Kultury in vitro

• Biotechnologia roślin PWN 2009 Malepszy

• Hodowla komórek i tkanek roślinnych Zenktler M. 1984. PWN

Prowadzenie wzrostu (kultura) pozbawionego organizmów materiału roślinnego w warunkach aseptycznych, na sztucznych pożywkach (podłożach), w zamkniętych naczyniach (płytkach, probówkach) o w kontrolowanych warunkach.

Hodowla roślin – działanie dla polepszania cech dziedzicznych u roślin uprawnych, którem celem jest wytworzeniem odmian lepszych jakościowo i plenniejszych.

Kultury in vitro roślin – podstawowa technika (obok inżynierii genetycznej) w biotechnologii roślin.

Totipotencja – zdolność każdej komórki organizmu wielokomórkowego do odtworzenia kompletnego organizmu.

Teoria komórkowej budowy organizmów Schleiden i Schwann (1839):

• Roślina jest zbiorem komórek

• Niezbędnym elementem komórki jest jądro komórkowe

• Organizmy są zbudowane z komórek i ich produktów

• Komórki maja swoje własne życie

• Komórka podlega organizmowi, jako całości

1860 – van Sachs i Knop: rośliny mogą rosnąć poza ziemią, w roztworach związków mineralnych. Ca(NO₃)₂,  MgSO₄,  KH₂PO₄,  FeSO₄ – pożywka Sachsa.

1902 – Gottlieb Haberlandt – ojciec kultur in vitro. Utrzymywał komórki mezofilowe w kulturze. Nie uzyskał podziałów komórek; Sformułował zasad kultur in vitro.

1925 – Laibach – kultury zarodków mieszańców międzygatunkowych Linum (metoda „embryo rescue”). Zarodki zygotyczne – pierwsze organy użyte do kultury in vitro.

1930 – Philip White:

• Pierwsze sukcesy na polu kultur tkankowych (wcześniejsze próby innych badaczy nie powiodły się: zakażenia, nieodpowiedniej pożywki).

• Cel White’a: kultury tkanek niezróżnicowanych, zdolne do nieorganicznego wzrostu jako system do badań metabolizmu

• Zastosował kultury wierzchołów wzrostu korzeni pomidora (sole mineralne, 2% sacharoza, ekstrakt drożdżowy)l wzrost utrzymany ponad 400 dni (ale tkanka nie była niezróżnicowana)

• Ekstrakt drożdżowy zastąpić mogą witaminy grupy B (tiamina, pirydoksyna i niacyna)

• Wykazał, że merystemy wierzchołków wzrostu korzeni zrażonych wirusem są wolne od wirusa.

• Sukces – do kultury pobierania tkanka z narośli kalusa tworzonego przez mieszańce Nicotiana, badania histologiczne potwierdziły, że tkanka jest niezróżnicowana

• Sporadyczne powstawania pędów! (Obserwacja wykorzystywana/rozwinięta w latach 50-tych)

1930 – Nobecourt i Gautheret – długoterminowe utrzymywanie w kulturze tkanki roślinnej. Kultury korzeni marchwi Daucus carota na pożywce z IAA.

1939 – Gautheret – pierwsze kultury kalusa z tkanki kambium Salix, marchwi i tytoniu; zastosował IAA i witaminy B na pożywce, wydłużył kulturę do 18 miesięcy.

1941 – Blakeslee i wsp. – Mleczko koksowe ma stymulujący wpływ na rozwój zarodków mieszańców Datura w kulturze in vitro.

1946 – Ball – Metoda kultury merystemów pędu z zawiązkami liści (Lupinus i Tropaeolum) szeroko stosowana w mikropropagacji roślin ozdobnych.

1950 – Thimann – rozwój uśpionych pąków bocznych można pobudzić stosując cytokininy.

1952 – Morel – uzyskanie roślin bez wirusowych Dhalia poprzez kulturę merystemów pędu (obecnie powszechne zastosowanie w praktyce hodowlanej u roślin). Namnażanie storczyków w kulturze in vitro.

1957 – Skoog and Miller – nawiązali do obserwacji White’a z lat 30. tych. Regeneracja roślin w kulturze tkanek tytoniu – demonstracja potencjału regeneracyjnego tkanek roślinnych, choć nie totipotencjalnych. Stosunek auksyn do cytokinin: auksyna>cytokinina (korzeń), auksyna<cytokinina (pędy), auksyna=cytokinina (kalus).

1958 – Steward, Reinert – pierwsze zarodki somatyczne (marchew).

1960 – Street – ustalił techniki kultur zawiesinowych, dążył do wykazania totipotencja tj. regeneracji roślinom z pojedynczej komórki; pojedyncze komórki w zawiesinie dzieliły się tworzą agregat (kalus), z których reagowały pędy/korzenie. Inni kwestionowali jednokomórkowe pochodzenie regeneratów.

