, a niskiej już replikacji DNA chromosomalnego i niskiej biosyntezie RNA.

Odwirowane komórki bakteryjne poddawane są lizie. Bakterie ulegają lizie pod wpływem niejonowych lub jonowych detergentów (SDS, sarkozyl, Triton X-100), rozpuszczalników organicznych, roztworów alkalicznych (liza alkaliczna) lub wysokiej temperatury (liza termiczna). Stosowany może być również lizozym - enzym trawiący ścianę komórkową bakterii (nie działa w pH<8.0). W metodzie lizy alkalicznej bufor o wysokim pH zawierający NaOH i SDS powoduje całkowitą lizę komórki jak również denaturację genomowego DNA, natomiast plazmidowy DNA w formie CCC zostaje zdenaturowany jedynie na niewielkich odcinkach. Po dodaniu buforu octanowego, przywracającego mieszaninie neutralne pH, tylko DNA plazmidowe ulega denaturacji i zostaje w roztworze. Genomowy DNA wraz z białkami i nierozpuszczalną solą potasową siarczanu dodecylu wytrąca się w postaci serowatego osadu.

Następny etap oczyszczania DNA polega na oddzieleniu DNA od związanych z nim białek. Zwykle stosuje się do tego celu nasycony buforem roztwór fenolu lub jego mieszaninę z chloroformem i alkoholem izoamylowym. Białka można również usunąć przez trawienie ich proteinazami (zwykle proteinazą K).

Usunięcie RNA przeprowadza się enzymatycznie, inkubując próbki z RNazą (wolną od DNazy), przez sączenie molekularne lub wirowanie w gradiencie gęstości. W metodzie lizy alkalicznej, kiedy liniowe cząsteczki DNA ulegają denaturacji, natomiast superzwinięte formy CCC plazmidu są po denaturacji nadal splecione, neutralizacja pH roztworami o wysokim stężeniu soli (np. octan amonu) prowadzi do renaturacji jedynie DNA plazmidowego, podczas gdy DNA genomowy wraz z RNA i białkami wytrąca się w postaci serowatego osadu.

Z odbiałczonych próbek DNA wytrącany jest alkoholem etylowym lub izopropanolem w obecności octanu potasowego, sodowego lub amonowego.

Po otrzymaniu plazmidowego DNA należy:

• Oznaczyć jego stężenie:

• Szacuje się w żelu agarozowym stosując jako kontrolę DNA z znanym stężeniu (najlepiej użyć kilku rozcieńczeń badanego preparatu). Dokładne stężenie DNA oznacza się spektrofotometrycznie przy długości fali λ=260nm, stosując zależność, że E₂₆₀=1,0 odpowiada stężeniu 50µg/ml

• Czystość i jakość DNA

• Stosunek E₂₆₀/E₂₈₀ powinien zawierać się w przedziale 1,8-2,0

• Aby sprawdzić czy otrzymany DNA nie ulega degradacji, przeprowadza się tzw. „samotrawienie”, polegające na tym, że próbkę DNA w buforze do trawienia pozostawia się na noc w 37C. Próbkę sprawdza się w żelu agarozowym, jako kontroli używa się tego samego DNA nie testowanego w powyższych warunkach

Przygotowanie bakterii

1. Przygotować 100ml pożywki LB. Skład: 1g trypton, 1g NaCl, 0,5g ekstrakt drożdżowy, woda destylowana do objętości 100ml. Sterylizacja w autoklawie przez 20 min. w temp. 120⁰C.

2. Bakterie inkubować w temp 37⁰C na wytrząsarce przez 16 godzin.

Przygotowanie komponentów zestawu GeneJET.

1. Dodać roztwór RNase A do roztworu Resuspension Solution.

2. Dodać 35 ml etanolu 96% do roztworu Wash Solution.

Izolacja DNA plazmidowego

1. Odwiruj 5.7ml (3 probówki po 1.9 ml) zawiesiny bakteryjnej przy 8000rpm (6800 x g) przez 2 minuty.

Wylej supernatant.

2. Dodaj do zwirowanych bakterii l (90l) Resuspension Solution. Dokładnie rozmieszaj bakterie przez worteksowanie lub pipetowanie.

Nie mogą pozostać żadne grudki bakterii!

Przenieś zawiesinę komórkową z 3 probówek przy pomocy pipety do jednej probówki 1.5 mL.

3. Dodaj l Lysis Solution, zamieszaj DELIKATNIE, STARANNIE obracając probówkę 4-6 razy.

NIE WORTEKSUJ!

Liza nie może trwać dłużej niż 5 min!

4. Dodaj 350l Neutralization Solution i NATYCHMIAST wymieszaj odwracając probówkę 4-6 razy.

5. Wiruj przez 5 min. przy 14000rpm.

6. Za pomocą pipety przenieś supernatant do kolumienki z zestawu.

7. Wiruj przez 1 min. przy 14000rpm.

8. Wyjmij kolumienkę z probówki, wylej przefiltrowany płyn i umieść kolumienkę z powrotem w probówce.

9. Dodaj do kolumienki 500 l Wash Solution.

10. Wiruj przez 1 min. przy 14000rpm.

11. Wyjmij kolumienkę z probówki, wylej przesącz, włóż kolumienkę z powrotem do probówki.

12. Dodaj do kolumienki 500 l Wash Solution.

13. Wiruj przez 1 min. przy 14000rpm.

14. Przenieś kolumienkę do nowej probówki 1,5ml.

15. Dodaj 50 l Elution Buffer do kolumienki, na środek membrany. Odczekaj 2 min.

16. Wiruj przez 2 min. przy 14000rpm

17. Dodaj 50 l Elution Buffer do kolumienki, na środek membrany. Odczekaj 2 min.

18. Wiruj przez 2 min. przy 14000rpm

19. Odłóż kolumienkę do czyszczenia złoża.

20. Uzyskane plazmidowe DNA przechowuj w -20⁰C.

Materiały i aparatura

• pożywka LB (1000ml: 10g trypton, 10g NaCl, 5g ekstrakt drożdżowy),

• zestaw GeneJET Plazmid Miniprep Kit firmy Fermentas Life Sciences

• Roztwór RNase A dodać do roztworu Resuspension Solution.

