PCR

amplkon-produkt reakcji pcr

RAPD PCR - wykorzystywany gdy nie zamy sekwencj starerw, zaprzecza wszystkim znanym zasadm o PCR

• polimorfizm losowo amplifikowanych fragmentow DNA, DNA amplifikowane jest przy uzyciu jednego wybranego startera (dlugosc max 10 nukleotydow, zawartosc par G/C musi byc w granicach 50-80%, nie moze zawerac sekwencji palindromowych)

• przebieg: po denaturacji helisy DNA, nastepuje hybrydyzacj nici DNA ze starterem - w ej czasie nasz starter moze przylaczyc sie w wielu miejscach, pozniej nastepuje elongacja starterow, ale namnozy sie tylko taki fragment, ktory jest zamniety starterem z obu stron.

• po amplifikacji z wybrnym starterem otrzymujemy kilka do kilkunastu prazkow roznej dlugosci da danego osobnika

• jakosc danego produktu jest nam nieznana

• sluzy do zgrubnej identyfikacji gatunkow/szczepow bakterii dotad nam nie znanych

• wada: mala powtarzalnosc, wynik reakji zalezy od stosowanych narzedzi

Nested PCR (zagniedony PCR) - zastosowany przy niespecyficzne amplifikacji okreslonego fragmentu, najpierw przeprowadzay reakcje pcr na DNA jadrowym, pozniej na produkcie pierwszego PCR

• pierwszy starter przylacza sie bardzo specyficzne drugi starter przylacza sie gdzies

• otrzymujemy niespecyficzne produkty reakcji PCR, ktorych trzeba sie pozbyc, nic nie moze byc poza produktami secyficznymi PCR

• co robimy z niespecyficznymi - dodajemy druga pare starerow, ktora bedzie hybrydyzowala w obrebie pierwszyc starterow

• wada: zawsze otrzymamy produkt krotszy, niz zakladany

• kiedy: startery od innego gatunku

Multipleks PCR - wykorzystywany do ednoczesnej amplifikacji wielu fragmentow, w rekcji stosuje sie do 20 par starterow znakowanyh fluorescencyjnie (kiedy: typowy figerpriting)

-kiedy nie wyjdzie nam normalne PCR, robimy Multipleks PCR

• mamy wiecej produktow procesu

• dokladamy startery

• co kiedy dwa fragenty maja zbizona dlugosc? - w reakcji multipleks startery powiny byc znakowane (czyli do jego konca 5' przylaczamy fluorochrom)

• wykonujemy inny rodzaj elektroforezy

Allelo - specyficzny PCR - wykorzystywany do mutacji punktowych SNP, pozwala namnozyc inny ragment w zaleznosci od zaistnienia mutacji, stosuje sie trzy startery - w reakcji obserwujemy produkt, badz jego brak, mamy znakowanie fluoresencyjne

• ten typ reakcji wykonujemy, kiedy wiemy wszystk o matrycy

• wykorzystywany w diagnostyce

• starter 3 - neutralny, starter 1 i 2 zalezny od mutacji

• otrzymane produkty PCR sa wybarwione

• modyfikacja startera - przylacznie fluorochromu do konca 5' startera

Real Time PCR - wykorzystywany obserwowania przyrostu produktu PCR w czasie, pozwala na wykrycie amplifikacji na kilku kopiach matrycy - mozemy podejrzec w czasie trwania reakcji ile amplikonu powstaje w jakim czasie - NIGDY nie skracamy nazewnictwa tej reakcji

• inerkalacja - SYBR green

  • specyficznosc reakcji zalezna jest od starterow

  • nie umozliwia przeprowadzenia reakcji typu multipleks - bo emituje zawsze jedna dugsc fali, czyli mamy jeden kolor

  • umozliwia zabserwowane dodatkowych produktow - przy niespecyficznych starterach

  • zfalszowanie w odczycie fluorescencji (dimery, wszystkie dwuniciowe konformacje) - wielkosc wykrywanych produktow dla roznych genow musi byc bardzo zblizona

  • SYBR green bedzie interkalowal z nowopowstalymi czastkami DNA

  • bardzo tanio

  • primer dimer - produkt reakcji dwoch starterow hybrydyzujacych ze soba - SYBR nie roznicuje, wiec moze byc bledny odczyt

• Transfer energii rezonansu fluorescencji (FRET)

  • moze dzialac albo przeniesieniem emisji, albo wygaszenie

  • przeniesienie emisji - fluorochrom pierwszy (donor) w wyniku wzbudzenia fala swietlna, przenosi energie na fluorochrom drugi (akceptor), ktory emituje kwant siatla o innej dlugosci, sonda - musi hybrydyzowac blisko startera (w tym procesie mamy dwa sartery i sonde); przyrost swiecenia - z kzdym cyklem zieksza sie ilosc miejsc hybrydyzacji

  • wygaszenie emisji - Sondy - TaqMan, donor jest wygaszany przez akceptor, ktory pochlania emiscje fali donora, wzbudznie emisji nastapi doiero po odlaczeniu reortera od wygaszacza, podczas proesu elongacji

  • metoda droga

  • bardzo specyficzna - swiecenie jest zwiazane z amplifikacja, czyli przybywanie produkcji PCR

*odwrotna transkrypcja - syntezowanie nici DNA na posiadanym mRNA* a propos RT-PCR

Inverse PCR - pozyskanie sekwencji, kiedy nie jestesmy w stanie pozyskac do niej starterow

Long PCR - zadniem tego procesu jest otrzymanie jak najdluzszego fragentu (do 40 tys pz)

RODZAJE KONTROLI PCR

1. NTC - bez matrycy

   - kontrola czystosci odczynnikow do reakcji PCR (normalna reacja tylko bez amplikonu)

2. PC - kontrola pozytywna

   - kontrola wlasciwego przebiegu reakcji PCR

   - fragment DNA, ktory powinien sie zawz w reakci zamplifikowac

   - nie mozna stosowac tej metody w przypadku dagnostyki drobnoustrojow

3. IPC - wewnetrzna kontrola pozytywa

   - kontrola wasciwego przebiegu reakcji PCR, stosowana alteratywnie do PC

   - kawalki syntetycznego DNA nieszkodliwego i dolazone do niego sartery - musi sie w kazdej reakcji zamplifikowac

4. NAC - bez amplifikacji

   - kontrola z inhibitorem (wszytki reagenty oraz matryca + inhibitor reakcji np.etanol) - konrola jakosci matrycy, czytosci platikow oraz sprzetu - jezeli zobaczyy coklwiek w zelu agarozowym, to znaczy, iz np. mamy brudne probowki, albo zaieczyszczony sprzet