Wstęp
Cykle biologiczne ssaków jak i innych zwierząt oraz roślin były obserwowane przez człowieka od zarania dziejów. Obserwując zmiany okresowe i dobowe człowiek wykorzystywał je do własnych celów. Pierwszym takim udokumentowanym wynikiem poznania rytmicznych przemian było skonstruowanie przez Linneusza „zegara kwiatowego” w latach 30-tych XVIII wieku (Cymborowski, 1983), który odznaczał się falowaniem w rytmie upływających godzin. Jednak wówczas jeszcze niemożliwe było badanie tych cyklicznie obserwowanych przemian. Dopiero rozwój metod badawczych umożliwił w XX i XXI wieku poznawanie dokładnych źródeł tych procesów.
Na początku człowiek próbował przypisać cykle biologiczne zmieniającym się warunkom oświetlenia i temperatury. Jednak w przypadku bardzo wielu procesów, rytmy biologiczne charakteryzowały się jako czynnik niezależny od oscylacji środowiska. Potwierdzają to liczne badania wykonywane od końca XIX wieku (Cymborowski, 1983).
Co ciekawe cykle biologiczne wykazują nie tylko organizmy tak skomplikowane jak ssaki, ale również organizmy jednokomórkowe jak przykładowo Euglena gracilis (Bruce i Pittendrigh, 1958) i Paramecium (Ehret, 1953; Barnett, 1965; Karakashian, 1965). Ponadto możemy o nich mówić nie tylko w kontekście całego organizmu, ale także organu, tkanki lub tylko jednej komórki całego organizmu.
Pomimo występowania czynników endogennych mających wpływ na istnienie i działanie zegara biologicznego, istnieje wiele czynników mogących modulować okres, amplitudę zmian i charakter rytmów. Możemy tu zaliczyć czynniki takie jak: cykliczne zmiany światła i ciemności, zmiany temperatury, a nawet bodźce dźwiękowe czy społeczne (Cymborowski, 1983). Wszystkie te czynniki spełniają również rolę synchronizatorów, czyli odpowiednio modulują fazę rytmu biologicznego stosownie do fazy oscylacji środowiska. Bez bodźców zewnętrznych rytm może ulegać stopniowemu przesunięciu w fazie.
Istota zegara biologicznego
Zegary okołodobowe są autonomicznymi mechanizmami utrzymywania czasu, które pozwalają żywym organizmom do przewidywania i dostosowywania się do środowiskowych rytmów świetlnych, temperaturowych i dostępności pożywienia. (Feillet i wsp., 2006).
Wszystkie organizmy żyjące na Ziemi doświadczają cyklicznych zmian warunków ich środowiska, a zegar okołodobowy stanowi jedną z dróg adaptacji. Ten wewnętrzny system pomiaru czasu, którego okres oscylacji wynosi około 24 godzin, pozwala na dostosowanie się do zmian warunków środowiska. Mechanizm tego systemu przybrał obraz odzwierciedlający codzienne wschodzenie i zachodzenie Słońca, wewnątrz organizmu i został określony jako circadian clock – biologiczny zegar okołodobowy, czyli zegar o cyklu zbliżonym do jednego dnia (łac. circa diem). (Albrecht, 2006).
Działanie zegara biologicznego określają dwa mechanizmy: jest zarówno generowany przez endogenny zegar, zlokalizowany w jądrze nadwzrokowym, ale również regulowany głównie przez zmiany światło-ciemność. Kiedy nie są dostępne bodźce świetlne rytm zegara przestawia się na tak zwany wolny bieg, tzn. realizuje swój własny „zaprogramowany” cykl, który jest zbliżony do rytmu 24 godzinnego (Urban i wsp., 2006).
U ssaków same struktury zegara biologicznego odznaczają się swoistego rodzaju hierarchią, tworzącą dość skomplikowany mechanizm zegarowy, który generuje i podtrzymuje 24 godzinną częstotliwość (Borgs i wsp., 2009).