Demonstracja totipotencja – regeneracja z pojedynczych komórek zawiesiny tytoniu. Śledzenie rozwoju zarodków somatycznych z pojedynczych komórek kultury zawiesinowej marchwi.

1960 – Cocking – enzymatyczna izolacja protoplastów – zastosowanie enzymów trawiących ścianę komórkową: pektynazy i cellulazy, pożywka o wysokim ciśnieniu osmotycznym, protoplasty odtwarzają ścianę komórkową, dzielą się tworząc kolonie komórek, następnie regenerują roślinki.

1972 - Carlson – fuzja protoplastów dwóch gatunków Nicotiana

1978 – uzyskanie mieszańca pomidora i ziemniaka w wyniku somatycznej hybrydyzacji na drodze fuzji protoplastów.

1960 – Guha and Maheshwari – kultura płku (pylników) w kulturze in vitro prowadzi do uzyskiwania roślin haploidalnych.

1970 – Nitsch – kultury mikrospor Nicotiana i Datura. Podwajanie liczby chromosomów (podwojone haploidy).

1960 – Murashige – propagacja in vitro roślin ozdobnych, rozwinął standardowe metody kultury tkanek dla kilku gatunków, opracował skład podstawowej pożywki (Murashige i Skoog, 1962).

Podstawowe składniki pożywki do kultur tkanek roślinnych:

• Sole mineralne – MS

• Źródło energii – cukier (sacharoza)

• Substancje wzrostowe (fitohormony, PGR)

Makroelementy: N,  K,  P,  Ca,  Mg,  S w solach CaCl₂,  KH₂PO₄,  KNO₃,  MgSO₄ • 7 H₂O,  NaH₂PO₄ • 2 H₂O,  NH₄NO₃,  (NH₄)₂SO₄

Mikroelementy: Fe,  Mn,  Zn,  B,  Cu,  Mo,  Co,  I w solach CoCl₂ • 6 H₂O,  CuSO₄ • …

Inne organiczne: sacharoza, Myo-insitol, Nicotinic acid (B₃), Thiamine-HCl (B₁), Pyridoxine HCL (B₆), Glycine.

Dodatkowe związki organiczne stosowane w pożywkach.

Aminokwasy:

• Glicyna

• L-glutamina

• Aspargina

• Seryna

• Prolina

Złożone związki organiczne:

• Hydrolizat kazeiny

• Pepton

• Mleko kokosowe

• Ekstrakt drożdżowy

• Papka ziemniaczana

• Poliaminy (putrescyna, spermidyna)

Redukcja niekorzystnego wpływu polifenoli:

• Węgiel aktywny (0,2%-3%) – absorbuje niepożądane związki np. utlenione polifenole, barwniki; ułatwia tworzenie korzeni.

• Polivynylpyrrolidon (PVP)

• Antyoxydanty: kwas askorbinowy lub cytrynowy

Kultura płynna – zawiesina komórek.

Kultura na pożywkach stałych – substancje żelujące. Agar (0,5-1%) – polisacharyd z glonów, zanieczyszczenia! Difco Agar, OXOID. Agaroza – oczyszczony ekstrakt agaru – niższe stężenie od agaru, kultury protoplastów, pojedynczych komórek. Żelujące gumy: GERLITE, PHYTAGEL. Polisacharydy bakteryjne; przeźroczyste. Żelującą przy odpowiednim Ca²⁺: Mg²⁺ tylko 1-krotne zestalenie!

Eksplantat – fragment tkanki lub organu dający początek kulturze in vitro np. eksplantat – kalus – regeneracja pędów. Eksplantaty pochodzą z różnych tkanek i organów rośliny. Tkanki somatyczne: niedojrzałe zarodki zygotyczne, merystemy, fragmenty korzeni, fragmenty pędów (liści, łodygi). Tkanki generatywne (źródło tkanek haploidalnych) – kwiatostany i ich części, pylniki, zalążnie.

Techniki kultur in vitro:

• Kultury nasion zarodków organów (korzeni), merystemów pędu, mikrospor, pylników, zalążni

• Kultury tkanek, komórek, kalusowe, protoplastów

• Kultury zawiesinowe, stałe

Techniki kultur in vitro:

1. Klonowanie:

   1. Mikropropagacja

   2. Krioprezerwacja i konserwacja zasobów genowych

   3. Produkcja wtórnych metabolitów

   4. Zmienność somaklonalna i gametoklonalna

2. Poszerzanie zmienności-nowe genotypy:

   1. Transformacja genetyczna

   2. In vitro zapylenie, zapłodnienie

   3. „embryo rescue” – krzyżówki międzygatunkowe

   4. Protoplasty – mieszańce somatyczne

   5. Mutagenez w kulturze komórek i tkanek

   6. Selekcja mutantów in vitro

Konserwacja zasobów genowych in vito:

• Zasoby genowe (germplasm) to różne genotyp, które mogą być przydatne w hodowli dla ulepszenia odmian hodowlanych.

