Oczyszczanie lakazy z Cerrena Unicolor
Karolina Linowska, Katarzyna Lisowska, Jakub Knurek
1. WSTĘP TEORETYCZNY:
LAKAZA (EC 1.10.3.2) należy do dużej grapy enzymów określanych jako miedzioproteidy, czyli zawierające atomy miedzi w centrum aktywnym. Centrum aktywne enzymu zawiera 4 sąsiadujące ze sobą atomy miedzi, które warunkują aktywność katalityczną lakazy oraz reprezentują one 3 typy wyróżnione ze względu na swoje specyficzne właściwości. Typ I miedzi, którego forma utleniona wykazuje absorbancję przy długości fali 610 nm, nadaje niebieski kolor cząsteczkom enzymu (lakaza nazywana jest niebieską oksydazą) oraz miejscem utleniania substratu. Miedź typu II i 2 atomy miedzi typu III tworzą trójatomowy zespół, w którym zachodzi wiązanie i redukcja tlenu cząsteczkowego do wody.
Lakaza występuje w roślinach wyższych, grzybach, niektórych bakteriach i owadach.
Lakaza to enzym o stosunkowo niskiej specyficzności substratowej zależnej w dużym stopniu od źródła, z którego wyizolowano enzym. Lakaza jest w stanie utlenić każdy aromatyczny związek będący donorem wodoru - katalizuje usunięcie elektronu i protonu z grupy hydroksylowej fenolu lub aromatycznej grupy aminowej, by w konsekwencji utworzyć odpowiednie wolne rodniki fenolowe i aminowe.
E-Cu2+ + AH2 → ECu+ + (AH2)+
gdzie: E - enzym
AH2 - substrat
(AH2)+ - substrat utleniony
W końcowej fazie katalizy następuje utlenienie zredukowanego enzymu kosztem cząsteczkowego tlenu, przy współudziale pochodzących z substratu protonów:
E-Cu+ + ½O2 + H+ → E-Cu2+ + ½H2O
Lakaza pełni bardzo istotne funkcje biologiczne:
- Uczestniczy w procesach biosyntezy ligniny u roślin wyższych.
- Uczestniczy w regeneracji uszkodzonych części komórek roślin wyższych.
- Bierze udział w relacjach patogen – żywiciel.
- Spełnia istotną rolę w detoksyfikacji środowiska naturalnego.
- Bierze udział w procesie mikrobiologicznej depolimeryzacji ligniny.
Lakaza produkowana jest jako zewnątrz- i wewnątrzkomórkowy enzym i może być wykorzystywana w wielu gałęziach przemysłu. Lakaza zewnątrzkomórkowa zachowuje wysoką aktywność w czasie przechowywania w formie zamrożonej. Enzym ten oczyszczamy technikami chromatograficznymi. Lakaza jest również używana w przemyśle spożywczym, papierniczym, odzieżowym oraz biotechnologii. Bierze udział w degradacji ksenobiotyków oraz odpadów przemysłowych, klarowaniu wina, soków i piwa. Produkcji kosmetyków i etanolu. Do konstrukcji biosensorów, w diagnostyce klinicznej i ochronie środowiska, bioogniw oraz w medycynie.
2. OMÓWIENIE TEORETYCZNE ZASTOSOWANEJ METODY (chromatografia sitowa/ sączenie molekularne)
CHROMATOGRAFIA SITOWA (żelowa, sączenie molekularne) - podstawę podziału stanowią różnice w rozmiarach cząsteczek – rozdział zachodzi na skutek różnicy mas cząsteczkowych rozdzielanych związków.
Chromatografia żelowa stosowana jest do rozdziału białek różniących się masą cząsteczkową lub do oddzielania białek od składników niskocząsteczkowych np. sole (odsalanie) lub związki używane do znakowania białek np. J125, fluoresceina.
Kolumnę chromatograficzną wypełnia się złożem w postaci ziarenek o średnicy około 0,1 mm o zdefiniowanej wielkości porów zbudowanych z nierozpuszczalnego polimeru (typu: dekstran, agaroza) lub poliakrylamidu.