Doświadczeniem wykazującym jak bardzo potrzebny jest zegar biologiczny u organizmów żywych było wykorzystanie różnych szczepów sinic o odmiennych właściwościach zegara, które hodowano ze sobą w warunkach wzajemnej konkurencji. Szczepy z prawidłowo funkcjonującym zegarze okołodobowym, zabijały szczepy z zakłóconym zegarem, przewaga ta znikała w stałych warunkach (Ouyang in., 1998; Woelfle i in., 2004). Doświadczenia nad pierwotniakiem Euglena gracilis potwierdziły, że najbardziej reaguje on na światło w dzień, a najmniej w nocy (Pohl, 1948). Organizmy najefektywniej konkurują ze sobą w rytmicznie zmieniających się warunkach środowiska, kiedy częstotliwość wewnętrznego biologicznego oscylatora jest podobna do cyklu środowiskowego. Jest to również ważne dla wielokomórkowych organizmów eukariotycznych, co niedawno wykazano w badaniach z zastosowaniem roślin Arabidopsis thaliana. Porównując dziki typ z mutantami o dłuższym lub krótszym cyklu zegara biologicznego wskazano na korzyści z dopasowania wewnętrznego okołodobowego cyklu do zewnętrznych warunków światła i ciemności. Stąd rośliny typu dzikiego charakteryzowały się szybszą biosyntezą, rosły szybciej, a także lepiej przetrzymywały trudne warunki niż te o niedostosowanej długości cyklu biologicznego do środowiska (Dodd i wsp., 2005). U ssaków zegar wydaje się służyć do odpowiedniego przygotowania organizmu na sprostanie i wykonywanie różnych zadań, które okresowo występują w ciągu dnia. Na przykład przewidywane czasu dostępności pokarmu jest kluczem do przetrwania u większości zwierząt (Albrecht, 2006). Zegar, zatem pełni ważną rolę nie tylko w konkurencji między organizmami wzmagając adaptację i warunkując niektóre aspekty przetrwania organizmu i gatunku, do jego zadań należy nie tylko przewidywanie pory pojawienia się pokarmu, ale także zmniejszone wydatkowanie energii w trakcie nocy i zachowanie jej w porach dnia, kiedy konieczna jest wzmożona aktywność (Albrecht, 2006).
Organizacja zegara biologicznego ssaków
W skład systemu okołodobowego można zaliczyć trzy zasadnicze elementy: wejścia sensoryczne, które przez odbierane bodźce synchronizują rytm endogenny z cyklicznymi zmianami środowiska; zegar wewnętrzny, generujący rytm endogenny o cyklu w przybliżeniu 24 godzinnym; oraz systemy wykonawcze zegara (ang. outputs), których zadaniem jest okresowa regulacja rytmów fizjologicznych, neuroendokrynnych i behawioralnych (Urban i wsp., 2006)
Dzisiaj już wiadomo, że główne ośrodki zarządzające zegarem biologicznym ssaków znajdują się w mózgu, a dokładniej w jądrach nadskrzyżowaniowych (ang. superchiasmatic nuclei). Jądra nadskrzyżowaniowe są parzystą strukturą znajdującą się w przedniej części podwzgórza tuż nad skrzyżowaniem nerwów wzrokowych (ang. Optic chiasma), leżącym u podstawy trzeciej komory (Rivkees i Haiping Hat, 2000). Każde jądro zawiera około 10.000 neuronów. Jądra są strategicznie położone dla odbierania bodźców sygnałów światła i ciemności, oddziałują bezpośrednio jak i pośrednio szlakami prowadzącymi od siatkówki do SCN (Reppert i Weaver, 2001). Ponadto ostatnie odkrycia potwierdziły możliwe istnienie innych nadrzędnych oscylatorów jak przykładowo zegara zorientowanego żywieniem (food entrainable clock, FEC), inne pozostają wciąż niezidentyfikowane (Feillet i wsp., 2006).
