BIOTECHNOLOGIA 6 WYKŁAD

Listeria monocytogenes - w świecie szczepionek należy do żywych wektorów - do przenoszenia dowolnych antygenów do dowolnego miejsca w organizmie człowieka, czy innych ssaków.

Wprowadzono na dzień dzisiejszy lek, który jest żywym specyfikiem przeciwko nowotworom.

Jest to wektor przenoszący antygeny, które są białkami nadającymi układowi immunologicznemu informacje, że w organizmie są komórki nowotworowe. Ten z kolei produkuje przeciwciała.

Listeria monocytogenes atakują komórki ssacze i przechodzą w nich cały skomplikowany cykl życiowy, podczas którego mogą powielać się, przechodzić z komórki do komórki. Efektem tego jest proces chorobowy. Listeria monocytogenes nie jest bardzo groźna. Atakuje głównie osoby osłabione immunologicznie. Może atakować płody - przyczynia się do poronień. Atakuje też ludzi chorych na AIDS.

Jest to laseczka G(+). Posiada charakterystyczną budowę ścian komórkowych. Ściana jest gruba. Na powierzchni występują liczne białka, które nadają tej ścianie pewien ładunek elektrostatyczny. Jest to ładunek do tego stopni istotny, że będąc źródłem zakażeń w przemyśle mleczarskim (bo jest to zakażenie głównie produktów mlecznych), wymyślono prostą metodę usuwania jej z mleka, dzięki której nawet pojedyncze bakterie mogą być usunięte. Przykłada się do mleka duże pole magnetyczne i magnes ściąga te bakterie jak opiłki żelaza: w ten sposób Listeria jest usuwana z mleka.

Zrobiła karierę w biologii medycznej.

Żeby poznać biologię tego mikroba trzeba było uzyskać mutanty. Listeria monocytogenes jest bakterią trudną do zmutowania. Do roku 95-ego nie było klucza mogącego prowadzić do prac genetycznych. W latach 90-tych nauczono się transformować te bakterie - dokonywano tego na drodze protoplastyzacji. Nie jest to proste - na powierzchni ściany komórkowej są liczne białka, które przeszkadzają w docieraniu do ściany antybiotyków, które mogą się wiązać z białkami wiążącymi penicylinę i aktywność białek wiążących penicylinę (PBP), koniecznych do tworzenia ściany komórkowej, jest zlikwidowana.

Białka PBP fizjologicznie w komórce są potrzebne do syntezy wiązań peptydowych pomiędzy łańcuchami mureiny ściany komórkowej. Jeżeli to białko połączy się z penicyliną, to traci tę aktywność. Ściana komórkowa pozbawiona połączeń peptydowych staje się luźna i się rozpada. W pierwszym etapie powstają sferoplasty - (sferoplastyzacja) - komórki częściowo pozbawione ściany komórkowej, a następnie protoplasty - zupełnie pozbawione ściany komórkowej. I te protoplasty są pozbawione ściany komórkowej. To poddaje się transformacji.

Protoplasty to mocno uszkodzone komórki. Żeby mogła ona przetrwać, trzeba zapewnić jej właściwe środowisko (np. ciśnienie osmotyczne, pH). Gdyby go nie było, komórka by się rozpadła.

Taka komórka jest narażona na czynniki zewnętrzne. Po transformacji bardzo trudno jest doprowadzić do stanu odtworzenia ścian komórkowych. Aby transformant mógł powstać, komórka musi wrócić do stanu wyjściowego. Ten proces u Listeria trwa bardzo długo - od 3 do 5 dni i jest to okres na tyle długi, że w tym czasie hodowle protoplastów narażone są na liczne zakażenia. W tym czasie podstawowy problem to odtworzenie ściany komórkowej bez zakażenia hodowli. Do tego dochodzą elementy podnoszące koszty procesu - do stworzenia protoplastów należy użyć dodatkowych enzymów, które dodatkowo nadtrawiają mureinę - lizozym, lizostafina, czy muraminidazy - całkowicie pozbawiają protoplasty ściany komórkowej.

