APARATURA DO CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ (HPLC)

W chr. Cieczowej posugujemy sie kolumnami szklanymi, a wyciek analizujemy za pomocą konwencjonalnych metod analizy. Analizę wykonuje się w chromatografach cieczowych. Fazę ruchomą ze zbiornika pompuje się przez kolumne chromatogr. Analizowana próbkę wstrzykuje się naszczyt kolumny. Skladniki probki rozdzielaja sie w kolumnie i na wyjsciu z niej wykrywane są przez detektor. Sygnał z detek. Jest zapisywany w rejestratorze, mierzony integratorem i przekazywany w postaci zapisu cyfrowego.

Schemat chromatografu cieczowego: zbiornik fazy ruchomej > filtr> pompa> manometr.dozownik> kolumna> termostat> detektor> wzmacniacz> rejestrator> komputer

Pompy – w sposob ciągły, odtwarzalny i z optymalną prędkościa powodują przepływ fazy ruchomej przez kolumnę. Powinny charakteryzowac się: *stałym przepływem fazy ruchomej , *odpornością chemiczną materiału pompy na fazy ruchome, *małą objętością wewnętrzną, *bezpulsacyjnym przepływem, *możliwością uzyskania ciśnień roboczych do 35MPa. Kategorie ukł. pompujących: *stałociśnieniowe (-pompy wyporowe (cisnienie wytwarzane przez gaz z butli), -pompy z tłokami o róznej srednicy z napędem pneumatycznym. Zalety: posta konstrukcja, brak pulsacji cisnienia, wady: mozliwosc niepozadanych zmian przepływu fazy ruchomej), *stałoprzepływowe (-strzykawkowe (pracuja bezpulsacyjnie, ich wada jest mała ilosc fazy ruchomej zuzywanej w jednym cyklu pracy – koniecznosc przerywania procesu w celu napelnienia cylindra rozpuszczalnikiem); -tłokowe (najczesciej stosowane, yłoki przesuwaja sie w cylindrach o małej objętosci, ruch tłokow jest zsynchronizowany z otwieraniem i zamykaniem zaworów kulkowych kotrolujących przepływ f. ruchomej. Ich wada jest pulsacja cieczy powodujaca niestałości linii zerowej)

Dozowniki – próbkę do kolumny należy wprowadzac w postaci bardzo wąskiego pasma (pozakolumnowe poszerzenie pasma ma istotny wpływ na wartośc współczynnika retencji k). Typy dozownikow: *typu strzykawkowego,(umozliwiaja wprowadzenie probki bezposrednio do kolumny, -z uszczelkami, -bez uszczelek) *typu zaworu z pętlą (umożliwiaja wprowadzenie próbek w szerokim zakresie objętosci i z dobra odtwarzalnością), *typu pętli ze strzykawką

Kolumny – zachodzi w niej właściwy proces rozdziału, w zależności od wielkości próbki możemmy wybrac dla HPLC mikrokolumny, kolumny analityczne i kolumny preparatywne. Długośc kolumny zależy odziaren wypełnienia. Im ziarno mniejsze tym kolumna krótsza.

Detektory – powinny charakteryzowac się; *dobrą czułością i małą wartością granicy oznaczalności, *uniwersalnością wskazań w stosuknku do dużej licby substancji lub selektywnościa w stosunku do określonej liczby substancji, *szerokim zakresem liniowości wskazań, *małą objętością molową, *niewrażliwością na zmiany temp. i zmiany prędkości przepływu f. ruchomej, *łatwością obsługi i niezawodnością działania. Detektory dla HPLC można podizelic na 2 gr.: *det. W ktorych nastepuje pomiar własciwosci charakt. dla probki, *det., w ktorych nastepuje pomiar własciwosci wspolnej dla probki i f. ruchomej. Wybrane detektory stosowane w HPLC: *detektor spektofotometryczny UV – dziala na zasadzie absorpcji promieniowania UV (pracujace przy jednej dł, fali; pracujace w calym zakresie UV a nawet Vis; typu diode array), *detektor spektrofluorometryczny (det. selektywny charakteryzujacy się dużą czułością w stosunku do zw. wykazujaych wł, fluorescencyjne), *detektor refraktometryczny (mierzy w sposob ciągły różnice współczynników załamania czystej fazy ruchomej i eluentu z kolumny, jest mniej czuły niz det. UV, wrażliwy na zmiany temp)