Centralne zegary wytwarzają rytmiczne sygnały wyjściowe w celu instruowania licznych zegarów obwodowych zlokalizowanych w innych tkankach i narządach. Z kolei te obwodowe oscylatory stanowią podstawę rytmów fizjologicznych, metabolicznych i tych uzewnętrzniających się w zachowaniu. Dotychczas uważano, że obwodowe oscylatory w tkankach są zależne od SCN i przy braku sygnałów z niego, ich oscylacje są z czasem tłumione (Reppert i Weaver, 2001). Ostatnie badania wykazały jednak istnienie podobnego mechanizmu sprzężeń zwrotnych podtrzymujących cykl w tkankach obwodowych jak w SCN (Borgs i wsp., 2009). Wcześniejsze przypuszczenia, że oscylacje są tłumione w tkankach obwodowych były związane przede wszystkim ze zbyt małą ilością punktów pomiarowych i tym samym dużą niedokładnością metod badawczych (Reppert i Weaver, 2001). Prawdą jest jednak, że SCN i FEC nadzorują wszystkie oscylatory obwodowe i dostosowują je odpowiednio do zmian warunków środowiska, a także synchronizują, wyprzedzając o 3 do 9-ciu godzin oscylacje w tkankach (Borgs i wsp., 2009).
Dawcy czasu
Ziemia podążająca po orbicie wokół Słońca ma wpływ na zmieniające się cyklicznie pory roku, niosące ze sobą, zmiany temperatury i zmiany długości cyklu światła w trakcie dnia. Aby dostosować się do tych zmian zegar okołodobowy jest połączony z mechanizmami, które pozwalają nam pozostać w harmonii z naturą (Albrecht, 2006).
Zegar biologiczny składa się z dość skomplikowanego mechanizmu działającego w organizmie na zasadzie pętli zwrotnych, które oscylują przez całe życie organizmu. Do prawidłowego funkcjonowania wymagany jest jednak dodatkowo kontakt ze środowiskiem, aby odpowiednio korygować jego zmiany i cały czas utrzymywać organizm w stanie zsynchronizowania ze zmianami środowiska zewnętrznego. Takie bodźce mogące „przesuwać wskazówki zegara biologicznego” stanowią głównie czynniki rytmicznie zmieniające się wraz z warunkami środowiska. Zostały one określone niemiecką nazwą - dawcy czasu – Zeitgeber – jako czynnik środowiska mający zdolność synchronizacji pracy zegara biologicznego, a tym samym wskaźnik czasu dla organizmu. (Cymborowski, 1983). Jak dotychczas do takich czynników możemy zaliczyć bodźce świetlne, czas poboru pokarmu, czy posiłków (przy ograniczonym czasowym dostępie do żywności o określonych porach dnia) (Challet, 2007), w pewnym stopniu bodźce dźwiękowe, społeczne (Cymborowski, 1983), a także niektóre narkotyki i środki farmakologiczne (Reppert i Weaver, 2001; Feillet i wsp., 2006).
Regulacja fazy zegara za pomocą bodźców świetlnych
U zwierząt komórkowych żyjących w warunkach świetlnych, każda komórka posiada okołodobowy oscylator ze swoimi własnymi fotoreceptorami, które komunikują się z zegarem, aby odpowiednio dostosować swoją fazę. Jest to rozwiązane inaczej u nieprzeźroczystych wielokomórkowych organizmów jakimi są ssaki. Chociaż każda komórka w różnych organach zawiera mechanizm zegarowy, nie każda posiada dostęp do światła. Stąd konieczna jest hierarchiczna organizacja poszczególnych zegarów (Albrecht, 2006). Trzeba jednak zaznaczyć, ze elementy pierwotnego zegara biologicznego u jednokomórkowców w postaci białka zwanego kryptochromem przetrwały w komórkach zwierząt wyższych, w tym ssaków (Andrys-Wawrzyniak, Jabłecka, 2008).
Synchronizacja wewnętrznych oscylacji okołodobowych ze środowiskiem jest uzyskiwana przez przekazywanie informacji o czasie środowiskowym przez szlaki sygnałowania z narządów zmysłów do zegara. Istnienie takich bodźców oddziaływujących na system okołodobowy jest przyczyną możliwości przystosowania się ludzi do różnych stref czasowych i ich zmian, ale także dolegliwości zwanych jet-lag, spowodowanych zmianą czasu (Albrecht, 2006).