• Konieczność zachowania bioróżnorodność organizmów

Zasoby genowe (banki genów) obejmują:

• Gatunki uprawne

  • Odmiany komercyjne

  • Linie hodowlane

  • Ekotypy

  • Elitarne fenotypy

• Gatunki dzikie:

  • Dla użycia bezpośredniego

  • Jako materiał do krzyżówek

• Technik inżynierii genetycznej umożliwiają korzystanie z zasobów genowych dowolnego gatunku

12 III 2014 r.

Regeneracja roślin – zdolność protoplastów, pojedynczych komórek lub tkanek do odtworzenia kompletnej rośliny – odtworzenie całego organizmu z jego części (przejaw totipotencja). Jest wynikiem plastyczności rozwojowej komórek roślin – totipotencji.

Totipotencja:

• Zdolność pojedynczej komórki do zróżnicowania się w każdy typ komórkowy organizmu

• Z definicji komórka totipotencjalną jest zygota. U ssaków totipotencjalnych charakteryzują się komórki macierzyste i komórki zarodkowe węzła zarodkowego blastocysty.

• U roślin własności totipotencja mają komórki merystematyczne.

Totipotencja komórek roślinnych. Czy wszystkie komórki roślinne są totipotentne?

Potencjalnie każda komórka roślinna, posiadająca kompletny materiał genetyczny, może ulec odróżnicowaniu w procesie regeneracji do kalusa i osiągnąć stan toti- lub pluripotencji. Wyjątkiem są silnie wyspecjalizowane komórki, które w trakcie różnicowania utraciły część bądź całość materiału genetycznego np. komórki przyszparkowe.

Jeśli komórka w czasie różnicowania utraci część/całość informacji genetycznej lub ekspresja informacji zostanie na trwałe zablokowana, komórka taka przestaje być totipotentne i nie będzie zdolna do wytworzenia kultury regenerującej rośliny. Tylko tzw. „kompletne” komórki roślinne wykazują zdolność do odróżnicowania, a następnie różnicowania a następnie różnicowania w kierunku wytworzenia de novo organów i całych roślin. Rozwój in vitro struktur pre-istniejących nie jest przejawem totipotencji.

Totipotencja in vitro: spontaniczne odróżnicowanie tkanek i powstawanie somatycznych zarodków. Arabidopsis – mutant clf swn defekt w kompleksie białek powodujących represję genów.

Drogi regeneracji roślin w kulturze in vitro:

• Pośrednia przez Kalus

• Bezpośrednia

• Organogeneza:

  • Pędy, korzenie

• Somatyczna embriogeneza

  • Somatyczna

  • Gametyczna

Regeneracja na drodze organogenezy. Wszystkie morfogeniczne procesy prowadzące do powstania nieautonomicznych organów (pędów, korzeni, kwiatów) w kulturze eksplantatów. Regeneracja na drodze somatycznej embriogenezy – proces powstawania i rozwoju zarodków, jednoczesny i synchroniczny rozwój bieguna pędowego i korzeniowego, produktem jest autonomiczny zarodek, który nie jest połączony z eksplantatem naczyniami.

Typy kalusa różnią się potencjałem morfogenetycznym. Kalus wyprowadzony z jednego eksplantatu może różnić się potencjałem morfogenetycznym.

Zmiana aktywności specyficznych genów powoduje re-programowanie komórek eksplantatu/kalusa i regenerację pędów/korzeni/somatycznych zarodków.

Geny CUC kodują białko będące aktywatorem transkrypcji genów zaangażowanych w rozwój merystemu pędu (SAM). Nad ekspresją genów CUC zwiększa zdolności eksplantatów do regeneracji pędów.

Czynniki powodujące zmianę aktywności genów:

• Fitohormony/regulatory wzrostu

• Stres (temperatura, ciśnienie osmotyczne)

Stres (temperatura) indukuje embriogenezę (androgenezę) w mikrosporach rzepaku.

Organogeneza pędów in vitro (model wg. Christianson i Warnick, 1985)

• Nabycie kompetencji do organogenezy

• Indukcja pod wpływem zewnętrznych fitohormonów

• Determinacja komórek w kierunku wytworzenia określonego organu (korzenia, pędu) niezależnie od fitohormonów

CIM – tkanka nabywa kompetencji do odpowiedzi na czynniki stymulujące morfogenezę
SIM – ukierunkowanie odpowiedzi morfogenetycznej: wywarzanie pędów
RIM – ukierunkowanie odpowiedzi morfogenetycznej: wytwarzanie korzeni

Klasyfikacja zarodków:

1. Zygotyczne – powstają z zapłodnionego jaja

2. Nie-zygotyczne – powstają z innych, niż zygota komórek

   1. Somatyczne – powstają z komórek somatycznych (nie z zygoty) in vivo lub in vitro

      1. Przybyszowe – powstają bezpośrednio z innych zarodków lub organów

   2. Partenogenicznie – powstają z niezapłodnionego jaja

   3. Androgeniczne – powstają z męskiego gametofitu (mikrospor, ziaren pyłku)

Somatyczna embriogeneza (SE):