Na początku lat 90tych udało się je stransformować, a zrobiono to za pomocą plazmidu pLTV. Plazmid ten zawiera elementy, które pozwalają mu się replikować - musi mieć origin replikacji oraz markery oporności (ten ma na tetracyklinę i chloramfenikol). Plazmid taki, skoro jest plazmidem stosowanym do mutagenizacji musi mieć elementy do wbudowywania się do chromosomu bakteryjnego. W tym przypadku ma transpozon TN5. Jest to sekwencja insercyjna, która znajduje powinowactwo na chromosomie bakteryjnym. Jest to sekwencja oflankowana dwiema sekwencjami insercyjnymi. Transpozon znajduje sekwencje homologiczne dzięki sekwencjom flankującym. Aby mógł się wbudować i aby zwiększyć częstość tego procesu, plazmid ten zawiera dodatkowy replikon, który działa w bakteriach gram dodatnich, nazwany replikonem Ts replikon - replikon termowrażliwy. Charakteryzuje się tym, że gdy jest aktywny, to bakteria może tylko replikować się w temperaturach niższych, niż 37*C. Powyżej nie następuje replikacja tego plazmidu.

Zasada działania plazmidu pLTV

Transpozon znajduje przypadkowe miejsca, do których ma sekwencje homologiczne, zupełnie losowo na całym chromosomie. W ten sposób, gdy dodamy DNA do komórki bakteryjnej, uzyskujemy po homologicznej rekombinacji tego plazmidu z DNA chromosomalnym całą serię mutantów, które będą mutantami tego samego rodzaju, co plazmid. Nazywamy to biblioteką transpozonową - zestaw mutantów ulegających mutagenizacji tym zestawem.

Presja antybiotykowa oraz hodowla w temperaturze powyżej 37^oC (temperatura restrykcyjna) spowodują, że będąc wolnym w komórce, plazmid ten się nie replikuje, bo jego replikon, który pozwalał mu się replikować w bakterii gram- tutaj nie działa, natomiast drugi replikon, który działa w bakterii gram+ nie działa, bo mamy układ w 42 stopniach. W związku z tym, skoro nie działa w 42 stopniach, mogą przeżyć tylko te komórki, które wbudowały się na drodze rekombinacji homologicznej do chromosomu i do oporności na antybiotyk wykorzystują replikony chromosomalne - na tym polega zasada mutagenizacji insercyjnej - a więc zablokowanie przez antybiotyk plus niemożliwość replikacji w 42 stopni. Przeżywają tylko mutanty chromosomalne.

Następnym etapem jest zbadanie pochodnych szczepów, różnorakich mutantów, które uzyskaliśmy na tej drodze. Gdyby chodziło o proste cechy jak poszukiwanie mutantów auksotroficznych, sprawa jest banalna - stosujemy różne podłoża selekcyjne i na drodze replikacji znajdujemy to, co jest mutantem. W przypadku skomplikowanych cech, trudniej znaleźć sposób selekcji. Możemy wyizolować cały ten układ mutantów, o których nic nie wiemy. Chodzi nam o znalezienie mutantów o specyficznych właściwościach.

Przez przypadek okazało się, że linia komórkowa fibroblastów myszy, która była stosowana do badania wirusów zwierzęcych przez wirusologów jest świetnym materiałem do zróżnicowania mutantów z biblioteki transpozonowej. Miesza się z fibroblastami mysimi agar półpłynny (podłoże wzbogacone bulionem odżywczym, które zawiera wszystko, czego bakteria wymaga do życia, a dodatkowo zestala się to agarem 0,4%). Mysie fibroblasty równo zmieszane wylewa się na płytkę Petriego, ale przed wylaniem - kiedy jeszcze układ nie jest zbyt gorący - około 40 stopni, dodaje się bakterie z biblioteki transpozonowej. Podobnie jak wirusy, patogeny wewnątrzkomórkowe powodują, że podczas inkubacji tej płytki z fibroblastami w agarze półpłynnym z udziałem bakterii biblioteki transpozonowej, następnego dnia powstają mniejsze lub większe przejaśnienia o różnych kształtach - łysinki.

