Kierunek: Technologia Żywności i Żywienie Człowieka

Przedmiot: Enzymologia

Temat ćwiczenia:

CZYNNIKI WPŁYWAJĄCE NA SZYBKOŚĆ REAKCJI ENZYMATYCZNYCH

Wprowadzenie:

Na szybkość przebiegu reakcji enzymatycznych mają zasadniczy wpływ różne czynniki, tj. stężenie substratu, stężenie enzymu, temperatura, pH środowiska, obecność aktywatorów i inhibitorów.

Szybkość reakcji enzymatycznej w przypadku dużego stężenia substratu (wówczas stężenie substratu nie wpływa na szybkość reakcji) jest wprost proporcjonalna do stężenia enzymu (przy niezbyt dużych stężeniach enzymu). W przypadku małych stężeń substratu wzrasta wraz ze zwiększaniem stężenia enzymu, jednak nie jest to wzrost liniowy.

Wzrost temperatury powoduje zwiększenie szybkości reakcji enzymatycznej (jak każdej chemicznej), po osiągnięciu optimum szybkość ta zaczyna jednak spadać ze względu na denaturację cieplną enzymu. Szybkość inaktywacji enzymów rośnie wraz
z podwyższaniem temperatury, zależy jednak zwykle od pH środowiska. Większość enzymów traci aktywność po przekroczeniu 65^oC, nieliczne tylko wytrzymują krótkotrwałe gotowanie, np. trypsyna w pH 1. Wyższą temperaturę wytrzymują enzymy suche, dlatego przechowywane są najczęściej w postaci liofilizowanej, aby zapobiegać inaktywacji. Optymalna temperatura zależy od długości inkubacji (gdy enzym ma działać kilka sekund, może być wysoka, gdy kilka dni - musi być niska, by długo zachował aktywność), pH środowiska, stężenia soli oraz obecności aktywatorów i inhibitorów (głównie jonów metali obecnych w odczynnikach jako zanieczyszczenia). W temperaturze do ok. 37^oC (gdy nie grozi denaturacja cieplna enzymu) podniesienie temp. o 10^oC powoduje 2-krotne zwiększenie szybkości reakcji. Zmianę szybkości reakcji w zależności od temperatury wyraża reguła van't Hoffa, według której wzrost temperatury o 10 K powoduje 2-4-krotny wzrost szybkości reakcji.

Z regułą van't Hoffa wiąże się temperaturowy współczynnik szybkości reakcji (TWSR), wyznaczający stosunek szybkości reakcji chemicznej po zmianie temperatury do szybkości reakcji przed zmianą temperatury (wzrostem lub spadkiem).

ΔT = T₂ - T₁

γ - temperaturowy współczynnik szybkości reakcji (TWSR)

Liczbę określającą ile razy wzrośnie stała szybkości reakcji k (a więc i szybkość reakcji) nazywamy współczynnikiem temperaturowym *.

Wpływ temperatury we wzorach opisujących szybkość reakcji zawarty jest w stałej szybkości reakcji k.

Wpływ temperatury na szybkość reakcji opisuje empiryczne równanie Arrheniusa

k - stała szybkości reakcji

A - stała Arrheniusa

E_A - energia aktywacji w J/mol

R - stała gazowa (8,319 J•mol^-1•K^-1)

T - temperatura w K

Stała Arrheniusa A jest maksymalną stałą szybkości reakcji w warunkach, gdy wszystkie zderzenia cząsteczek są efektywne.

Równanie w postaci logarytmicznej przedstawia liniową zależność między ln k a 1/T.

Stałą Arrheniusa A oraz energię aktywacji można łatwo wyznaczyć znając doświadczalne wartości stałych szybkości reakcji w kilku temperaturach.

Równanie Arrheniusa może służyć do określenia z

ależności między energią aktywacji
a temperaturą:

gdzie:

k₁ i k₂ - stałe szybkości reakcji w temperaturze T₁ i T₂

T₁ i T₂ - temperatury pomiarów w skali Kelwina

W reakcjach enzymatycznych szybkości V_max wyznaczone przy dużym nadmiarze substratu są wprost proporcjonalne do stałych szybkości, można więc wartości k₁ i k₂ zastąpić wartościami V_max1 i V_max2, wyznaczonymi dla dwóch temperatur.

Szybkość reakcji enzymatycznej jest optymalna w określonym pH (w zależności od rodzaju enzymu), zaś spada w miarę oddalania się od tego punktu na skutek denaturacji białka. Aktywność enzymatyczna zmienia się w różnym zakresie pH ze względu na zmiany stopnia zjonizowania zarówno enzymu, jak i substratu oraz kompleksu substrat-enzym. Centrum aktywne enzymu wykazuje działanie katalityczne najczęściej tylko w jednej formie zjonizowania grup, podobnie zwykle tylko jedna forma substratu jest aktywna. Również przy tworzeniu kompleksu enzym-substrat ważne są ich ładunki, ponieważ mogą je łączyć wiązania elektrostatyczne.