• Proces powstawania i rozwoju zarodków z tkanek somatycznych

• Jednoczesny i synchroniczny rozwój bieguna pędowego i korzeniowego

• Produkt – zarodek jest autonomiczny i niepołączony z eksplantatem naczyniami

• Pochodzenie zarodka jedno- lub/i wielokomórkowe

Cechy komórek embriogenicznych:

• Małe rozmiary

• Cienkie ściany

• Liczne małe wakuole

• Liczne ziarna skrobi

• Wyraźne amyloplasty

• Wysoka zawartość rybosomów

• Szorstkie ER

• Wysoka zawartość białek i RNA

• Wysoka aktywność dehydrogenaz

Czynniki warunkujące SE:

• Gatunek/genotyp

• Skład hormonalny (PGR) pożywki

• Typ eksplantatu

• Warunki fizyko-chemiczne kultury (np. światło)

Zastosowanie SE:

• Mikropropagacja roślin

• Transformacja genetyczna

• Produkcja sztucznych nasion

• Badania podstawowe nad genetyczną determinacją totipotencji u roślin (np. badania Arabidopsis)

Regeneracja roślin w kulturach in vitro służy:

• Praktyka – biotechnologia (regenerowanie in vitro roślin):

  • Klonalne namnażanie określonego genotypu (mikropropagacja)

  • Genetyczne modyfikacje roślinne (produkcja GMO)

  • Produkcji haploidów (kultury pylników, mikrospor, zalążków)

• Nauka – badania nad genetycznymi mechanizmami morfogenezy (totipotencji) komórek roślinnych.

19 III 214 r.

Mikropropagacja roślin – produkcja roślin z bardzo małych fragmentów tkanki lub komórek w warunkach aseptycznych i kontrolowanych.

Uzyskiwanie roślin drogą mikropropagacji służy:

• Szybkiemu uzyskiwaniu wielu klonów

• Eliminacja wirusów

• Wegetatywnemu namnażaniu gatunków „trudnych” w rozmnażaniu (długi cyk życiowy, trudności wiązania nasion)

• Namnażanie materiału niezależne od pory roku

• Sklonowanie elitarnego genotypu

Systemu kultury in vitro w mikropropagacji:

• Pobudzanie do wzrostu istniejących związków pędu – kultura merystemów pędu (bocznych lub kątowych; wierzchołkowych)

  • Kultury merystemów wierzchołkowych

  • Kultury pędów lub wierzchołów pędów

  • Kultury węzłów (pojedynczych lub wielu)

• Indukcja de novo pędów przybyszowych – somatyczna embriogeneza i organogeneza:

  • Bezpośrednia

  • Pośrednia, przez kalus

  • Kultura eksplantatów pędu

  • Kultura eksplantatów korzeni

  • Kultura kalusa

  • Kultura zawiesinowa

Metody mikrorozmnażania:

1. Pobudzenie do rozwoju pre-istniejących merystemów pędu

   1. Kultury merystemów, pąków i międzywęźli

   2. Kultura wierzchołków pędu i bocznych pąków (ca. 10 mm)

   3. Kultura merystemów wierzchołkowych/bocznych pędu (ca 0,2 – 0,5 mm)

   4. Kultura nasion – indukcja wielu nasion

   5. Kultura węzłów

2. Regeneracja de novo

   1. Indukcja pędów przybyszowych

      1. Organogeneza (bezpośrednia lub pośrednia)

      2. Somatyczna embriogeneza (bezpośrednia lub pośrednia)

Rozwijające się w kulturze pędy (stadium II) mogą być użyte, jako eksplantaty (wielokrotne subkultury zwiększają efektywność mikropropagacji).

Mikrorozmnażanie:

• Kultura wierzchołków pędu np. Vitis vinifera (winorośl) – 8000 roślin powstaje
  w ciągu 3-4 miesięcy z pojedynczego wierzchołka pędu.

• Formowanie pąków przybyszowych (rozwój de novo) – bezpośrednio lub pośrednio przez kalus = organogeneza): Liliaceae, Iridiaceae, Amaryllidiaceae, Gesneriaceae, Begoniaceae np. Begonia hiemalis daje 10¹⁴ roślin powstaje w ciągu roku z segmentu liścia o wymiarach 7x7 mm.

• Embriogeneza somatyczna dla Cyclamen persicum, Pseudotsuga menziesii, Pinus taeda, Picea abies, Medicago sativa oraz produkcja drzew leśnych Pseudodsuga menziesii, Pinus tadea, Picea abies np. Cyclamen persicum (Fiołek alpejski) daje 40 tys. zarodków somatycznych. Jest to efektywny sposób mikropropagacji drzew iglastych (świerk, sosna, jodła, modrzew).