Jest to miejsce, gdzie baterie zaatakowały fibroblasty mysie.

Analizując setki tych łysinek pogrupowano je w pewne grupy i wyizolowano stamtąd kolejne bakterie na płytkę z agarem odżywczym. Okazało się, że ten sposób pozwolił na rozróżnienie różnych mutantów transpozonowych od siebie. Okazało się, że kolejne różne łysinki wynikają z różnych mutantów bakteryjnych, które dają te łysinki.

Duże łysinki - szczep dziki

Małe lub o zmienionym kształcie obrzeża - łysinki mutantów.

Do określenia, że to rzeczywiście to, a nie co innego, prowadziła długa procedura badawcza. Po pierwsze trzeba było zbadać, jakie elementy powodowały łysinki. Postanowiono więc zbadać białka sekrecyjne. Zrobiono na poliakrylamidzie rozdział, traktując jako marker białka szczepu dzikiego.

Następnie do innych dołków nałożono kolejne białka sekrecyjne i porównywano.

Znajdywano mutanty pojedycnze, ale znaleziono i mutanta podwójnego. Najważniejszy mutant to mutant pozbawiony listeriolizyny - białka LLO (wydzielanego na zewnątrz) oraz mutanty pozbawione białka P60. Nie wszystkie mutanty udało się tak znaleźć. Zastanawiano się nad innymi testami. Jeżeli taki żel zdublować i zrobić taki sam równolegle i żel po rozdziale nie wybarwiać błękitem Coomassiego z kwasem octowym, to istnieje możliwość pokrycia tego żelu agarem z dodatkiem żółtka kurzego. W pewnych miejscach tego żelu w przypadku szczepu dzikiego, mamy dwa zaczernienia. Okaże się, że w szczepach zmutowanych są różnice. A więc wiemy, że w tej okolicy, gdzie były małe białka, można metodą biologiczną wykryć ich aktywność. Były to fosfolipazy. Wykrywano więc obecność fosfolipaz, ale i brak fosfolipaz (mają one zdolność do ścinania białek).

W tej chwili prowadzi się ukierunkowaną mutagenezę przy udziale PCR.

Ale wtedy stworzono wektory insercyjne do rekombinacji homologicznej. Przykładem jest plazmid pLir - wektor insercyjny do listerii.

Plazmid ten został stworzony na bazie plazmidu pLTV. Wykorzystano do niego element replikonu termowrażliwego.

Ten element przeniesiono do plazmidu pACYC, na bazie którego po włączeniu replikonu termowrażliwego stworzono pLIR.

Do tego sklonowano fragmenty genu, który nas interesuje. W tym wypadku mógł być to element środkowy - 50bp. Wystarczyło to, by był element homologiczny z wybranym miejscem na chromosomie. Jeśli jest to gen odpowiedzialny za produkcję hemolizyny, to spodziewamy się, że po transformacji, że homologia i rekombinacja powstanie w miejscu, gdzie element znajdzie miejsce homologiczne i zajdzie insercja do chromosomu. W ten sposób uzyskujemy mutanta insercyjnego w dowolnym miejscu. Wymuszona jest ona presją antybiotykowa oraz zależnością temperaturową. W obecności antybiotyków przeżyją tylko te szczepy, które wbudują się do chromosomu bakteryjnego w miejscu wyznaczonym przez element insercyjny. W ten sposób uzyskano cały szereg mutantów i uzyskano pożądane mutanty w kierunku sprecyzowanym.

Jak udowodnić, że są to czynniki patogenezy?