Teoria filtracji żelowej:
- cząsteczki o określonych rozmiarach dyfundują w głąb ziaren żelu tylko na określoną głębokość
- większe cząsteczki są eluowane wcześniej niż mniejsze
- faza nieruchoma = rozpuszczalnik zalegający wnętrze ziaren żelu
- faza ruchoma = rozpuszczalnik przemieszczający się pomiędzy ziarnami żelu
Po nałożeniu na żel mieszaniny, białka o małych rozmiarach wnikają do wnętrza ziaren duże natomiast nie mogą. Droga do momentu wycieku z kolumny, którą musi pokonać każdy ze składników próbki jest więc nierówna. Cząsteczki o najmniejszym ciężarze cząsteczkowym mają do pokonania najdłuższą drogę i dlatego wypływają najpóźniej z kolumny. Białka o dużej masie cząsteczkowej i o efektywnej średnicy większej niż pory ziaren złoża mają do pokonania krótszą drogę w żelu i wędrują najszybciej. Pojawiają się zatem jako pierwsze u wylotu kolumny.
Warunki rozdziału:
Do filtracji żelowej najczęściej stosuje się kolumny o długości 50-90 cm, wraz ze wzrostem długości kolumny zmniejsza się szybkość rozdziału białek.
Objętość nakładanej próby nie powinna przekraczać 5% całkowitej objętości kolumny.
Skład buforu elucyjnego nie wpływa bezpośrednio na rozdział białek, ale w celu zmniejszenia oddziaływań jonowych pomiędzy złożem a rozdzielanymi związkami nie stosuje się buforów o sile jonowej słabszej niż 0,02M.
3. Wykonanie:
- opis żelu Sephadex G-25 (dlaczego właśnie on jest używany do odsalania białek?)
- jak i po co wykonuje się kalibrację? (Blue Dextran/ dwuchromian potasu)
- zasada przygotowania buforów McIlvine’a (dlaczego wykonujemy tak dużo różnych buforów?)
- opis wykonania z uwzględnieniem zmienionych jednostek na ćwiczeniach (np. przy spektrofotometrze factor = 2564, interwał = 15 s, czas trwania pomiaru = 60 zamiast 120 s, długość fali – 525 nm, etc.)
- opis metody Leonowicz & Grzywnowicz – wystarczy wzór ze skryptu
- dlaczego używa się spektrofotometru i syryngaldazyny? (obserwacje)
- przypuszczalne wyniki oparte o źródła literaturowe
4. Wyniki:
- Tabela przedstawiająca aktywność w danym pH:
| pH | Próbka nr I | Próbka nr II | Średnia wartość |
|---|---|---|---|
| 3,5 | - 27,39 | - 1646,7 | 0 |
| 4,0 | - 3212, 8 | - 40,484 | 0 |
| 4,5 | 32258 | 54005 | 43131,5 |
| 5,0 | 47095 | 37864 | 42479,5 |
| 5,5 | 69117 | 70630 | 69873,5 |
| 6,0 | 71802 | 80716 | 76259 |
| 6,5 | 36821 | 39105 | 37963 |
| 7,0 | 11935 | 10659 | 11297 |
Wniosek: Optimum aktywności lakaza osiąga w ph 6,0.
- Wykres zależności aktywności lakazy od pH:
- Wydajność oczyszczenia:
| pH | Próbka nr I | Próbka nr II | Średnia wartość | Opis |
|---|---|---|---|---|
| 5,5 | 69117 | 70630 | 69873,5 | Próbka oczyszczona |
| 5,5 | 102720 | 74243 | 83481,5 | Próbka nieoczyszczona |
Próbka nieoczyszczona była rozcieńczana 50-krotnie i miała objętość 2 ul.
Próbka oczyszczona była rozcieńczana 10-krotnie i miała objętość 10 ul.
Wydajność oczyszczania (W) to wskaźnik, który pokazuje nam efektywność stosowanej metody. Określany jest on na 1 ml substancji o określonej aktywności z uwzględnieniem rozcieńczenia.
W = [(69873,5*10*10)/(83481,5*50*10)] * 100% = 6987350/41740750 * 100% = 16,74%
PS. Coś mały ten wskaźnik, ale błąd mógł się wkraść zarówno w trakcie pomiaru, jak i w obliczeniach. Uwzględniłem przeliczenie (*10) spowodowane błędem aparatu pomiarowego.