• Technika kultury „cienkiej warstwy komórek” (TLC – Thin Cell Layer) stosowana np. w mikropropagacji Lilium sp. Eksplantaty: ultra cienkie (kilka mikrometrów) do kilku milimetrów skrawki tkanki. Daje wysoką efektywność regeneracji roślin na drodze: organogenezy pędów i zarodków somatycznych.

Czynniki warunkujące efektywność mikropropagacji:

• Gatunek/Genotyp

• System kultury in vitro:

  • Skład hormonalny (PGR) pożywki

  • Typ eksplantatu

  • Warunki fizyko-chemiczne kultury (np. światło)

Efektywność mikropropagacji – optymalizacja warunków eksplantatu, skład pożywki – zawartość azotu, zawartość sacharozy. Kolejne pasaże zwiększają liczbę pędów produkowanych przez eksplantat.

Etapy mikrorozmnażania:

1. Selekcja i przygotowanie rośliny matecznej

2. Ustalenie kultury

3. Namnażanie (proliferacja w kolejnych pasażach)

4. Przygotowanie do wzrostu w warunkach naturalnych (dalszy rozwój pędów i ukorzenianie in vitro)

5. Aklimatyzacja w warunkach ex vitro

Eliminacja wirusów – termoterapia + kultura wierzchołów pędów – inkubacja przez 3 tyg.: 16h światło 38^oC, 8h ciemności 36^oC. Skuteczność uzyskiwania wolnych od wirusów roślin zależy od wielkości eksplantatu pędu.

Eliminacja drobnoustrojów w procesie mikrorozmnażania jest ważna w gatunkach np. takich jak:

• Ziemniaki

• Goździki

• Germanium

• Czosnek

• Gypsohila

Problemy związane z mikropropagacja:

• Zmienność somaklonalna (genetyczna i epigenetyczna)

• Witryfikacja (tkanki w zamkniętych naczyniach sprzyjają różnym zaburzeniom rozwojowym)

• Konieczność kontroli sterylności materiału (monitoring mikrobiologiczny)

• Wysokie koszty siły roboczej

• Nasycający się rynek zbytu

• Konieczność wzbogacenia oferty nowymi gatunkami

Mikropropagacja roślin:

• Zmienność somaklonalna jest zjawiskiem niekorzystnym.

• Konieczność stosowania systemów regeneracji roślin minimalizujących zagrożenie zmianami somaklonalnymi:

  • Preferowane namnażanie z pre-istniejących merystemów pędów

  • Mijanie stadium kalusa (regeneracja bezpośrednia)

  • Krótki czas kultury

Zmienność somaklonalna – zmienność wykazywana, przez rośliny zregenerowane z tkanek/komórek somatycznych w warunkach kultury in vitro (Larkin i Scowcroft, 1981). Zmienność somaklonalna może mieć charakter genetyczny (mutacje) lub epigenetyczny (np. zmiany wzorów metylacji DNA, uczynnianie transpozonów). Rośliny zregenerowane w kulturze in vitro nie zawsze są identyczne genetycznie i fenotypowo z roślinami-dawcami tkanek/komórek kultury. Sposoby zmienności somaklonalnej – pre-istniejąca w eksplantacie lub powstała w trakcje kultury spontaniczne zmiany genetyczne i epigenetyczne zachodzące w trakcje kultury in vitro.

Czynniki wpływające na poziom zmian somaklonalnych:

• Długość trwania kultury in vitro

• Genotyp

• Typ eksplantatu (tkanki stare/młode)

• Typ kultury

• Typ morfogenezy in vitro (somatyczna embriogeneza/organogeneza; morfogeneza pośrednia/bezpośrednia)

• Skład pożywki (2,4-D)

Zjawisko niekorzystne w klonowaniu roślin (mikropropagacja, transformacja genetyczna) – konieczność jego ograniczania celem utrzymania „wierności genetycznej” regeneratów. Jest to tez zjawisko korzystne, jako nowe źródło zmienności genetycznej roślin.

Zmienność somaklonalna daje zmiany cytogenetyczne:

• Bardzo powszechne; związek z czasem kultury, ploidalności materiału wyjściowego; obecnością 2,4-D (indukuje siostrzana wymianę chromatyd)

• Prowadzą do:

  • Obniżenia/zaniku

2 IV 2014 r.

Otrzymanie i subkultura linii komórkowej

• Kultura (linia) pierwotna – kultura komórkowa otrzymana z tkanki

• Linia komórkowa – kultura pochodząca z kultury pierwotnej

• Subkultura – pasażowanie komórek, czyli przesiewanie komórek do nowego naczynia hodowlanego (po osiągnięciu pełnej konfluencji lub zgodnie z wymaganiami eksperymentatora)

Ewolucja linii komórkowej w celu hodowli in vitro

1. Wycięty fragment tkanki

2. Kultura tkankowa lub komórkowa in vitro

3. Kultura pierwotna (pasażowanie

4. Kultura drugorzędowa (pasażowanie)

5. Linia komórkowa

   1. Wyodrębniona jedna komórka

      1. Klonalna linia komórkowa

   2. Dalsze pasażowanie

      1. Starzenie i śmierć kultury

   3. Immortalizacja (utrata kontroli nad wzrostem komórek)

      1. Immortalizowana linia komórkowa

      2. Transformowana linia komórkowa

Sposoby zakładania hodowli pierwotnej.