Aby udowodnić, że dane białka, których brakowało w przypadku mutantów są czynnikami mutagenezy, nauczono się hodować szczepy patogenów wewnątrzkomórkowych w hodowlach tkankowych. Najprostszym testem, który pozwala określić patogenność szczepu jest sprawdzenie szczepu i sprawdzenie + charakterystyka wzrostu w hodowlach tkankowych.

Najlepsze skutki dała linia komórkowa j774. Jest to linia komórek makrofagopodobnych, które to komórki mają zdolność adhezji do szkiełek. Takie szkiełka umieszcza się w podłożach do hodowli tkankowych, w skład którego wchodzą wszystkie elementy pozwalające komórkom na wzrost. Jeżeli do takiego podłoża włoży się okrągłe szkiełka mikroskopowe (podłoże to nazywa się EAGLE) i poprowadzi hodowlę komórek makrofagopodobnych, lub makrofagów rzeczywistych, to makrofagi będą przyklejać się do tego szkiełka i stworzą jednolitą warstwę komórkową na powierzchni szkiełek. Jeżeli do tej płytki doda się odpowiednią ilość bakterii patogennych, to będą one atakować komórki eukariotyczne. Będą więc atakować makrofagi. Do płytek należy koniecznie dodać antybiotyku, który w tym wypadku z wyboru jest kanamycyną. Kanamycyna to antybiotyk, który nie ma zdolności wnikania do wnętrza komórek eukariotycznych, natomiast zabija bakterie. W związku z tym dodanie kanamycyny do podłoża, powoduje, że wszystkie bakterie, które są wolne w podłożu przykrywającym szkiełka, zostają zabite.

Barwiąc odpowiednimi barwnikami bakterie i komórki makrofagów, uzyskujemy wybarwione szkiełka przykrywkowe, na których są makrofagi zawierające odpowiednio bakterie, które wcześniej zainfekowały makrofagi. Jeżeli proces badamy w czasie, to okazuje się, że po wybarwieniu szkiełek, ten preparat utrwala się żywicą kanadyjską. Utrwalane preparaty ogląda się pod mikroskopem i po pół godziny znajdziemy makrofagi z pojedynczymi komórkami, po czasie będzie ich dużo. Po 5 godzinach praktycznie wszystkie komórki są zainfekowane bakteriami.

Można równolegle jedno szkiełko oglądać pod mikroskopem, a drugie wypłukiwać w buforze i liczyć bakterie. W ten sposób można w zwykłym mikroskopie obserwować ruch bakterii wewnątrz tkanek.

Dzięki mikroskopii skaningowej zanalizowano cykl życiowy L. Monocytogenes.

1. bakteria spotyka się z makrofagiem.

2. Jest otaczana przez makrofaga- bakteria uruchamia fagocytozę - system kinaz wpływa na włókienka aktynowe. Potrzebne są liczne internaliny u bakterii, które powodują przyleganie bakterii do powierzchni.

3. Bakteria w wodniczce odżywczej, pobrana do środka komórki.

4. W pewnym momencie wodniczka rozpada się - bakteria wydziela do wnętrza wodniczki listeriolizynę (hemolizyna bakteryjna). Jest to konieczność, bo za chwilę przyczepiłyby się tam lizosomy.

5. Bakteria wolna w cytoplazmie, zaczyna się dzielić w cytoplazmie, żyje sobie luzem w cytoplazmie.

6. Na biegunie przednim bakteria otacza się włóknami aktynowymi. Bakteria produkuje białko Acta. Do tego białka mają powinowactwo włókna aktynowe, które opłaszczają komórkę bakteryjną. Wówczas następuje przesunięcie baterii do danego miejsca w komórce i następuje przyrost włókienek aktynowych do bieguna, gdzie przesunęła się bakteria (kometa listeryjna). Jest to element przyrastający cały czas. Przyrastając, powoduje przesuwanie komórki bakteryjnej. Przesuwa się do tego stopnia, że wysuwa się wręcz z komórki makrofaga i wydostaje się na zewnątrz - ale niezupełnie, bo wciąż otoczona jest wypustką cytoplazmatyczną.