Rytm dnia i nocy jest zasadniczy dla synchronizacji wewnętrznej fizjologii organizmu i jest niezbędny dla adaptacji do warunków otoczenia (Cymborowski, 1983). Bodźce świetlne są jednym z dawców czasu dla organizmu. Molekularny mechanizm zegarowy u ssaków jest związany z różnymi genami zegarowymi ze specyficznymi wzorcami ekspresji w czasie. Synchronizacja głównego zegara okołodobowego w jądrze nadskrzyżowaniowym i jego genów jest regulowana głównie przez codzienne resetowanie fazy zegara przez bodźce świetlne. Zmiana fazy w odpowiedzi na światło jest skorelowana z indukcją genów Per1 i Per2 wewnątrz komórek SCN. Czas obwodowych oscylatorów jest kontrolowany niemal wyłącznie przez zegar SCN, wtedy kiedy pokarm jest dostępny przez cały czas (Challet, 2007).
U ssaków siatkówka, szyszynka i SCN są jedynymi znanymi komórkami ulegającymi synchronizacji do warunków świetlnych i odpowiednio ustawianymi przez nie w fazie (Albrecht, 2006). Jądra nadskrzyżowaniowe są strategicznie położone, aby otrzymywać informacje świetlne z dobrze poznanych komórek fotoreceptorowych (bodźce świetlne) (Reppert, 2000) znajdujących się w pręcikach i czopkach, jak również z melanopsyny (białko podobne do opsyny), którą zawierają światłoczułe komórki zwojowe siatkówki. Melanopsyna jest najbardziej wrażliwa na światło niebieskie o długości fali 479 nanometrów, które najsilniej synchronizuje pracę centralnego zegara biologicznego wytwarzającego rytmy okołodobowe (Urban i wsp., 2006). Informacje wynikłe z oddziaływania bodźców świetlnych są przekazywane do SCN na dwa różne sposoby, bezpośrednio za pomocą RHT oraz pośrednio wielosynaptycznym szlakiem z udziałem melatoniny i szyszynki.
Bezpośrednia droga przekazywania sygnału odbywa się za pośrednictwem elektrycznych sygnałów przez drogę siatkówkowo-podwzgórzowa – RHT (ang. retinohypothalamic tract) (Reppert i Weaver, 2001). Neurotransmitery glutaminianowe i przysadkowy adenylowany peptyd aktywujący cyklazy (ang. pituitary adenylate cyclase-activating peptide, PACAP) uwalniane są z synaps RHT kontaktujących się z SCN, inicjują napływ wapnia (Albrecht, 2006). Przy czym kwas glutaminowy jest neurotransmiterem działającym przede wszystkim w nocy, a PACAP działającym głównie w dzień. Kwas glutaminowy przekazuje informacje o ekspozycji na światło w trakcie nocy. Jak wskazują hodowle in vitro, taka informacja występująca na początku nocy powoduje opóźnienie fazy rytmu, zaś na końcu nocy powoduje jej przyśpieszenie. Natomiast oddziaływanie ze strony PACAP w środku dnia powoduje przyśpieszenie fazy rytmu (Lewczuk, 2007). Napływ wapnia inicjowany przez neurotransmitery w rezultacie aktywuje fosforylację białka wiążącego element cAMP (ang. cAMP response element-binding protein; CREB), powodując indukcję ekspresji genów przez odpowiednie elementy regulujące transkrypcję (ang. calcium/cAMP response elements; Ca/CREs) (Reppert i Weaver, 2001), a także niektóre kinazy białkowe (białkowa kinaza A, PKA; białkowa kinaza C, PKC; białkowa kinaza G, PKG, cGK; kinaza białkowa aktywująca mitogen, MAPK) (Albrecht, 2006). Prowadzi to, oprócz bezpośredniej stymulacji wczesnych genów, do aktywacji genów Per1 i Per2 i do indukowanej światłem regulacji akumulacji białek PER, biorących udział w dostosowywaniu zegara do światła dziennego (Albrecht, 2006).