• 35ml etanolu 96% dodać do roztworu Wash Solution

• Lysis Solution

• Neutralization Solution

• Elution Buffer

• probówki typu eppendorf

• kolumienki miniprep

• autoklaw

• wytrząsarka wodna nastawiona na 37˚C

• wirówka

• pipety automatyczne

ENZYMY RESTRYKCYJNE

Enzymy restrykcyjne (ang. restriction enzymes) są enzymami izolowanymi z bakterii (pełnia tu funkcje obrony przed obcym DNA - np., wirusami), zdolnymi do rozpoznawania specyficznych sekwencji i przecinania fosfodwuestrowego wiązania cząsteczki DNA.

Istnieją cztery podstawowe typy enzymów restrykcyjnych (I-IV):

Typ I - białka złożone z wielu podjednostek, które działają jako pojedynczy kompleks białkowy i zwykle składają się z dwóch podjednostek R, dwóch podjednostek M i jednej podjednostki S. Po zlokalizowaniu swojego miejsca restrykcyjnego służą jako motory molekularne przemieszczające DNA do momentu zderzenia powodującego trawienie. Uzyskiwane fragmenty są zwykle losowe.

Typ II - zazwyczaj zawiera pojedyncze enzymy restrykcyjne i enzymy modyfikujące kodowane przez oddzielne geny. Enzymy II typu zwykle rozpoznają określone sekwencje DNA i tną je w stałych pozycjach w obrębie lub w pobliżu rozpoznawanej sekwencji tworząc grupy 5-fosforanowe i 3-hydroksylowe. Zazwyczaj wymagają jonów Mg²⁺ jako kofaktorów. Metylotransferazy zwykle uznają tej same sekwencje, chociaż niektóre są mniej specyficzne. Trzy rodzaje metylotransferaz DNA tworzące C5-metylcytozynę, N4-metylcytozynę lub N6-methyladenine zaliczono do typu II.

Typ III - systemy składające się z dwóch genów (mod i res) kodujących podjednostki białkowe funkcjonujące biorące udział w rozpoznawaniu DNA i modyfikacji (Mod) lub trawieniu (Res). Obie podjednostki są wymagane do trawienia. Do cięcia DNA, enzym musi współdziałać z dwoma kopiami niepalindromowych sekwencji rozpoznawanych i miejsca muszą być w odwrotnej orientacji w cząsteczce DNA. Trawienie jest poprzedzone translokacją DNA zależną od ATP jak w przypadku enzymów I typu. Enzymy tną w określonej odległości od jednej z dwóch kopii rozpoznawanej sekwencji. Podjednostka Mod może funkcjonować niezależnie od podjednostki Res w celu metylowania DNA: we wszystkich znanych przypadkach powstaje N6-metyladenina i pełna modyfikacji polega na hemimetylacji.

Typ IV

Systemy te składają się z jednego lub dwóch genów kodujących białka, które tną tylko modyfikowane DNA - metylowane, hydroksymetylowane i glukozylo-hydroksymetylowane zasady. Ich sekwencje rozpoznawcze przeważnie nie zostały dobrze określone.

Endonukleazy typu II to enzymy tnące dwuniciowe DNA w obrębie lub w określonym miejscu w pobliżu rozpoznawanej sekwencji nukleotydowej. Rozpoznawane sekwencje są palindromowe (posiadające oś symetrii) i obejmują zwykle sekwencje cztero- lub sześcionukleotydowe (tzw. enzymy czwórkowe lub szóstkowe), (znane są tez enzymy rozpoznające sekwencje 5,7,8 nukleotydowe).

Miejsce cięcia przez enzym restrykcyjny obu nici DNA może znajdować się na naprzeciwko siebie i wówczas powstają tzw. "tępe końce", np. enzym HaeIII z Haemophilus aegypticus rozpoznaje i przecina następującą sekwencję:

5' GGCC 3'

3' CCGG 5'

w wyniku czego powstają "tępe końce":

5' GG CC 3'

3' CC GG 5'

Z kolei enzym EcoRI ze szczepu E.coli RY13 rozpoznaje sześcionukleotydową sekwencję:

5' GAATTC 3'

3' CTTAAG 5'

przecinając obie nici DNA tak, że powstają tzw. "lepkie końce" w postaci jednoniciowych czteronukleotydowych końców 5':

5' G AATTC 3'

3' CTTAA G 5'

Niektóre enzymy produkują "lepkie końce" 3'. Wszystkie natomiast pozostawiają grupę fosforanową na końcu 5', a grupę hydroksylową na końcu 3'.

"Lepkie końce" mają duże znaczenie przy klonowaniu genów: sekwencje "lepkich końców" powstałych w wyniku działania tego samego enzymu są komplementarne. W obecności enzymu ligazy można takie cząsteczki ponownie połączyć ze sobą kowalencyjnie.

