Antybiotyki - substancje chemiczne wytwarzane przez drobnoustroje i mające w dużych rozcieńczeniach zdolność zabijania lub hamowania wzrostu innych drobnoustrojów - pierwsza definicja (Waksman S.A. 1942)
„Antybiotyki są małocząsteczkowymi substancjami naturalnymi, najczęściej pochodzenia drobnoustrojowego lub ich półsyntetycznymi modyfikacjami albo syntetycznymi analogami, które w małym stężeniu działają wybiórczo na struktury i procesy biologiczne, hamując wzrost lub rozmnażanie komórek” - definicja współczesna
Miejsce i sposób oddziaływania antybiotyków
- Synteza kwasów nukleinowych - replikacja DNA lub synteza RNA
- Synteza białka na rybosomach
- Transport przez błony biologiczne
- Synteza składników ściany komórkowej
- Procesy energetyczne
Zakres działania antybiotyków
- Aktywność przeciwbakteryjna
- Aktywność przeciwgrzybowa
- Aktywność przeciwwirusowa
- Aktywność przeciwnowotworowa
- Aktywność immunosupresyjna
- Aktywność przeciwrobacza
- Aktywność przeciwpierwotniakowa
- Aktywność insektycydowa
- Aktywność herbicydowa
Podział antybiotyków ze względu na budowę chemiczną
- Pochodne aminokwasów (antybiotyki β-laktamowe, polipeptydowe, glikopeptydowe, lipo peptydowe
- Pochodne cukrów (amino glikozydy, glikolipidy)
- Antybiotyki makrocykliczne (makrolidy właściwe, makrolidy polienowe)
- Chinony i ich pochodne (antracykliny, tetracykliny, benzochinony)
- Inne antybiotyki: nukleozydy, polietery, związki aromatyczne, związki steroidowe, związki fosfoorganiczne
Proces biotechnologiczny wytwarzania antybiotyków
Przygotowanie wyjściowego materiału posiewowego w hodowli wgłębnej
Podłoża zawierają łatwo przyswajalne organiczne źródła węgla i energii, np. glukozę, sacharozę, surowce skrobiowe; źródło azotu - np. jony amonowe i azotanowe, wyciągi mięsne; zestaw soli nieorganicznych
Poza tym podłoża wzbogacone są w kompleksowe surowce, takie jak namok kukurydziany, wyciągi lub hydrolizaty mięsne, wyciągi drożdżowe
Podłoże uzupełniane jest dodatkiem CaCO3, w celu neutralizacji powstających kwasów organicznych
I etap w kolbach wstrząsanych
II etap w bioreaktorach
Proces biosyntezy antybiotyków
Prowadzenie hodowli drobnoustrojów w bioreaktorze z mieszaniem i napowietrzaniem w podłożu zapewniającym pełne wykorzystanie metabolicznego potencjału szczepu produkcyjnego
Podstawowym składnikiem podłoża jest źródło węgla i energii, wykorzystywane do namnażania komórek i syntezy energii, wykorzystywane do namnażania komórek i syntezy produktu: monosacharydy i disacharydy (sacharoza, laktoza)
Źródło azotu: sole amonowe, woda amoniakalna, najczęściej mąka sojowa lub kukurydziana oraz namok kukurydziany
Zestaw soli mineralnych
CaCO3 jako czynnik neutralizujący powstające kwasy organiczne
Podłoża produkcyjne mogą zawierać specjalne składniki, takie jak czynniki wzrostowe (wybrane aminokwasy i witaminy) i prekursory produktu końcowego
Wyodrębnienie antybiotyków z zawiesiny pohodowlanej oraz ich oczyszczanie i rozdzielanie
Derepresja - w fazie wzrostu logarytmicznego następuje represja enzymów odpowiedzialnych za biosyntezę antybiotyków (nie są potrzebne) (represja kataboliczna). W fazie stacjonarnej komórki nie rosną już tak intensywnie, w takich warunkach następuje derepresja syntezy enzymów (odblokowanie represji syntezy enzymów z fazy wzrostu logarytmicznego)
Mechanizmy represji (derepresji) katabolicznej w biosyntezie antybiotyków
- Efekt glukozowy - (nie tyle glukoza, ale stężenie głównego węglowodanu wytwarzanego przez komórkę jest istotne). Gdy stężenie węglowodanu jest zbyt wysokie, dochodzi do wzrostu biomasy, a nie syntezy antybiotyków. Wszystkie mikroorganizmy, jeżeli w środowisku jest glukoza, będzie ona pierwsza wykorzystana do wzrostu (stąd glukoza w nazwie efektu). Gdy stężenie jest wysokie, następuje namnażanie się komórek; gdy stężenie jest niskie, przechodzą w idiofazę, fazę stacjonarną, dochodzi do syntezy antybiotyków.
Laktoza jest wykorzystywana w fazie stacjonarnej (komórka nie ma szans wejść w fazę wzrostu logarytmicznego.