Alternatywna droga pobudzania SCN przez bodźce świetlne prowadzi przez parzystą wielosynaptyczną drogę nerwową, w którą są zaangażowane neurony jądra przykomorowego, neurony jąder pośredniobocznych rdzenia kręgowego oraz neurony zwoju szyjnego doczaszkowego; na końcu której aksony tworzą unerwienie współczulne szyszynki. Noradrenalina uwalniana z tych włókien odpowiada za sekrecję melatoniny. Trzeba zaznaczyć, ze neurotransmiter występujący pomiędzy SCN a jądrem przykomorowym nadal nie został zidentyfikowany. Wysoką aktywność neuronów SCN odnotowuje się w dzień, natomiast aktywność włókien współczulnych szyszynki odwrotnie – w nocy. Zatem aktywność jądra przykomorowego najprawdopodobniej jest hamowana przez oddziaływanie ze strony SCN. Na tej podstawie można przypuszczać, że tym niepoznanym neurotransmiterem jest kwas γ-aminomasłowy (Lewczuk, 2007).
Poprzez receptory β1-adrenergiczne noradrenalina ma możliwość aktywacji sekrecji melatoniny w pinealocytach ssaków. Aktywacja receptorów prowadzi bowiem do zwiększonego poziomu cAMP w pinealocytach, który wpływa w nich na sekrecję melatoniny przez dwa niezależne mechanizmy. Po pierwsze, cAMP powoduje aktywację transkrypcji genu kodującego N-acetylotransferazy aryloalkyloaminowej (AA-NAT), co wiąże się ze zwiększoną biosyntezą cząsteczek tego enzymu i wzrostem jego zawartości w komórce. Drugi mechanizm działania cAMP polega na aktywacji fosforylacji AA-NAT katalizowanej przez kinazę białkową A (PKA). Ufosforylowany enzym tworzy kompleks z białkami regulatorowymi 14-3-3. Zapobiega to procesowi proteolizy proteasomalnej enzymu oraz powoduje zwiększenie jego powinowactwa do serotoniny, a w konsekwencji również wzrost jego aktywności. AA-NAT jest zatem enzymem katalizującym przemianę serotoniny do N-acetyloserotoniny i limitującym ilość wytwarzanej melatoniny. Różnice w mechanizmach regulujących wydzielanie melatoniny u ssaków odpowiedzialne są za zróżnicowany przebieg dobowych profili sekrecji tego hormonu (Lewczuk, 2007).
Jądra nadskrzyżowaniowe są więc narządem analizującym i przetwarzającym dane na drodze receptor (narządy światłoczułe) – efektor (praktycznie wszystkie tkanki organizmu), a bodziec wysyłany z SCN ma na celu dostosowanie fazy każdej tkanki odpowiednio do warunków środowiskowych. Synchronizuje rytmy fizjologiczne z rytmami środowiskowymi i stąd spełnia nie tylko funkcję metronomu, ale także integruje środowisko otaczające z sygnałami wewnątrz organizmu (Albrecht, 2006).
Regulacja fazy zegara za pomocą czynników żywieniowych.
SCN jest niewątpliwie centralnym zegarem okołodobowym, jednak inne regiony mózgu i wiele innych komórek w całym ciele wykazuje ekspresję genów zegarowych i jest zdolnych do wykazywania nieprzerwanych oscylacji genów zegarowych. Taka zgeneralizowana ekspresja genów zegarowych dopuszcza istnienie wielu innych nadrzędnych zegarów. Wymieniony powyżej cykl światła i ciemności jest najważniejszym czynnikiem synchronizacji organizmu do dokładnie 24- godzinnego cyklu. Niemniej jednak mechanizm zegarowy SCN i odpowiedź świetlna mogą ulegać modulacji przez czynniki żywieniowe (Feillet i wsp., 2006).
Jak już wspomniano czas obwodowych oscylatorów jest kontrolowany wyłącznie przez zegar SCN, kiedy pokarm jest dostępny przez cały czas. Jednak w warunkach ograniczonego czasowego dostępu do żywności potencjalnym dawcą czasu dla obwodowych oscylatorów staje się pora żywienia (Challet, 2007). Zatem zegary peryferyjne nie są wyłącznie podporządkowane SCN w mózgu. Harmonogram żywienia może działać bezpośrednio na zegary obwodowe, zmieniając ich fazę bez bezpośredniego wpływu na SCN (Albrecht, 2006).
