Klasyfikacja hodowli in vitro ze względu na rodzaj hodowanego materiału

Hodowle narządów:

• Utrzymywanie sferycznego lub trójwymiarowego kształtu

• Utrzymanie specyficznych interakcji histologicznych

Hodowle eksplantów:

• Fragmenty tkanek

• Po przyczepieniu następuje migracja komórek na powierzchnię naczynia

Hodowle komórkowe – hodowla rozdzielonych komórek:

• Przyczepione komórki jako monolayer

• Zawiesina komórek w pożywce

Klasyfikacja hodowli komórek in vitro ze względu na pochodzenie komórek i czas trwania:

• Hodowle pierwotne (pierwszorzędowe)

• Linie komórkowe:

1. Pierwotne linie komórkowe

2. Ustalone linie komórkowe

3. Transformowane linie komórkowe (unieśmiertelnione)

Hodowle pierwotne

Pochodzą bezpośrednio z tkanki lub narządu i są hodowane jako:

• Komórki migrujące w hodowli eksplantów

• Komórki wyizolowane przez dyspersję i wprowadzone do hodowli jako zawiesina (inoculum)

Zalety:

Zachowują wiele cech komórek zróżnicowanych podobnie jak in vivo, ale mogą zmieniać się w warunkach in vitro

Schemat powstawania hodowli pierwotnej

Narząd fragmenty tkanki lub narządu

Wady hodowli pierwotnej:

• Często wymagają uśmiercenia zwierzęcia

• Procedura zakładania hodowli pierwotnej jest zwykle czasochłonna i żmudna

• Mogą być utrzymywane w hodowli tylko przez określony i zwykle krótki czas

• Muszą być zakładane dla każdego eksperymentu

• Stanowią heterogenną populację komórek

• Ponieważ zwykle są heterogenne, stopniowo dochodzi do przerostu wszędobylskimi fibroblastami

Schemat powstawania hodowli narządów lub eksplantów

Narząd kawałeczki tkanki lub cały narząd izolacja/pocięcie tkanki lub narządu??

Charakterystyka hodowli pierwotnej eksplantów

• Fragment tkanki zanurzony w odpowiednio napowietrzonej tkanki

• Utrzymywana jest trójwymiarowa struktura (3D) oraz interakcje międzykomórkowe

• Ograniczenie stanowi rozmiar pozwalający na dyfuzję gazów i składników odżywczych (zwykle ok. 1 mm³)

• Ograniczona ilość eksperymentów

• Powolny i ograniczony jest rozrost tkanek

• Hodowla może być wykorzystywana do wyprowadzenia hodowli komórek

Rys 2

Izolacja komórek

Polega na oddzieleniu komórek od macierzy międzykomórkowej i uzyskaniu zawiesiny pojedynczych komórek

Metody izolacji i rozdzielania komórek

• Mechaniczna (skrobanie, przecieranie przez sitka)

• Enzymatyczna – trawienie enzymami proteolitycznymi (kolagenaza, trypsyna)

• Wirowanie w gradiencie (np. surowicy, perkolu, fikolu)

• Sortery (np. cytofluorymetr przepływowy)

Izolacja mechaniczna + enzymatyczna komórek z tkanek z dużą ilością włókien kolagenowych

Rys 3

Rozdział komórek przez wirowanie

• W gradiencie prędkoci – frakcje wędrują w zależności od ciężaru – im mniejsza frakcja tym większej prędkości trzeba użyć

• W gradiencie gęstości – frakcje wedrują w zależności od rozmiaru i kształtu, gdy użyje się niskiego gradientu cukru (5 – 20%); w zależności od gęstości frakcji, gdy użyje się wysokiego gradientu cukru (20 – 70%)

Liczenie komórek

• Hemacytometry np. komora Bürkera

• Automatyczne liczniki komórek

Określenie żywotności komórek

Stosowane barwniki:

• Błękit trypanu – komórki martwe – niebieskie jądra

• Bromek etydyny – komórki martwe – jądra czerwone

• Jodek propydyny – komórki martwe – jądra czerwone

• Dwuoctan fluoresceiny – komórki żywe – zielona fluorescencja cytoplazmy

Obliczanie ilości komórek./ml

Całkowita liczba policzonych komórek x (rozcieńczenie) x (10,000)

liczba kwadratów

Np. jeśli policzyliśmy np. 62 komórki, rozcieńczenie wynosiło 1 : 1, a ilość policzonych kwadratów np. 10 to:

62/10 x 2 x 10⁴ = 1.24x10⁵ czyli 124 000 komórek na 1 ml

Oznaczenie @ żywotności komórek

Ilość komórek żywych x 100%

Całkowita ilość komórek

Np. 54/62 x 100 = 87.09%

Zawiesina:

• Komórki rosną pływając w pożywce

• Mogą proliferować w zawiesinie (niezależnie od przyczepienia)

Monolayer (metoda 1 warstwy)

• Komórki przyczepione do podłoża migrują/proliferują

• Są zależne od przyczepienia

• Sposób wzrostu charakterystyczny dla większości komórek

Adhezja komórek

• Odbywa się dzięki obecnym na ich powierzchni receptorom dla cząsteczek matrix pozakomórkowego

• Rozpłaszczenie komórek zaczyna się w momencie, kiedy wydzielą one specjalne białka i proteoglikany, tworzące matrix np.fibronektynę, lamininę, kolagen

• Substancje te wiążą się z podłożem, a dopiero do nich wiążą komórki

• W wiązaniu komórek z podłożem biorą również udział białka pochodzące z surowicy dodawanej do medium

Identyfikacja komórek

Komórki identyfikuje się biorąc pod uwagę:

• Kariotyp

• Antygeny powierzchniowe – immunohistochemiczne

• Elementy cytoszkieletu – immunohistochemia, immunofluorescencja

• Markery – PCR, western

Zalety i wady hodowli komórek rosnących w systemie dwuwymiarowym (2D)

Zalety:

• Łatwe w stosowaniu przez relatywnie długi czas

• Wystandaryzowane protokoły hodowli

Wady:

• Nie są reprezentatywne dla warunków in vivo

Hodowle w zawiesinie i hodowle trójwymiarowe