7. Spotkanie sąsiedniego makrofaga. Makrofag rozpoznaje wypustkę cytoplazmatyczną i pobiera ją do środka jako obce ciało.

8. Zamknięcie podwójnej błony białkowo-lipidowej.

9. Bakteria zamknięta w środku i robi wszystko, by się uwolnić.

10. Fosfolipazy wspomagają trawienie b. białkowo-lipidowej. Przy układzie fosfolipazy-hemolizyna, następuje strawienie błon i komórka uwolniona do cytoplazmie.

11. Goto step 5

Zastosowanie tej bakterii w walce z rakiem było możliwe tylko dlatego, że rozpoznano cykl życiowy tej bakterii.

Jeżeli mamy mutanty hemolizyna-fosfolipaza, to okaże się, że nie ma w ogóle cyklu życiowego. Jeśli mamy mutanty hemolizyna - cykl też nie zajdzie. Jeżeli jednak mutant jest fosfolipazowy, to bakteria robi jeden cykl i zatrzymuje się na kroku ósmym.

Jeżeli chodzi o samą listerię, to ona sama przez wydzielanie własnych białek powoduje, że na powierzchni makrofagów w systemie MHCI i MHCII następuje prezentacja antygenów, indukująca produkcję przeciwciał.

Jeżeli wyobrazimy sobie, że do genomu Listeria wprowadzimy dowolny gen, który warunkuje powstawanie białka kapsydu wirusa grypy, to okaże się, że będąc wolna w cytoplazmie produkuje białka kapsydu, przez co warunkuje produkcję przeciwciał przeciw wirusom grypy... żywy wektor biologiczny - szczepionka nowej generacji.

Od odkrycia mechanizmu patogenezy do odkrycia szczepionki na nowotwory minęło 28 lat.

Wektor na bazie Salmonella enterica jest lepszym antygenem przeciwko listeriozie, niż Listeria sama w sobie.

Salmonella enterica - serowar Typhinarium - a także przeciwko:

odrze (białko nukleokapsydu)

malarii (powierzchniowe białko 2)

shigellozie (shiga toksyna - Shigella)

W pierwszych badaniach szczepionek system polegał na tym, że starano się wykorzystać akcję hemolizyny do uwalniania wektora bakteryjnego do cytoplazmy - od początku myśli tych szczepionek.

Pierwszym szczepem, w którym próbowano wykorzystać hemolizynę jako element uwalniający bakterię z wodniczki jest E. coli. Pałeczka okrężnicy wydziela listeriolizynę (czyli hemolizynę) wklonowaną w odpowiednim plazmidzie ekspresyjnym ze swojej komórki na zewnątrz. Jest to karkołomne, bo listeriolizyna jest gram dodatnia, a gram ujemne bakterie mają inny system sekrecyjny. Zawierają więc swoją lizynę w swoich osłonach bakteryjnych.

Do tego chromosomu wklonowano szereg antygenów bakterii patogennej. Bakterie zostanie strawiona przez makrofaga. Zaczyna trawienie od powierzchni - rozwala ścianę i uwalnia hemolizynę. Listeriolizyna inkorporuje do błony białkowo lipidowej i tworzy dziury. W związku z tym listeriolizyna rozbija wodniczkę (nie daje strawić do końca bakterii) i uwalnia strawione elementy komórkowe do błony cytoplazmatycznej.

Był to pomysł na szczepionkę. Sygnał, który otrzymuje układ odpornościowy od makrofaga, który to zwiera dotyczy tak wielkiej ilości białek, że znalezienie tego jednego, które nas interesuje jest niemożliwe. Stąd nastąpiło przejście na wektory, które wydzielają w każdym etapie życiowym czynniki patogenezy, które prowadzą cykl i dopiero po przeprowadzeniu cyklu następuje akcja i uwolnienie do cytoplazmy.

Biotechnologia, wykład VI, strona 5

---