Podstawową cechą produktów trawienia DNA enzymami restrykcyjnymi jest to, że otrzymywane fragmenty DNA dają się rozdzielić na żelach w taki sposób, że w każdym prążku na żelu znajdują się cząsteczki DNA o identycznej sekwencji nukleotydowej. Analizując na żelach produkty trawienia danego DNA różnymi enzymami restrykcyjnymi, stosowanymi pojedynczo i w kombinacjach, można ustalić wzajemne położenie i odległości pomiędzy sekwencjami rozpoznawanymi przez te enzymy. Oprócz tego, DNA pocięty enzymami restrykcyjnymi można poddawać ligacji z wektorem i tworzyć zrekombinowane (zawierające sklonowany DNA) plazmidy.

Kilka praktycznych rad o pracy z enzymami restrykcyjnymi

1. Enzymy restrykcyjne są bardzo drogie, a przy tym nietrwałe.

2. Enzymy restrykcyjne dostarczane są przez producenta w 50% glicerolu. Transportowane są na suchym lodzie i przechowywane w -20°C.

3. Enzymy dostarczane są zwykle w stężeniu 10U/µl

4. Przed pobraniem enzymu z probówki dobrze jest go krótko zwirować. Enzymu zwykle dodaje się kilka µl i probówka początkowo może wydawać się pusta.

5. Jedna jednostka aktywności jest to taka ilość enzymu, która w warunkach optymalnych dla danego enzymu, w ciągu 1 godziny trawi całkowicie 1µg odpowiedniego substratu.

6. Rozcieńczone enzymy szybko tracą swoje własności, jednorazowo należy rozcieńczać tylko tyle enzymu ile od razu zużyjemy.

7. Trawienie DNA przeprowadza się w jak najmniejszej objętości mieszaniny restrykcyjnej o składzie: Roztwór DNA, enzym, bufor, woda (ilość poszczególnych składników określają następujące reguły):

• Ilość DNA - od 0,1 do 1µg (mniejsze ilości nie będą widoczne na żelu, większe nie rozdzielą się),

• Ilość enzymu należy dobrać do ilości DNA,

• Optymalny bufor zwykle dostarczany jest przez producenta wraz z enzymem jako roztwór dziesięciokrotnie stężony,

• Woda stanowi dopełnienie do wymaganej objętości i musi być o najwyższym stopniu czystości,

• Mieszaninę reakcyjną inkubuje się w temperaturze ok. 30/37°C przez 2 godziny (ze względu na skraplanie się pary wodnej na zimniej pokrywce próbówki, lepiej przeprowadzać dłuższe inkubacje w cieplarce, a nie łaźni wodnej lub użyć oleju mineralnego).

• Jeżeli po restrykcji w następnym etapie ma być użyta ligaza lub polimeraza, konieczne jest całkowite inaktywowanie enzymu restrykcyjnego (najczęściej w tym celu dodaje się EDTA, a następnie ogrzewa w temperaturze 60°C przez 10 minut - są enzymy oporne na ten rodzaj inaktywacji (BamHI i HindIII) wtedy stosuje się ekstrakcje fenolem.

Kiedy enzym nie chce ciąć

Zdarzają się sytuacje, kiedy to mimo poprawnego doboru enzymu restrykcyjnego, buforu i temperatury, trawienie DNA nie zachodzi. Może to być spowodowane zanieczyszczeniem DNA (oczyszczamy fenolem) lub jego metylacją. METYLAZY DNA są to enzymy z grupy transferaz modyfikujące zasady azotowe w łańcuchu DNA poprzez przyłączenie do nich grupy metylowej. Metylazy DNA są związane ze zjawiskiem restrykcji u Procariota (ochrona własnego DNA).

• Dam metylaza - dodaje grupę metylową do adeniny w sekwencji GATC, powstającą sekwencję oznacza się jako GmATC.

• Dcm metylaza - dodaje grupę metylową do wewnętrznej cytozyny w sekwencji CC(A/T)GG, powstaje sekwencja CmC(A/T)GG

DNA z dodatkowymi grupami metylowymi przestaje być substratem rozpoznawanym przez enzymy restrykcyjne, np., enzym BclI rozpoznaje i rozcina sekwencje TGATCA, ale nie TGmATCA, zaś EcoRII rozpoznaje i tnie sekwencje CC(A/T)GG, ale nie CmC(A/T)GG. Aby ominąć problemy wynikające z metyzacji DNA, należy namnożyć plazmid w szczepie E.coli dam- lub E.coli dcm- (oba te szczepy są mutantami nie wytwarzającymi metylaz).

Trawienie enzymami restrykcyjnymi - część praktyczna

UWAGA: Rozmrozić na lodzie plazmidy, enzymy restrykcyjne, bufor. przed dodaniem krótko zwirować

1. Do 0,5ml probówki typu ependorff dodać:

• bufor Tango 10x - 10μl

• enzym SmaI - 2μl

• DNA plazmidowe - 88μl

• Olej mineralny - 1 kropla

• Mieszaninę reakcyjną inkubować w 30°C przez 2godziny (lub dłużej)

• Inaktywacja enzymu - mieszaninę reakcyjną przenieść do 65°C na 20minut

• Jeżeli produkty trawienia maja być analizowane elektroforetycznie, po zakończeniu inkubacji do mieszaniny restrykcyjnej dodaje się 1/10 objętości barwnika obciążającego, całość dokładnie miesza się i nanosi na żel.

