Sprawozdanie z ćwiczeń laboratoryjnych

Oznaczanie aktywności peroksydazy w obecności i nieobecności inhibitora – wyznaczanie stałych kinetycznych, Oznaczanie kwasowości	17.12.2013r.

ĆWICZENIE 1: Oznaczanie aktywności peroksydazy w obecności i nieobecności inhibitora – wyznaczanie stałych kinetycznych

Wstęp teoretyczny :

Peroksydazy to grupa enzymów należących do klasy oksydoreduktaz (katalizujących procesy utleniania i redukcji), przy czym peroksydazy katalizują utlenianie substratów nadtlenkiem wodoru. Do badania aktywności peroksydazy jako substratu używa się pirogalolu, który utleniany jest w obecności nadtlenku wodoru do barwnego produktu – purpurogaliny.

Do oznaczenia aktywności enzymu wykorzystuje się pomiar absorbancji przy stałej długości fali w spektrofotometrze, jej wartość jest proporcjonalna do stężenia powstającej purpurogaliny – to pozwala na wykonanie obliczeń.

Zakłada się, że inhibitory jako związki hamujące szybkość reakcji enzymatycznych będą ograniczać aktywność peroksydazy. Inhibitorem stosowanym do reakcji utleniania pirogalolu jest azydek sodu.

Odczynniki i materiały:

Korzenie chrzanu, nadtlenek wodoru, azydek sodu, roztwory pirogalolu o stężeniach 0,001 M, 0,005 M, 0,01 M i 0,02 M

Przebieg wykonania doświadczenia :

Z utartego korzenia chrzanu wyciśnięto sok do zlewki, następnie rozcieńczono wodą w stosunku 1:1 po czym pozostawiono na kilka minut do opadnięcia osadu. Powstały ekstrakt wykorzystywano w części dalszej doświadczenia.

W statywie przygotowano dwa zestawy po cztery probówki (w dwóch szeregach); pierwszy na roztwory do reakcji bez inhibitora, a drugi na roztwory do reakcji z inhibitorem. Do każdej probówek odmierzono po 0,8 ml roztworu nadtlenku wodoru. Następnie do pierwszej pary probówek odmierzono po 0,8 ml roztworu pirogalolu o stężeniu 0,001 M, do drugiej pary próbówek 0,8 M roztworu pirogalolu o st. 0,005 M, natomiast do trzeciej i czwartej pary probówek po 0,8 M roztworu pirogalolu o st. kolejno 0,01 i 0,02 M. Do zestawu probówek pierwszego szeregu (przeznaczonego na reakcję bez inhibitora) odmierzono po 0,2 ml wody, natomiast do drugiego zestawu (przeznaczonego na reakcję z inhibitorem) odmierzono po 0,2 ml roztworu azydku sodu.

Roztwór bez inhibitora zawierający pirogalol o stężeniu 0,001 M przelano do kuwety, po czym odmierzono do niego 0,2 ml roztworu enzymu, wymieszano i po 5 sekundach rozpoczęto rejestrację zmian absorbancji w czasie przy długości fali 420 nm. przy użyciu spektrofotometru „Marcel MINI”. Podczas rejestracji 1-minutowego przebiegu reakcji spisano wartości absorabancji kolejno w 5, 10, 15 i 20 sekundzie. Po upływie minuty kuwetę wyciągnięto z urządzenia i przepłukano, po czym przeprowadzono analogiczne pomiary kinetyczne dla roztworów o coraz wyższych stężeniach pirogalolu. Procedurę powtórzono dla zestawu przeznaczonego na reakcję z inhibitorem.

Pomiary i obliczenia :

Wartość absorbancji bez inhibitora:

Stężenie Czas	0,001	0,005	0,01	0,02
Po 5 sek.	0,144	0,177	0,217	0,168
Po 10 sek.	0,149	0,188	0,244	0,198
Po 15 sek.	0,163	0,220	0,253	0,207
Po 20 sek.	0,181	0,225	0,272	0,215

Wartość absorbancji z inhibitorem:

Stężenie Czas	0,001	0,005	0,01	0,02
Po 5 sek.	0,120	0,167	0,168	0,225
Po 10 sek.	0,139	0,176	0,190	0,240
Po 15 sek.	0,142	0,194	0,205	0,259
Po 20 sek.	0,154	0,200	0,216	0,268

Wnioski :

ĆWICZENIE 2: Oznaczanie kwasowości

Odczynniki i materiały:

Odbiałczony sok jabłko Antonówka 100% z miąższem firmy Tymbark, mianowany roztwór NaOH (0,1 M), fenoloftaleina (0,1% roztwór alkoholowy), HCl (1 M), kolumna kationowymienna.

Oznaczanie kwasowości potencjalnej.

Przebieg wykonania doświadczenia :

• Sok odbiałczono poprzez ogrzewanie w łaźni wodnej przez…. min, następnie wirowano
  10min, 5000obr./min.

• Do kolby stożkowej odmierzono 20ml dwukrotnie rozcieńczonego soku.

• Roztwór miareczkowano 0,1 M NaOH w obecności fenoloftaleiny. Miareczkowanie zakończono po uzyskaniu jasnoróżowej barwy.

Pomiary i obliczenia :

Do miareczkowania zużyto 7ml 0,1M NaOH.

1M NaOH – 67mg C₄H₆O₅ (kwas jabłkowy)
0,1M NaOH – x mg C₄H₆O₅
x = 6,7mg C₄H₆O₅

1ml 0,1M NaOH - 6,7mg C₄H₆O₅
7ml 0,1M NaOH – y mg C₄H₆O₅
y= 46,9mg C₄H₆O₅

46,9mg C₄H₆O₅ – 20 ml soku
z mg C₄H₆O₅ – 100ml
z= 234,5 mg C₄H₆O₅

Kwasowość potencjalna soku wynosi 234,5mg C₄H₆O₅/100ml ( 2345mg C₄H₆O₅/1dm³).

1. Oznaczanie kwasowości całkowitej:

Przebieg wykonania doświadczenia:

• 10 ml odbiałczonego soku nałożono na kolumnę kationowymienną w celu usunięcia kationów

• Kolumnę przemyto 20 ml wody destylowanej

• Zebrany do zlewki płyn miareczkowano 0,1 M NaOH w obecności fenoloftaleiny

• Obliczono kwasowość całkowitą

Pomiary i obliczenia:

X = V_NaOH × C_NaOH × 10

X – kwasowość całkowita

V_NaOH = 4,5 cm³ = 0,0045 dm³ – objętość roztworu NaOH użytego do miareczkowania

C_NaOH = 0,1 M – stężenie roztworu NaOH użytego do miareczkowania

0,1 mola NaOH – 1000 cm³

X – 25 cm³

X = 0,0025 mola NaOH

1 mol NaOH – 40 g

0,0025 mola – X

X = 0,1 g

40 g NaOH – 1000 cm³

X – 1 cm³

X = 0,04 g NaOH

1 cm³ NaOH – 0,04 g

4,5 cm³ NaOH – X

X = 0,18 g

0,18/

X = 0,0045 dm³ × 0,1 mol/dm³ = 0,00045 mol

Kwasowość całkowita roztworu wynosi 0,00045 mol.