Czasowe ograniczenie kalorii (tzn. gdy każdego dnia o podobnej porze jest stosowana wyłącznie dieta niskokaloryczna) może modyfikować rytmikę organizmu wymuszaną przez SCN i przesuwać fazę ustaloną dla cyklu światła i ciemności. Taka sytuacja konfliktu pomiędzy świetlnymi i żywieniowymi synchronizatorami zmienia czas ekspresji genów zegara w SCN i czas różnych przejawów związanych z rytmem, wskazując, że zegar biologiczny jest wrażliwy na sygnały żywieniowe (Challet, 2007).
Funkcję odbierania bodźców żywieniowych, a następnie koordynowania do nich fazy zegara biologicznego przypisuje się odrębnemu nadrzędnemu zegarowi FEC (ang. food entranaible clock). Niestety jak na razie nie stwierdzono, ani dokładnej lokalizacji głównych ośrodków odpowiedzialnych za synchronizację z żywieniem, ani też dróg jakimi sygnały żywieniowe miałyby docierać do tych ośrodków. Jednak coraz większa liczba badań sugeruje, że FEC wynika ze wspólnej działalności sieci struktur, które mogą być też odpowiedzialne za inne funkcje, niezwiązane z zegarem biologicznym. Dodatkowo sugerowana jest możliwość zaangażowania struktur korowo-limbicznych w synchronizacji zorientowanej na żywienie (Feillet i wsp., 2006). Natomiast za przesyłanie bodźców żywieniowych do struktur FEC może być częściowo odpowiedzialne DNA wiążące białka Clock, które jest regulowane przez stan redoks kofaktorów. Ponadto wiadomo, że połączenie noradrenergiczne stanowi prawdopodobnie część sieci FEC. Ostatnie badania stwierdziły, ze zarówno metabolizm może wpływać na zegar jak i odwrotnie. Zegar biologiczny jest np. zaangażowany w homeostazę glukozy (Albrecht, 2006).
Zatem przystosowaniem do warunków żywienia najprawdopodobniej zarządza sieć struktur w centralnym układzie nerwowym, co pokazały liczne badania prowadzone na zwierzetach z uszkodzeniami różnych obszarów mózgu. Jak na razie kwestia powiązań i hierarchiczności tych struktur pozostaje nierozwiązana (Feillet i wsp., 2006).
Inne czynniki modulujące rytmikę.
Ciekawym zjawiskiem jest to, że bodźcami w niewielkim stopniu synchronizującymi zegar biologiczny mogą być także odpowiednie rytmicznie powtarzające się w ciągu doby czynniki dźwiękowe, społeczne, a nawet pole elektrostatyczne (Cymborowski, 1983). Oddziaływania te jednak są na tyle słabe, że drogi wpływu na zegar okołodobowy, a także struktury, które mogłyby być za nie odpowiedzialne jak na razie nie zostały poznane, a badania skupiają się nad dużo istotniejszymi dla zegara aspektami.
Wykryto także nierytmiczne funkcje kilku genów zegarowych. Zatem inne niezwiązane ze światłem i pożywieniem czynniki jak kierowane metamfetaminą, mogą również mieć wyraźny wpływ na zachowanie i fizjologię bez zmian w SCN (Feillet i wsp., 2006). Potwierdzają to badania, które stwierdziły, że u Drosophila kilka genów zegarowych jest niezbędnych dla wywołania uczulenia na kokainę. (Reppert i Weaver, 2001). Zatem narkotyki mogą także modulować działanie zegara. Wstrzyknięcie metamfetaminy powoduje wzrost ekspresji genu Per w niektórych tkankach i tym samym desynchronizuje ich fazę rytmu względem SCN. Działanie niektórych narkotyków wydaje się także mieć wpływ na drogi przenoszenia sygnału, które mają udział w resetowaniu mechanizmu zegarowego. Na przykład narkotyk Ecstasy zmienia odpowiedź agonisty receptora serotoninowego, który zmienia fazę zegara okołodobowego poprzez zwiększoną produkcję cAMP. Opioidy również mają zdolność do zaburzania systemu okołodobowego (Albrecht, 2006).