Materiały i aparatura

• bufor Tango 10xl

• enzym SmaI

• DNA plazmidowe

• olej mineralny

• probówki typu ependorff

• łaźnia wodna nastawiona na 30°C i 65°C

• wirówka

• pipety

ELEKTROFOREZA DNA

UWAGA:

PRACA Z BROMKIEM ETYDYNY, STOSOWAĆ ŚRODKI OCHRONY INDYWIDUALNEJ

Najbardziej popularnymi technikami rozdziałów makrocząsteczek stałych są techniki elektroforetyczne, pozwalające osiągnąć wysoki poziom rozdzielczości. Elektroforeza jest zjawiskiem elektrokinetycznym, w którym pod wpływem przyłożonego pola elektrycznego przemieszczają się makrocząsteczki obdarzone nierównoważonym ładunkiem elektrycznym. Prędkość migracji zależy od wielkości, kształtu, ładunku cząsteczki oraz ruchów środowiska. Zdolność rozdzielcza żelu zależy od stężenia agarozy, determinującego wielkość porów w żelu. Standardowo stosuje się żele 1%. Do rozdziału cząsteczek mniejszych (0.5-2.0 kb) używa się żeli bardziej stężonych 1,4-2%, a do rozdziału cząsteczek większych (10-20 kb i większych) żeli o stężeniu mniejszym, 0,5- 0,7%. Podczas elektroforezy w żelach agarozowych następuje również rozdział cząsteczek o tej samej wielkości, lecz różniących się kształtem np. rozdział trzech różnych form plazmidu (CCC, liniowej, OC). Elektroforeza musi być przeprowadzana w odpowiednim buforze. Najczęściej stosowanym buforem jest TAE (Tris-octan, EDTA) lub TBE (Tris-boran, EDTA). Przed naniesieniem na żel próbki zawiesza się w buforze zawierającym „obciążacz” (glicerol, Ficoll lub sacharoza) oraz barwnik umożliwiający śledzenie przebiegu elektroforezy (Xylene cyanol niebieski, fioletowy Bromophenol blue lub pomarańczowy Orange G). DNA w żelu można uwidocznić dzięki barwieniu związkiem interkalującym - bromkiem etydyny, który fluoryzuje w świetle UV.

Przygotowywanie żelu agarozowego

Objętość żelu:	100 ml	150 ml	200 ml	300 ml
Ilość agarozy na żel 1.5%	1.5 g	2.25	3.0 g	4.5 g
Ilość agarozy na żel 3.0%	3.0 g	4.5	6.0 g	9.0 g
Ilość buforu TBE 1X	do 100 ml	do 150 ml	do 200 ml	do 300 ml
Ilość roztworu EtBr 1%	2 μL	3 μL	4 μL	6 μL

1. Odważyć w zlewce odpowiednią ilość agarozy.

2. Zalać buforem TBE 1X do odpowiedniej objętości.

3. Rozmieszać agarozę na mieszadle magnetycznym do uzyskania jednorodnego roztworu bez bryłek agarozy.

4. Przykryć zlewkę lub kolbkę folią plastykową odporną na działanie mikrofali.

5. Podgrzać w mikrofalówce do zagotowania.

UWAGA: Roztwór nie może wykipieć z naczynia. Gotować i przenosić ostrożnie. Po zagotowaniu używać do przenoszenia chwytaka; Nie wstrząsać gwałtownie! Grozi poparzeniem!

6. Schłodzić roztwór agarozy w zlewce z zimną wodą na mieszadle magnetycznym pod przykryciem.

7. Po W tym czasie przygotować stanowisko do wylania żelu.

8. Po wystygnięciu roztworu do temperatury 60°C dodać do niego POD WYCIĄGIEM bromku etydyny z zachowaniem szczególnych środków ostrożności.

UWAGA: końcówkę po dodaniu EtBr należy wrzucić do specjalnego zamykanego pojemnika na odpady niebezpieczne. Po dodaniu bromku naczynie przykryć szczelnie folią i wymieszać na mieszadle magnetycznym.

9. Wylać żel do przygotowanego korytka, przed zastygnięciem umieścić w żelu grzebień na odpowiedniej głębokości, aby uzyskać studzienki. Umyć na świeżo zlewkę i mieszadło.

Przygotowywanie próbek

1. Do 2μl analizowanego DNA dodać 3,5μl barwnika do ładowania i 5μl wody.

• Próbki nanosi się do kieszonek żelu (NIE OBOK) za pomocą pipety automatycznej; należy uważać, aby do końcówki pipety nie pobrać razem z próbką pęcherzyków powietrza.

• Ilość DNA w próbce, którą należy nanieść do jednej kieszonki, zależy od ilości fragmentów i ich wielkości.

Minimalna ilość DNA, którą widać na żelu w postaci prążka, wynosi 20ng. Ilość DNA w prążku nie powinna przekraczać 200ng, w przeciwnym wypadku obserwuje się przeładowanie kieszonki.

Elektroforeza

1. Aparat należy podłączyć do zasilacza pamiętając, że DNA migruje w kierunku katody (elektrody dodatniej).

Wielkość napięcia zależy od oczekiwanego czasu elektroforezy i wielkości żelu. Najczęściej stosuje się napięcie 5-7V/cm długości żelu. Na ogół lepszy rozdział uzyskuje się przy niższym napięciu. Zbyt duże napięcie może spowodować przegrzanie żelu.

2. Nanieść do studzienek wcześniej przygotowane próbki

3. Po skończonej elektroforezie żel wyjmuje się z aparatu (RĘKAWICZKI!), a następnie ogląda i fotografuje w świetle UV na transiluminatorze.