Substancje, które nie zmieniając sumarycznego procesu zmniejszają energię aktywacji nazywamy katalizatorami. Katalizator nie zużywa się podczas reakcji, dlatego nie występuje w równaniu stechiometrycznym.

Katalizatory ujemne, zmniejszają szybkość reakcji nazywamy inhibitorami.

Rolę katalizatora mogą pełnić pierwiastki i związki chemiczne (zwłaszcza metale grup pobocznych i ich tlenki oraz białka - enzymy - w reakcjach enzymatycznych), a także zanieczyszczenia i światło (w reakcjach fotochemicznych).

Aktywność enzymów może być zakłócana przez działanie wielu substancji. Inhibicja może być odwracalna i nieodwracalna, inhibicja odwracalna zaś może być kompetycyjna lub niekompetycyjna.

Związki, które tworzą wiązania kowalencyjne z resztą aminokwasu znajdującą się w centrum aktywnym enzymu (Ser lub Cys) lub w jego pobliżu, inaktywują enzym na stałe.

Inhibitorami kompetycyjnymi (współzawodniczącymi) mogą być związki strukturalnie podobne do normalnego substratu danego enzymu, które konkurują z nim o centrum aktywne. Enzym może wiązać albo cząsteczkę substratu, albo cząsteczkę inhibitora ale nie obie równocześnie. Hamowanie będzie tym większe im większe będzie stężenie inhibitora oraz wartość K_M oraz im mniejsze będzie stężenie inhibitora i wartość K_i (stała dysocjacji kompleksu enzymu z inhibitorem). Przy dużym stężeniu substratu, działanie jego skutecznie współzawodniczy z działaniem inhibitora, więc nie zmieni się wartość V_max, jednak wzrośnie wartość K_M (pozornie mniejsze powinowactwo enzymu do substratu).

Działanie inhibitora kompetycyjnego można rozpoznać po zastosowaniu równania Lineweavera-Burka - mierzy się szybkości początkowe v₀ przy różnych stężeniach substratu i stałym stężeniu inhibitora. Inhibicja kompetycyjna zmienia nachylenie prostej oraz punkt przecięcia z osią x (wzrasta K_M), natomiast punkt przecięcia z osią y pozostaje bez zmian (stała wartość V_max).

Inhibitorami niekompetycyjnymi są związki, które wiążą się z miejscem innym niż centrum aktywne enzymu i powodują zmianę przestrzennego kształtu enzymu, a przez to zmniejszenie jego aktywności katalitycznej. Mogą one wiązać się z wolnym enzymem lub z kompleksem enzym-substrat, a ich działanie nie zależy od stężenia substratu (wartość V_max zmniejsza się), a jedynie od stężenia inhibitora i jego wartości K_i, charakteryzującej powinowactwo inhibitora do enzymu. Powinowactwo substratu do enzymu nie ulega zmianie, dlatego wartość K_M pozostaje stała.

EI

±I ±S

E EIS E + P

±S ±I

ES

E+P

Działanie inhibitora niekompetycyjnego na wykresie Lineweavera-Burka można rozpoznać ze względu na zwiększenie nachylenia prostej oraz zmianę punktu przecięcia z osią y (maleje V_max), natomiast punkt przecięcia z osią x pozostaje bez zmian (stała wartość K_M).

Aktywność enzymatyczną hamuje niekompetycyjnie wiele związków, np. czynniki strącające białka, jak sole metali ciężkich w wyższych stężeniach czy odczynniki alkaloidowe. Wiele enzymów jest wrażliwych nawet na niskie stężenia metali ciężkich, co tłumaczy się katalizowaniem metalem utleniania np. grup -SH tlenem atmosferycznym. Działanie to jest odwracalne, można je cofnąć stosując nadmiar związków tiolowych, np. cysteiny, których grupy -SH będą konkurować z grupami enzymu o inhibitor.

Inhibitorami są również związki tworzące kompleksy z metalami będącymi częścią centrum aktywnego lub biorącymi bezpośredni udział w procesie katalitycznym, np. cyjanki, CO wpływają na oddychanie komórkowe, hamując oksydazy zawierające Fe lub Cu w grupie czynnej.

Typ hamowania można określić kilkoma metodami, np. za pomocą metody Dixona. Przy stałym stężeniu substratu oznacza się szybkość reakcji v przy różnych stężeniach inhibitora. Oznaczając szybkość v przy dwóch (lub więcej) stężeniach substratu, wyznacza się krzywe zależności 1/v od [I] i ustala typ hamowania (kompetycyjne - krzywe przecinają się, niekompetycyjne - krzywe zbiegają się na osi x) oraz oznacza wartość K_i (punkt przecięcia krzywych). Można również wykreślić krzywe zależności szybkości reakcji v₀ od stężenia substratu według Michaelisa-Menten lub też zależność 1/v od 1/[S] wg Lineweavera-Burka, w obecności i nieobecności inhibitora, z których można wyznaczyć wartości V_max i K_M i na tej podstawie określić typ inhibicji, jak już podano wyżej.