Istnieją jeszcze inne, nadal nierozpoznane czynniki mające wpływ na zegar biologiczny. Dlatego ważne jest prowadzenie dalszych badań, aby odkryć środki, które w przyszłości mogą mieć farmakologiczne zastosowania do leczenia licznych chorób i zaburzeń związanych z mechanizmami pomiaru czasu w organizmie (Reppert i Weaver, 2001).
Funkcjonowanie SCN.
W ciągu ostatnich lat poznano wiele aspektów mechanizmu zegarowego SCN, które również u ssaków działają w przybliżeniu tak samo. Chociaż geny biorące udział w tym mechanizmie mogą różnić się u różnych organizmów, jest on wspólny dla nich wszystkich (Albrecht, 2006). Wspólną cechą mechanizmów zegarowych wszystkich organizmów badanych od sinic do ssaków jest występowanie transkrypcyjnych/translacyjnych sprzężeń zwrotnych z udziałem tzw. genów zegarowych. (Feillet i wsp., 2006). Rytm zegarowy tworzy zamykający się cykl, w którym aktywacja genu początkowego jest regulowana przez ostatni gen w kolejności, co tworzy auto-regulujące sprzężenie zwrotne, dla którego jeden cykl trwa w przybliżeniu 24 h (cykl okołodobowy) (Albrecht, 2006). Te okołodobowe oscylacje opierają się zatem na dwóch, dodatnich i ujemnych pętlach, które razem tworzą sprzężenie zwrotne (Feillet i wsp., 2006).
Geny zegarowe
Pozytywne elementy aktywują ekspresję negatywnych elementów, system powraca do równowagi początkowej i w konsekwencji się zamyka (Albrecht, 2006). Do tej pory piętnaście homologów genów cyklu okołodobowego Drosophila zostało zidentyfikowanych u ssaków (Tabela 1). Zaliczane są tu geny pełniące różnorodne funkcje, należą do następujących rodzin genów:
Czynników transkrypcyjnych
bHLH-PAS
bHLH
Flawoprotein
Sierocych receptorów jądrowych
Kinaz kazeinowych
Tabela 1. Na podstawie Cell “circadian” cycle Borgs i wsp., 2009.
Wymienione geny zegarowe kodują czynniki transkrypcyjne, zawierające domeny wysoce konserwatywne – basic Helix-Loop-Helix (bHLH) – podstawowe elementy helisa-skręt-helisa, które wiążą regulacyjne DNA takie jak główne sekwencje wzmacniacniające (enhancery) CANNTG. Większość z tych czynników (oprócz Dec1, Dec2, Cry1, Cry2), posiada również PAS (Period/Arnt/Single minded) – domenę dimeryzacyjną. bHLH i PAS są powszechnymi elementami interakcji białko-białko i wspierają zdolność do dimeryzacji (Borgs i wsp., 2009). Grupy wyspecjalizowanych białek zegarowych, które są zależne od tempa biosyntezy i degradacji odpowiadają za okres, amplitudę i fazę rytmu. W ten sposób tworzą się pętle transkrypcyjne i translacyjne wzajemnie ze sobą połączone, w synchronizowany sposób generujące oscylacje o stałym okresie (Andrys-Wawrzyniak, Jabłecka, 2008).
Mechanizmy zegarowe
Istnienie molekularnych mechanizmów podtrzymujących czas zostało po raz pierwszy stwierdzone u muszki owocowej Drosophila melanogaster w 1971 roku wraz z izolacją genu Period. Muszki mutanty genu Period wykazywały zaburzenia w rytmie zarówno w aktywności ruchowej jak i cyklu rozwojowym. Pierwszy ssaczy gen cyklu okołodobowego, Circadian locomotor output cycles kaput (Clock) został odkryty za pomocą testu ekranu mutagenezy etylonitrosourea. Zegar myszy z tą mutacją przechodził na tryb wolnego biegu, wykazując przy tym cykl o długości około 25 h zamiast 24 h (Borgs i wsp., 2009).