UWAGA: Należy przestrzegać zasad pracy z transiluminatorem.

Światło UV jest szkodliwe dla oczu i skóry.

UWAGA: Żel można użyć powtórnie - po skończonej elektroforezie żel przenieść do kolby i zalać buforem TBE 1X, przykryć szczelnie folią, przed zagotowaniem wylać bufor; dalej postępować tak jak w przypadku nowego żelu

Materiały i aparatura

• Agaroza

• Bufor TBE 10x (1000ml: Tris 108g, kwas borowy 55g, EDTA 9,3g, pH=8,3)

• Bromek etydyny1%

• Woda

• Barwnik do nanoszenia na żel

• Marker masy

• Waga

• Mieszadło magnetyczne

• Mikrofalówka

• Trans iluminator

• Zasilacz

• Aparat do elektroforezy

• Szkło laboratoryjne (zlewka)

• Pipety automatyczne

• Folia plastikowa

ELEKTROFOREZA LMP I

ODZYSKANIE DNA Z ŻELU AGAROZOWEGO

Istnieje wiele sposobów izolowania fragmentów DNA z żeli agarozowych najczęściej stosowane metody to:

• odwirowanie agarozy w odpowiednich warunkach, zebranie wydzielonego płynu i wytrącenie DNA etanolem (odmianą tej metody jest tzw. „freeze squeeze", zamrożenie i rozmrożenie kawałka agarozy z fragmentem DNA przed wirowaniem),

• elektroelucja DNA poprzez poddawanie elektroforezie kawałka agarozy umieszczonego w woreczku dializacyjnym

• zastosowanie agarazy, czyli enzymu rozkładającego agarozę

• zastosowanie jednego z wielu dostępnych handlowo złóż wiążących DNA

Fragmenty DNA mogą być izolowane zarówno z żeli agarozowych jak i poliakryloamidowych. Do elucji DNA z żeli agarozowych mogą być wykorzystywane agarozy o normalnej temperaturze topnienia lub agarozy niskotopliwe. Agarozy niskotopliwe (ang. Low Melting Piont), dzięki wstawieniu grup hydroksyetylowych w łańcuchu polisacharydowym agarozy, polimeryzują w temp. ok. +29°C i depolimeryzują w temp. +65°C, czyli poniżej temperatury topnienia DNA. Dzięki temu wycięty fragment agarozy, zawierający daną frakcję DNA, można stopić termicznie, a następnie oddzielić od niego DNA, np. na drodze ekstrakcji fenolowej. W celu oddzielenia DNA od roztopionej agarozy można również stosować zamrażanie w -80°C. Po rozmrożeniu preparatu, wytrącona agaroza zostaje odwirowana do osadu a uwolniony DNA pozostaje w supernatancie. Niektóre typy agaroz niskotopliwych, o wysokiej czystości, umożliwiają przeprowadzanie reakcji enzymatycznej bezpośrednio w roztopionym żelu. Wadą żeli wykonanych z niskotopliwej agarozy jest ich niższa rozdzielczość w porównaniu do rozdziałów elektroforetycznych przeprowadzonych w normalnych agarozach.

Elektroforeza w agarozie LM - niskiego punktu topnienia - część praktyczna

1. Przygotować żel o (1%) właściwym stężeniu niskotopliwej agarozy w buforze 0,5 x TBE (0,3g agarozy /30ml TBE)

UWAGA: Elektroforezę należy wykonywać bez bromku etydyny, który działa niszcząco na DNA migrujące w żelu. Po zakończeniu elektroforezy żel barwi się przez 3 do 5 minut w roztworze bromku etydyny o stężeniu 0,5μg/ml

2. Schłodzić żel do temperatury pokojowej.

3. Zmieszać próbki DNA z buforem do ładowania, załadować do studzienek w żelu i przeprowadzić elektroforezę przy 3-6 V/cm.

UWAGA: Należy unikać przeładowania żelu powodującego rozmycie prążka DNA (rozmyty prążek zajmuje duża objętość agarozy co jest niekorzystne w dalszych etapach).

UWAGA: W żelach z niskotopliwej agarozy DNA o określonym rozmiarze migruje nieco szybciej niż w żelach ze standardowej agarozy. Z tego powodu należy zastosować niższe napięcie.

4. Wybarwić żel bromkiem etydyny, jeśli potrzeba, i zlokalizować DNA przy pomocy lampy UV o długości fali 302 nm.

UWAGA: Czas naświetlania żelu promieniowaniem UV powinien być jak najkrótszy (nie powinien trwać dłużej niż 1 minutę). Jeśli to możliwe pracować przy obniżonej mocy lampy i długości fali 300nm lub więcej. Zbyt długa ekspozycja i krótkie UV powoduje pękanie i (lub) dimeryzację DNA co obniża wydajność reakcji enzymatycznych z jego udziałem.

Należy zminimalizować czas ekspozycji do kilku/dziesięciu sekund lub trzymać żel na plastikowej płytce, kiedy jest w transiluminatorze.

Odzyskanie DNA z agarozy LMP

1. Wyciąć kawałek agarozy (sterylnym skalpelem) zawierający interesujący nas prążek DNA i przenieść do wcześniej zważonej probówki typu ependorff (większe kawałki agary niż 200mg delikatnie pociąć na mniejsze),

UWAGA: Wyciąć tylko tyle agarozy, ile jest konieczne do odzyskania prążka, wycięty fragment agarozy może być przechowywany przed dłuższy czas w temperaturze 4°C bez dostępu światła

2. Po wycięciu prążka sfotografować żel, aby zarejestrować, który prążek został wycięty.

3. Inkubować 10 minut w 70°C, aż agaroza będzie całkowicie stopiona.

UWAGA: Jeśli agaroza nie jest całkowicie stopiona, trawienie też będzie niekompletne.