• Narząd/wycinek tkanki

  • Siekanie na drobne kawałki – eksplantat (migracja i rozrost)

  • Dysagregacja mechaniczna np. sitko, strzykawka, ostre pipetowanie

  • Dysagregacja enzymatyczna

• Kultura pierwotna

Kultura in vitro komórek nasierdziowych z serca danio pręgowanego na żelu fibrynowym. Żel fibrynowy imituje skrzep krwi, fizjologicznie tworzący się po zranieniu tkanki, który ponadto jest konieczny dla prawidłowej migracji komórek. Procedura przygotowanie kultury – 5 godzin, komórki nasierdzia migrują w czasie 24-48 godzin; otrzymana kultura pierwotna może być utrzymana w hodowli przez 5-6 dni.

Kultura pierwotna otrzymana poprzez trawienie enzymatyczne. Integralność naskórka zapewniają połączenia międzykomórkowe – molekularne aspekty połączeń pomiędzy komórkami oraz komórkami, a podścieliskiem w naskórku. Połączenia przylegania i desmosomy zapewniają ścisłe przyleganie komórek do siebie. Hemidesmosome odpowiadają za połączenie z błoną podstawną.

Białka odpowiedzialne za oddziaływania komórka-komórka.

Międzykomórkowe połączenia przylegania (niezbędne w utrzymaniu tkanek stałych)

• Kadheryny – transbłonowe receptory adhezyjne zależna od Ca²⁺

• Kadheryny na jednej komórce wiążą…

Macierz zewnątrzkomórkowa (ang. Extracellular matrix, ECM) – mieszanina wypełniająca przestrzeń pomiędzy komórkami (powszechne składniki – fibroektyna, laminina, kolagen hialuornian, proteoglikany, czynniki wzrostu, cytokiny)

• Jest wytwarzana przez komórki, różne typy komórek wytwarzają mieszaniny różniące się składem – fibrocyty (tkanka łączna) w wydzielają kolagen I i fibronektynę. Komórki nabłonkowe wydzielają lamininę

• Komórki w hodowli wytwarzają własną swoją macierz zewnątrzkomórkową

• Niektórym kulturom pierwotnym oraz ustalonym liniom komórkowym należy dostarczyć macierz zewnątrzkomórkową (naczynia hodowlane pokrywane składnikami ECM)

• Ma znaczenie dla fenotypu komórek w tkance, pełni funkcję regulacyjne (wpływa na ekspresje genów)

Otrzymanie kultury pierwotnej wymaga zniszczenia połączeń między komórkowych i połączeń pomiędzy komórkami, a macierzą zewnątrzkomórkową.

Enzymy wykorzystywane do enzymatycznej dysrupcji tkanek:

• Proteazy – enzymy trawiące min. Białka macierzy zewnątrzkomórkowej

  • Trypsyna (z trzustki)

  • Kolagenza II (z Clostridum histolyticum)

  • Elastaza (produkowana przez neutrofile i trzustkę np. świńska)

  • Papina (z gumy Carica papaya)

  • Dispaza (naturalna proteaza z Bacillus polymyxa)

• Najczęściej stosowną jest kombinacja enzymów

  • Nieoczyszczone preparaty enzymów są zwykle bardziej wydajne

  • Im czystszy tym mniej toksyczny

  • Im brudniejszy tym bardziej efektywny dzięki zanieczyszczeniom innymi proteazami.

Enzymatyczna izolacja komórek pierwotnych z tkanki wymaga optymalizacji.

Izolacja ludzkich keratynocytów ze skóry

1. Fragment skóry pobrany sterylnie przez chirurga (transport w pożywce, 0-4h)

2. Pociąć na małe prostokąty, usunąć jak najwięcej tłuszczu (zachować szczególną ostrożność, MPI)

3. Umieścić w roztworze dispazy naskórkiem w dół (inkubacja – 12-24h, 4^oC)

4. Przy pomocy pincety ściągnąć naskórek (odchodzi łatwo jeśli ECM strawione)

5. Przepłukać i przenieść do roztworu trypsyny-EDETA (2x20 min, 37^oC)

6. Inaktywacja trypsyny, przeniesienie komórek do pożywki dla keranocytów (ocena liczebności, żywotności)

7. Hodowla (naczynia hodowlane pokrywane kolagenem IV)

8. Doświadczenia (np. sortowanie FACS w celu wzbogacenia w komórki macierzyste)

Różne enzymy do dysagregacji różnych rodzajów tkanek

Typ tkanki
Tkanka tłusczowa (adiopocyty)	Kolagenza I
Tkanka chrzętna (chondrocyty_	Kolagenza II, trypysna
Wąstroba (hepatycyty)	Kolagenza I