Efekt glukozowy to odpowiednie stężenie węglowodanu obecnego w danym momencie w środowisku. Musi ono być niskie, aby komórki nie przechodziły w produkcję biomasy, ale pozostawały w fazie stacjonarnej (idiofazie)
- Represja biosyntezy związana z nadmiarem jonu amonowego w podłożu (główne źródło azotu, oprócz mocznika, aminokwasów, ale także kwasów nukleinowych czy białka) - będzie jako pierwszy wykorzystywany jako źródło azotu. Przy dużym stężeniu wzrost logarytmiczny (jak w efekcie glukozowym). Aby doszło do de represji katabolicznej, musi dojść do niedoboru jonu amonowego
- Represja biosyntezy związana z nadmiarem jonu fosforanowego w podłożu (stężenie nie powinno przekraczać 10 mmol/dm3, a czasami powinno wynosić nawet poniżej 1 mmol/dm3) - jon fosforanowy jest wykorzystywany do produkcji ATP, gdy jest dużo ATP, następuje produkcja biomasy;
Mechanizmy sprzyjające syntezie antybiotyków (autoregulatory) - Czynnik A (lakton kwasu 2-izokapronoilo-3-hydroksymetylo-4-hydroksybutanowego) wytwarzany przez szczepy Streptomyces griseus produkujące streptomycynę
Przechowywanie kultury macierzystej w bankach kultur:
- Przechowywanie mikroorganizmów w pożywce lub na podłożu stałym w niskiej temperaturze (2-6oC). Metoda ta wymaga jednak częstego przeszczepiania (raz na 8-16 tygodni) oraz charakteryzuje się dużym zagrożeniem (zakażenia, mutacje)
- Suszenie w temperaturze pokojowej pod normalnym ciśnieniem; pod zmniejszonym ciśnieniem w obecności czynnika pochłaniającego wodę (np. P2O5); na drodze sublimacji ze stanu głębokiego zamrożenia. Na przykład suszenie hodowli bezpośrednio na podłożu wzrostowym (grzyby strzępkowe i promieniowce)
- Zamrożenie (1oC/min lub lepiej szybciej) oraz przechowywanie kultury macierzystej w stanie zamrożonym (od -18oC do -80oC) lub w ciekłym azocie (w temperaturze -196oC). Stosuje się tu substancje ochronne, takie jak: serwatka, bulion, mleko, pepton, żelatyna, surowica krwi, węglowodany w postaci roztworów glukozy, sacharozy, laktozy i dekstranu, roztwory aminokwasów, jak kwas asparaginowy, glicerol. Ten sposób umożliwia przechowywanie kultur przez kilka lat. (pobiera się z początku fazy stacjonarnej)
1. Liofilizację (oziębienie i zamrożenie zawiesiny komórek w temperaturze -70oC, a następnie wysuszenie jej w wysokiej próżni) bezpośrednio w podłożu hodowlanym lub po uprzednim zawieszeniu w odpowiednich roztworach zawierających czynniki ochronne - krioprotektanty (sacharozę, odtłuszczone mleko w proszku, glicerol, surowicę końską). Proces liofilizacji umożliwia przechowywanie kultur w hermetycznych ampułkach przez wiele lat
2. Rozmrożenie (1oC/min, najlepiej w łaźni wodnej o temperaturze 40oC) lub uwodnienie kultury (zaszczepu) macierzystej
3. Przygotowanie zaszczepu roboczego (ożywianie zaszczepu macierzystego)
I etap: hodowla na skosach lub płytkach Petriego, tzn namnażanie na podłożu stałym
II etap: przeniesienie kultury z podłoża stałego na pożywkę płynną przez dokonanie zmywania lub przeniesienie „kłaczka”
III etap: przeniesienie kultur namnożonych na pożywkach płynnych (zaszczepu macierzystego) do większej objętości pożywki zaszczep roboczy (butelki „Roux”, kolby stożkowe)
4. Przetrzymywanie zaszczepu roboczego w optymalnych warunkach stacjonarnych, okresowo mieszając lub ciągle wytrząsając przy użyciu wytrząsarek (w zależności od wymogów kultury drobnoustrojów) zaszczep roboczy pierwszy
5. Zaszczep roboczy drugi i dalsze w wyniku kolejnych pasaży
6. Czasami przed kolejnym pasażem lub zaszczepieniem do produkcji stosuje się regenerację (aktywację kultury, np.
- W przypadku drożdży hodowlanych: silne zakwaszenie środowiska
- W przypadku grzybów pleśniowych: przeztrzymywanie grzybni w formie wegetatywnej przez pewien czas w warunkach, które nie sprzyjają rozwojowi, np. w niskiej temperaturze
- W przypadku przygotowywania zakwasów mleczarskich (na przykładzie mikroflory zakwasu do ukwaszania śmietanki): 2-3 krotne rozcieńczenie zaszczepu świeżo spasteryzowanym, schłodzonym mlekiem odtłuszczonym i przetrzymywanie przez 1 godzinę w temperaturze 26-30oC
7. Zaszczepienie do produkcji