UWAGA: Przy topieniu agarozy zawierającej DNA nie wolno przekraczać temp. 70˚C (wyższa temp denaturuje DNA)

4. Przenieś probówkę do łaźni w 42°C na 5 minut

5. Dodać agarazę wolną od DNaz, używając 1U agarazy na 100mg 1% agarozy - wymieszać delikatnie i inkubowac 30 min w 42°C

UWAGA: W tym czasie agaroza jest trawiona do oligo- i disacharydów. Jeśli potrzeba, na tym etapie roztwór DNA może być użyty bezpośrednio do ligacji, trawienia enzymami restrykcyjnymi i transformacji

UWAGA: Jeżeli używamy wyższe stężenie agarozy odpowiednio należy przeliczyc ilość dodawanej agarazy.

Oczyszczanie DNA

• Fragmenty większe niż 30kb - żwirować 15000g 10 minut i oczyszczać przez dializę

• Fragmenty mniejsze niż 30kb

1. Dodać octanu amonu do stężenia 2,5 mM, schłodzić na lodzie przez 5 minut.

2. Wirować 10000 rpm, 10 minut. Przenieść supernatant do czystej probówki.

3. Dodać 2-3 objętości etanolu lub 0,8 objętości izopropanolu, łagodnie zamieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez godzinę. Jeśli fragmenty DNA są mniejsze niż 500bp lub stężenie DNA jest niższe niż 0,05 ug/ml, inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.

4. Wirować 10000 rpm, 15 minut, usunąć supernatant i wysuszyć pellet. Może on być zawieszony w TE lub buforze właściwym do dalszych manipulacji.

Materiały i aparatura

• TBE 0,5x

• Agaroza LM

• Aparat do elektororezy

• Bufor do ładowania

• Bromek etydyny (kuwetka, folia aluminiowa)

• Agaraza

• Octan amonu

• izopropanol

• Wirówka

• Transilumintor

• Czysty skalpel wolny od Dnaz

• Łażnia wodna (70°C i 45°C)

DEFOSFORYLACJA KOŃCÓW

W obecności ligazy liniowa forma wektora, uzyskana działaniem enzymu restrykcyjnego, ma większą zdolność do odtworzenia swojej pierwotnej postaci niż do połączenia się z inną cząsteczką DNA. Aby zapobiec temu zjawisku (autoligacji) na rozcięty wektor działa się alkaliczną fosfatazą usuwającą grupy fosforanowe z 5' końca DNA i RNA. Dla zapewnienia optymalnych warunków w miejsce buforu dla enzymu restrykcyjnego wprowadza się bufor dla fosfatazy.

Typy fosfataz:

• Bacterial alkaline phosphatase (BAP) najaktywniejsza z fosfataz, najtrudniejsza do zniszczenia po zakończeniu reakcji,

• Calf intestinal alkaline phosphatase (CIP) mniej aktywna od BAP, niszczy ją trawienie proteazą i temperatura 75˚C przez 10 minut w obecności 5 mM EDTA,

• Shrimp alkaline phosphatase (SAP) z krewetek żyjących w zimnych wodach, łatwo ulega destrukcji w podwyższonej temperaturze (65˚C przez 15 minut).

Część praktyczna

1. Dodać 7µl linowego DNA, 2µl 10x buforu SAP, 1ul SAP (1U/1µg DNA/1µl), 10µl wody MQ. Dokładnie wymieszać

Próbę inkubować w 37°C przez 30 minut,

2. Zatrzymać reakcje inkubując mix w 65°C przez 15 minut

UWAGA: Po defosforylacji konieczne jest ponowne oczyszczenie DNA w celu usunięcia fosfatazy i jej buforu - oczyszczać octanem amonu i izopropanolem

Materiały i aparatura

• linowe DNA

• woda MQ

• SAP i 10x bufor

• łaźnia wodna nastawiona na 37°C i 65°C

LIGACJA

Ligazy DNA są enzymami tworzącymi wiązania kowalencyjne fosfodwuestrowe między grupą 3'OH deoksyrybozy i grupą fosforanową (5'P) przy wykorzystaniu energii z hydrolizy ATP. Najczęściej stosowanym enzymem do przeprowadzenia tej reakcji jest ligaza faga T4. Istotnym parametrem ligacji jest stosunek molowy DNA donorowego do wektorowego (proporcję molowa 2:1). Stężenie wektora w próbce powinno wynosić 0,02-0,05 µg/µl (przy stężeniu 0,01-0,02 µg/µl plazmid zamyka się, stężenie 0,3-0,5 µg/µl sprzyja zaś tworzeniu konkatamerów). Reakcję ligacji prowadza się w niskiej temperaturze [Author ID1: at Mon Nov 1 16:52:00 2010 ](14-16°C). Sprzyja ona powstawaniu wiązań wodorowych pomiędzy lepkimi końcami fragmentów DNA. W przypadku łączenia fragmentów DNA z tępymi końcami konieczne jest stworzenie warunków zwiększających prawdopodobieństwo ich zetknięcia przez: dodanie glikolu polietylenowego (PEG) do buforu ligacyjnego, wydłużenie czasu ligacji lub dodanie więcej jednostek enzymu.