Hodowla z ekslantatu:

• Fragmentacja tkanki (nożyczki, skalpel(

• Umieszczanie fragmentów tkanki w naczyniu hodowlanym z pożywką

• Migracja komórek z eksplantatu na powierzchnię naczynia

• Pierwsza technika otrzymania linii komórkowych

• Obecnie stosowana w przypadku komórek wrażliwych na proteazy (komórek mięśni gładkich, osteaobliasty, osteocyty)

• Stosowana również w przypadku ograniczonych ilości dostępnej tkanki (bioptaty)

• Niebyt efektywna dla komórek o słabych zdolności do adhezji lub migracji (można stosować białka stymulujące adhezję – figynogen, trombina)

• Wady – selekcja komórek, w kulturze dominują komórki o większym potencjale migracyjnym i zdolności do przyczepiania, decyduje również lokalizacja w tkance

Separacja poprzez trawienie enzymatyczne

• Połączenia pomiędzy komórkami zachodzą dzięki obecności na ich różnych cząsteczek adhezyjnych

• Połączenia te można zniszczyć

• W celu przerwania połączeń zależnych od wapnia (kadheryny, selektyny) można stosować chelatory wapnia (EDTA, EGTA)

• Białka macierzy zewnątrzkomórkowej (fibronektyna, laminina) są wrażliwe na działanie proteaz (można je strawić)

• Trawienie całej tkanki umożliwia uzyskanie kultur komórkowej odzwierciedlającej heterogenie tkanki wyjściowej – bardziej reprezentatywna próba

• Selekcja w oparciu w wrażliwość komórek na trawienie enzymatyczne (tracimy komórki bardzo wrażliwe i bardzo odporne na stosowany enzym)

• Metoda szybka

Charakterystyka kultury pierwotnej

• Pochodzi bezpośrednio z tkanki zwierzęcej (embrionalnej lub dorosłej, normalnej lub rozrostowej)

• Hodowana, jako eksplantat tkankowy lub jako pojedyncze komórki

• Początkowo heterogenna

• Ograniczony czas życia in vitro

• Zachowuje fenotyp i poziom zróżnicowania komórek typowy dla tkanki

• Wzrost zależny od oddziaływania podłożem (z wyjątkiem komórek krwi)

• Wykazują inhibicję kontaktową

Holoklony – dają duże dobrze rosnące kolonie, tworzą mało kolonii o niskiej zdolności do proliferacji (mniej niż 5%)

Meroklony – dają duże dobrze rosnące kolonie oraz kolonie słabo proliferujące

Paraklony – dają tylko słabe rosnące kolonie.

Konwersja klonalna – razem ze starzeniem replikacyjnym ogranicza czas życia komórek macierzystych ludzkich keranocytów w hodowli komórek co prowadzi do postępującej utraty potencjału proliferyjnego. Holoklony z dużym potencjałem do wzrostu przekształcają się w meroklony, które zmieniają się w paraklony z ograniczonym wzrostem.

Proliferacja vs różnicowanie

• Proliferacja nie promuje różnicowania

• Różnicowanie często wymaga

  • Dużej gęstości komórek

  • Oddziaływań komórka-komórka

  • Oddziaływań komórka-macierz zewnątrzkomórkowa

  • Czynników różnicowania (białka, jony, inne)

• Warunki, w których zachodzi różnicowanie mogą być antagonistyczne dla proliferacji

Różnice w heterogenii pomiędzy kulturą pierwotną, a immortalizowaną linią komórkową.

Ewolucja linii komórkowej:

• Po pierwszym pasażu kultura pierwotna staje się linią komórkową (drugorzędową, wtórną)

• Do trzeciego pasażu (przeniesienie kultury, odczepianie itp.) linia stabilizuje się

Pasażowanie (subculture) polega na przeniesieniu komórek ze starego naczynia hodowlanego do nowych naczyń, zawierających świeża pożywkę.

Ewolucja linie komórkowej:

• Około 10 pasaży (ważny wiek i kondycja donora tkanki)

• Zahamowanie zrostu i starzenie

  • Skracanie telomerów

  • Terminalne różnicowanie

  • Warunki hodowli przyspieszają procesy starzenia naturalnie występujący in vivo

• Stała (ciągła) linia komórkowa powstaje w wyniku immortalizacji lub transformacji

Cytometria przepływowa:

• Technika pozwalająca na szybki pomiar światła rozproszonego lub sygnałów fluorescencji emitowanych przez odpowiednio naświetlone komórki

• Umożliwia ocenę jakościową oraz ilościową właściwości fizycznych i biologicznych komórek (jader, kwasów nukleinowych, antygenów)

• Odkryta, jako ulepszenie mikroskopu fluorescencyjnego

• Wysokość wydajność, można analizować różne parametry u dużej liczby komórek, w krótkim czasie.