Krzywa Dixona: a) dla inhibitora kompetycyjnego; b) dla inhibitora niekompetycyjnego

Krzywa Michaelisa-Menten bez i w obecności inhibitora a) kompetycyjnego;
b) niekompetycyjnego

Krzywa Lineweavera-Burka bez i w obecności inhibitora a) kompetycyjnego;
b) niekompetycyjnego

Celem ćwiczenia jest poznanie mechanizmów inhibicji i określanie typów hamowania reakcji enzymatycznych oraz poznanie czynników wpływających na szybkość reakcji enzymatycznych.

Wykonanie ćwiczenia:

Zadanie 1.

1. Obliczyć energię aktywacji, przyjmując, że podczas hydrolizy w temp. 25^oC szybkość V_m reakcji wynosiła 0,27 mg/min, a w temp. 35^oC 0,48 mg/min.

2. Wyliczyć energię aktywacji, wiedząc, że stała szybkości reakcji w temp. 27^oC wynosiła 0,245.

3. Energia aktywacji pewnej reakcji wynosi 50 kJ/mol. Jak zmieni się stała szybkości tej reakcji, jeśli temperatura zostanie obniżona z 25⁰C na 15^oC?

4. Ile razy wzrosła szybkość pewnej reakcji, jeśli jej temperaturowy współczynnik wynosi γ=3, a temperatura wzrosła o 5^oC?

5. Ile razy wzrosła szybkość pewnej reakcji, jeśli jej temperaturowy współczynnik wynosi γ=4, a temperatura wzrosła o 8^oC?

6. Temperaturowy współczynnik pewnej reakcji wynosi γ=3. O ile stopni należy podnieść temperaturę, aby szybkość reakcji wzrosła 10 razy?

7. Temperaturowy współczynnik pewnej reakcji wynosi γ=4. O ile stopni należy podnieść temperaturę, aby szybkość reakcji wzrosła 3 razy?

8. Temperaturowy współczynnik pewnej reakcji wynosi γ=1. O ile stopni należy podnieść temperaturę, aby szybkość reakcji wzrosła 3 razy?

Zadanie 2. W wyniku działania dwóch różnych enzymów na substrat o zmiennym stężeniu określono szybkości początkowe:

Początkowe stężenie substratu [μM]	enzym A	enzym B
		v0	v0
50 100 156 208	5,6 8,4 9,3 10,3	11,2 14,9 16,8 18,7

1. Określić stałe kinetyczne K_M i V_max.

2. Który z enzymów wykazuje większe powinowactwo do substratu?

Zadanie 3. Zmierzono szybkości początkowe przy różnym stężeniu substratu dla reakcji katalizowanej przez trypsynę niemodyfikowaną i modyfikowaną:

Początkowe stężenie substratu [μM]	enzym niemodyfikowany	enzym modyfikowany
		v0	v0
4 8 10 15 20	1,2 1,7 1,9 2,2 2,6	1,9 2,5 2,6 3,0 3,2

1. Określić stałe kinetyczne K_M i V_max.

2. Jakiego rodzaju inhibicję wywołała modyfikacja trypsyny?

Zadanie 4. Oznaczono szybkości początkowe reakcji bez i z dodatkiem inhibitora. Otrzymano:

Początkowe stężenie substratu [μM]	bez inhibitora	działanie inhibitora
		v0	v0
5 10 15 20 26	1,8 2,0 2,4 2,6 2,7	1,3 1,4 1,8 2,1 3,1

1. Wyznaczyć stałe kinetyczne

2. Określić rodzaj inhibicji

3. Podać w jaki sposób można cofnąć działanie inhibitora.

Zagadnienia do przygotowania:

1. Wpływ różnych czynników na szybkość reakcji enzymatycznych.

2. Optymalne warunki działania inwertazy, amylazy ślinowej, trypsyny itp.

3. Energia aktywacji, reguła van't Hoffa, współczynnik temperaturowy.

4. Rodzaje inhibitorów, przykłady różnych typów, mechanizmy inhibicji enzymów.

5. Metody określenia typów inhibicji.

6. Przykłady inhibitorów i ich wpływu na reakcje enzymatyczne w technologii żywności.

Literatura:

1. Dziuba J., Kostyra H.: „Biochemia żywności (metody, zadania i testy)”, Wydawnictwo UW-M w Olsztynie, Olsztyn 2000.

2. Kłyszejko-Stefanowicz L. (red.): „Ćwiczenia z biochemii”, PWN Warszawa - Poznań 1982.

3. Kołakowski E., Bednarski W., Bielecki S. „Enzymatyczna modyfikacja składników żywności”, Akademia Rolnicza w Szczecinie, Szczecin 2005.

4. Murrey R.K., Granner D.K, Mayes P.A., Rodwell V.W.: „Biochemia Harpera”, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2001.

5. Stryer L.: „Biochemia”, PWN Warszawa 1986.

Zał. 1

Wpływ stężenia substratu na szybkość reakcji enzymatycznej

Powstawanie kompleksów enzym-substrat przy:

A) małym stężeniu substratu; B) stężeniu substratu równym K_M; C) dużym stężeniu substratu;

Zał. 2.

Wpływ temperatury na aktywność enzymu

Wpływ pH na aktywność enzymu

---