Część praktyczna

1. W probówce typu ependorff należy przygotować mieszaninę: 5 µl wektor liniowy, 15,5 µl insertu, 2,5 µl buforu do ligacji, 2 µl ligazy.

2. Mieszaninę reakcyjną inkubować przez 20 minut w 22°C.

3. Inaktywować ligazę przez ogrzanie próbki w 65°C przez 10 minut.

4. Użyć bezpośrednio do transformacji komórek bakteryjnych.

Materiały i aparatura

• Do mieszaniny reakcyjnej: bufor do ligacji, ligaza,

• Probówki typu ependorff,

• Pipety automatyczne

• Termocykler nastawiony na 22°C i 65°C

• Lód

TRANSFORMACJA KOMÓREK BAKTERYJNYCH

Transformacja jest to proces aktywnego pobierania DNA (zwykle plazmidowego) z podłoża przez organizmy jednokomórkowe, najczęściej bakterie i drożdże. Stan, w którym komórka posiada zdolność do pobrania obcego DNA nazywany jest kompetencją. Komórki bakterii w pewnych warunkach fizjologicznych osiągają tzw. stan kompetencji i są zdolne do pobierania DNA. U niektórych drobnoustrojów stan kompetencji występuje naturalnie na określonych etapach wzrostu i jest jednym z elementów naturalnego systemu transformacji i rekombinacji materiału genetycznego. Przykładem naturalnej zdolności do transformacji są gram-dodatnie komórki bakterii Streptococcus, które stają się kompetentne przy osiągnięciu gęstości komórek pomiędzy 10⁷ a 10⁸. U innych bakterii, gram-ujemnych Haemophilus influenzae, następuje indukcja stanu kompetencji podczas głodzenia komórek, o ile w tym stadium nie zostaje zaburzony system syntezy białek. Podobnie u Azotobacter, można mówić o naturalnym stanie kompetencji, gdy hodowla bakterii osiągnie stacjonarną fazę wzrostu. Kompetencja nie występuje u wszystkich drobnoustrojów w sposób naturalny, brak jej np. u E. coli.

U innych bakterii stan kompetencji uzyskuje się między innymi po potraktowaniu jonami Ca²⁺, Rb²⁺, K⁺, Mn²⁺ lub związków LiCl, glutaminian litu w niskiej temperaturze, a następnie poddaniu szokowi cieplnemu (w temp.37˚C-42˚C). Pobieranie DNA zachodzi w temp bliskiej 0˚C w której następuje krystalizacja błon komórkowych co prowadzi do powstawania porów, dzięki nim DNA wnika do wnętrza komórki. Chlorek wapnia tworzą kompleksy z DNA równoważąc ładunek ujemny grup fosforanowych DNA i fosfolipidów w efekcie wpływa jedynie na przyłączenie DNA do powierzchni komórek. Transfer do wnętrza komórki stymulowany jest przez podniesienie temperatury do 42˚C/2minut

Transformację bakterii przeprowadza się w trzy etapach:

• przygotowanie komórek kompetentnych,

• transformacja komórek kompetentnych,

• selekcja transformantów

Transformacja E. coli zachodzi z niską częstością i zależy od rodzaju DNA: najwyższą wydajność uzyskuje się dla DNA plazmidowego w formie CCC, niższą dla formy OC, a najniższą dla formy liniowej. Najczęściej do jednej komórki bakteryjnej wnika tylko jedna cząsteczka DNA. Wydajność transformacji w przypadku E. coli zależy od formy DNA: najwyższa dla formy CCC, niższa dla OC a najniższa dla formy liniowej. Do komórki bakterii wnika najczęściej tylko jedna cząsteczka DNA, o czym warto pamiętać w przypadku przeprowadzania transformacji mieszaniną różnych cząsteczek DNA.

Odmianą transformacji jest elektrotransformacja (elektroporacja) wykorzystywana w przypadku bakterii, które nie uzyskują stanu kompetencji pod wpływem czynników chemicznych lub gdy wydajność procesu transformacji jest niska. W tej metodzie mieszaninę DNA i bakterii poddaje się krótkiemu (5 -10 msec) pulsowi prądu elektrycznego o napięciu rzędu 2,5 kV. Przygotowanie bakterii elektrokompetentnych jest prostsze niż w przypadku transformacji chemicznej. Po wyhodowaniu bakterii do fazy logarytmicznej, schładza się je, przemywa intensywnie wodą w celu zmniejszenia siły jonowej zawiesiny, a następnie zawiesza w zimnym buforze zawierającym 10% glicerol. Proces jest zależny od temperatury i najlepiej przeprowadzać go w temp. 0-4°C. Wydajność spada 100-krotnie w temperaturze pokojowej. Elektroporację przeprowadza się przy małym stężeniu DNA (ok. 10 pg/ml), aby zminimalizować pobieranie przez komórkę więcej niż jednej cząsteczki DNA.

Ukompetentnianie komórek E.coli

1. Wybrać pojedynczą kolonię bakterii o średnicy 2-3mm z płytki, która była inkubowana 16-20 godzin w temperaturze 37°C. Przenieść kolonię do 100ml pożywki LB w 250ml kolby.

Inkubować przez 3 godziny w 37°C z energicznym wytrząsaniem, monitorując wzrost kultury (przez mierzenie OD600 = 0,4).

2. Przenieść bakterie do sterylnych jednorazowych schłodzonych 50-ml falkonów. Ochłodzić do 0°C, trzymając na lodzie przez 10 minut.