Propagacja linii komórkowej – pasażowanie:

• Komórki powinny być przesiewane w fazie intensywnego wzrostu, zanim osiągną maksymalne zagęszczenie

• Optymalna konfluencja – nie więcej, niż 80%

• Podczas kolejnego pasażu krzywa wzrostu komórek zachowuje taki sam kształt (dla linie ciągłych)

Inhibicja kontaktowa:

• Inhibicja kontaktowa, hamowanie kontaktowe biol. Zjawisko polegające na zatrzymaniu ruchu, namnażania się lub wzrostu komórek w odpowiedzi na zatknięcie się błony komórkowej jednej komórki z powierzchnią innej komórki;

• Pojawia się w hodowli konfluentnej

• Indukuje terminalne różnicowanie komórek

	Kultura pierwotna
	Zachodzi	Zachodzi	Zachodzi	Brak
Naskórek	Populacja komórek po dezintegracji naskórka	Linia komórkowa normalnych ludzkich keranocytów (NHK)	Linia komórkowa HaCat – powstała z normalnych kretanotyctów w wyniku smpontanicznej immortalizacji (uptrata pgenu p53)

Immortalizacja vs transformacja

Immortalizacja

• Spontaniczna lub indukowana trwała zmiana fenotyp u będąca wynikiem zmiany dziedzicznej w DNA i ekspresji genów

• Zachodzi spontanicznie w wyniku inaktywacji genów kontrolujących starzenie i regulujących cykl komórkowy

• Jest efektem eksperymentalnego wprowadzenie genów kodujących białka hamujące aktywność białek regulujących cykl komórkowy lub genu kodującego telomerazę

• Nabycie zdolności do nieograniczonej liczby podziałów

• Zachowana inhibicja kontaktowa i zależność wzrostu od oddziaływania z podłożem

• Zmienione pewne aspekty regulacji zrostu i wzrostu niestabilności genetycznej, aneuploidia

• Mogą ulec terminalnego różnicowaniu, nie są tumorogenne, coc w pewnych warunek hodowli mogą zajeść dalsze zmiany genetyczne prowadzące do zyskania fenotypu nowotworowego

Transformacja

• Spontaniczna lub indukowana trwała zmiana fenotypu będąca wynikiem zmiany dziedzicznej w DNA i ekspresji genów

• Jest efektem:

  • Infekcji onkogennym wirusem (HPV 16/18, SV40)

  • Eksperymentalnego wprowadzenia aktywnych onkogenów

  • Spontanicznej mutagenezy

  • Powstaje na skutek ekspozycji na czynniki rakotwórcze, przykładowo promieniowanie jonizujące lub kancerogeny chemiczne

• Nabycie zdolności do nieograniczonej liczby podziałów

• Zaburzona kontrola wzrostu – utrata inhibicji kontaktowej i zależności wzrostu od przylegania do podłoża

• Niestabilność genetyczna, rearanżacje genetyczne widoczne w ilości chromosomów i zmianach w kariotypie

• Zaburzenia w ploidii (nie są diploidalne)

• Powodują przerzuty

Cel pasażowania?

• Utrzymanie komórek w hodowli (pamiętamy o inhibicji kontaktowej)

• Zwiększenie ilości komórek do doświadczeń

Jak?

• 70-80% konfluencji

• Płukanie w buforze PBS/EDTA, usunięcie martwych komórek, metabolitów, zużytej pożywki

• Stosując trypsynę trawimy połączenia pomiędzy białkami, a powierzchnia (można użyc innych proteaz)

• Chelatyzacja jonów wapnia (EDTA) nasila działanie trypsyny

• Zawszenie w pożywce z surowicą (inaktywacja trypsyny)

• Liczenie (hemocytometr lub automatycznie) lub rozrzedzenia w proporcjach właściwych dla linii 1:5- 1:20)

• Przeniesienie odpowiedniej liczby komórek do nowego naczynia (świeża pożywka)

• Komórki przytwierdzają się do podłoża w czasie od 3-24h.

Sferoidy:

• Hodowla przestrzenna 3D

• Rosną w warunkach uniemożliwionych im przyczepienie się do podłoża (w kropli wiszącej)

• Średnica powyżej 500 um

• Powstają w wyniku dalszego wzrostu agregatów komórek (średnica 250-500um)

• Sfera wzrostu komórek znajduje się na powierzchni sferoidy (grubość 100-300 um(

• Wewnątrz często nekroza

• Gradienty dostępności tlenu, składników odżywczych, stężenia metabolitów

• Dobry model do badania wpływu czynników odżywczych na wzrostu, metabolizm, zdolności proliferacyjne, żywotność i inwazyjność komórek

Hodowle organotypowe:

• Odtwarzają polaryzację typową dla tkanek (nabłonków)

  • Ułożenie przestrzenne