3. Wirować 4100 rpm (~2700g) 10 minut w temperaturze 4°C.

4. Odlać supernatant.

5. Zawiesić bakterie w 30 ml zimnego roztworu MgCl₂-CaCl₂ przez kołysanie lub łagodne worteksowanie.

6. Wirować 4100 rpm (~2700g) 10 minut w temperaturze 4°C.

7. Odlać supernatant.

8. Bakterie z każdej 50 ml oryginalnej kultury zawiesić w 2 ml zimnego roztworu 0,1M CaCl₂ przez kołysanie lub łagodne worteksowanie (należy użyć schłodzonych tipsów).

9. Użyć komórek bezpośrednio do transformacji lub przygotować stoki glicerynowe do długiego przechowywania.

Komórki kompetentne mogą być przechowywane w roztworze CaCl₂ przez 24-48 godziny. Wydajność transformacji wzrasta 4- 6-krotnie przez pierwsze 12-24 godziny przechowywania, a potem obniża się do początkowego poziomu. Komórki kompetentne mogą być przechowywane w -70°C, chociaż może nastąpić pewne pogorszenie wydajności transformacji podczas długotrwałego przechowywania.

Stoki glicerynowe - do 2ml kompetentnych bakterii dodać 0,6ml schłodzonego 60% glicerolu (sterylnego), równomiernie rozprowadzić glicerol i zamrozić kulturę w ciekłym azocie i przenieść do -80°C

Transformacja E.coli

1. Przenieść po 50ul zawiesiny komórek kompetentnych do sterylnej, schłodzonej probówki eppendorfa, używając schłodzonych tipsów i dodać 5μl zligowanego z insertem DNA. Zamieszać zawartość przez łagodne kołysanie.

2. Inkubować na lodzie przez 30 minut.

3. Przenieść do łaźni wodnej ogrzanej do 42°C.

Inkubować dokładnie przez 30 sekund. Nie wytrząsać.

4. Szybko przenieść na lód i inkubować przez 2 minuty.

5. Dodać 250 ul pożywki SOC do każdej probówki.

Inkubować przez 60 minut w łaźni wodnej w temperaturze 37°C, aby pozwolić bakteriom "wydobrzeć" i wyprodukować kodowany przez plazmid marker odporności na antybiotyk.

6. Przenieść 100ul transformowanych komórek kompetentnych na podgrzaną godzinę wcześniej płytkę Petriego z pożywką agarową LB zawierającą 100ug/ml ampicyliny i 2% X-Gal.

Kiedy sprawdza się odporność na ampicylinę, komórki po transformacji powinny być rozprowadzone z małą gęstością a płytki nie powinny być inkubowane dłużej niż 20 godzin w 37°C. β-laktamaza jest wydzielana do podłoża przez odporne na ampicylinę komórki i może szybko inaktywować antybiotyk w regionach otaczających te kolonie. Zatem duża gęstość komórek lub zbyt długa inkubacja powoduje pojawienie się wrażliwych na ampicylinę kolonii satelitarnych.

7. Odwrócić płytki i inkubować w 37°C. Kolonie stransformowanych komórek powinny pojawić się w ciągu 12-16 godzin.




Rys.3. Transformowane bakterie na pożywce agarowej z antybiotykiem i X-gal

8. Selekcji transformantów dokonać na podstawie koloru koloni. Do dalszej analizy pobierać jedną kolonię po całonocnej inkubacji na pożywce LB z antybiotykiem.

Odczynniki

• CaCl₂ 2H₂O 1M -wysterylizować przez filtrację przez prerinsed filtr Nalgene o średnicy porów 0,45um i ochłodzić do 0°C.

• MgCl₂-CaCl₂ zimny roztwór (80 mM MgCl₂, 20 mM CaCl₂) i ochłodzić do 0°C.

• Płytki agarowe LB zawierające z 1% ampicyliną

• Pożywka SOB (Super Optimal Broth) - 1000ml - (20g tryptonu, 5g ekstraktu drożdżowego, 0,5g NaCl, woda dejonizowana do 950 ml - wytrząsać do rozpuszczenia składników, dodać 10 ml 250 mM KCl, ustalić pH do 7,0 przy pomocy NaOH. Uzupełnić objętość do 1L dejonizowaną H₂O, sterylizować przez autoklawowanie, tuż przed użyciem dodać 5 ml sterylnego roztworu 2M MgCl₂

• Pożywka SOC Pożywka SOC (Super Optimal Catabolite repression) - identyczna jak SOB, ale zawiera dodatkowo glukozę 20 mM. Po wysterylizowaniu pożywki SOB, do pożywki ochłodzonej do 60°C lub bardziej dodać 20 ml 1M sterylnego roztworu glukozy (sterylizowanego przez filtrowanie przez 0,22um filtr)

• Plazmidowe DNA (zrekombinowany plazmid)

• X-gla 2% rozpuścić w 2 ml DMF - zawinąć w folie aluminową i przechowywać w -20°C.

• Płytki agarowe z X-gal - rozpipetować po 100ul na środek przygotowanej wcześniej płytki agarowej z antybiotykiem i sterylnie dokładnie rozgłaskać głaszczką. Z powodu niskiej lotności dimethylformamide, może to potrwać do 3-4 godzin, jeśli płytki są świeżo zrobione.

Aparaty i niezbędny sprzęt

• Inkubator,

• Łażnia wodna nastawiona na 37°C

• Łażnia wodna nastawiona na 42°C

• Wirówka

• Spektrofotometr UV/VIS

• Woteks

• Pipety, głaszczki,

• Palnik, lód

4

---