Mechanizmy oscylacji leżące u podstaw okołodobowego zegara są ściśle powiązane ujemnymi i dodatnimi pętlami sprzężeń zwrotnych. Dodatnie części sprzężeń są pod kontrolą BMAL1, CLOCK albo NPAS2. Heterodimery BMAL1:CLOCK albo BMAL1:NPAS2 aktywują transkrypcję trzech genów Period (Per 1-3), dwóch genów Cryptochrome (Cry 1-2), dwóch genów Dec (Dec 1-2) oraz Rev-erbα, RORα, poprzez wiązanie się do sekwencji Ebox obecnych w promotorach tych genów. W rezultacie formuje się wiele różnych białek, między innymi PER i CRY, które są komponentami ujemnych części sprzężeń. Mają one zdolność powrotu do wewnątrz jądra w postaci heterodimerów, inhibując aktywność heterodimerów BMAL1:CLOCK lub BMAL1:NPAS2. Hamują tym samym również transkrypcję tych heterodimerów, jak również transkrypcję Dec1 i Dec2, Rev-erbα i RORα. DEC1 i DEC2 mogą również tłumić swoją własną transkrypcję przez współzawodnictwo o wspólne miejsce wiązania z BMAL1:CLOCK albo z BMAL1:NPAS2. Pomocnicze pętle regulacyjne angażują sieroce receptory jądrowe REV-ERBα i RORα, które działają poprzez sekwencje regulatorowe RORE obecne w promotorze Bmal1. REV-ERBα i RORα współzawodniczą o wiązanie z elementami RORE i odpowiednio hamują lub aktywują ekspresję Bmal1. To ostatnie sprzężenie nie wydaje się konieczne dla samej generacji rytmu, natomiast przyczynia się do stabilności i charakteru przesunięcia fazy w neuronach mechanizmu zegarowego (Borgs i wsp., 2009; Debruyne, 2008).
Modyfikacje posttranskrypcyjne i posttranslacyjne
Przemieszczanie się białek PER i CRY, bardzo ważnych w regulacji fazy zegara biologicznego, wewnątrz jądra zależy nie tylko od oddziaływania ich między sobą, czy z innymi białkami, ale również od stanu ich ufosforylowania (Reppert i Weaver, 2001).
Wszystkie molekularne oscylatory przechodzą różne posttranskrypcyjne i posttranslacyjne modyfikacje o kluczowym znaczeniu dla mechanizmu koordynowania właściwego czasu okołodobowego w organizmie, przejawiające się generacją stabilnych oscylacji molekularnych o cyklu zbliżonym do 24 godzin. Kinazy białkowe CK1ε i CK1δ modulują aktywność transkrypcyjną poprzez regulację transportu nukleocytoplazmatycznego. Odbywa się to przez fosforylację elementów tworzących zarówno ujemne jak i dodatnie części sprzężeń zwrotnych w SCN. Znaczącą rolę w regulacji oscylacji transkrypcyjnych pełnią także modyfikacje chromatynowe poprzez acetylację, deacetylację i metylację histonów, w których obecne są regiony promotorowe centralnych genów zegara. Najlepszym przykładem jest tu gen Clock, który posiada dodatkową aktywność acetylotransferazy. Zatem główne geny zegara są aktywowane poprzez heterodimery BMAL1:CLOCK także przez acetylację histamin. Okazało się, że działa to również odwrotnie, represja transkrypcji głównych genów zegarowych jest wspomagana przez deacetylację i metyzację ich regionów promotorowych przez heterodimery PER:CRY. Nie bez znaczenia są modyfikacje postranslacyjne: CLOCK wywiera aktywność enzymatyczną na reszty lizyny obecne w BMAL1. Natomiast SUMOylacja i ubikwitynizacja stanowią poziom posttranslacyjnej kontroli głównych białek zegara okołodobowego (Borgs i wsp., 2009).
Synchronizacja pomiędzy neuronami SCN
Każdy z neuronów jądra nadskrzyżowaniowego zawiera niezależny mechanizm oscylacji. Badania wykazały że długość cyklu między neuronami nieznacznie się waha. Na dłuższą metę powoduje to całkowitą desynchronizację neuronów hodowanych w kolturach rozproszonych. Dlatego in vivo konieczne jest istnienie mechanizmów koordynujących rytmikę oscylacje między neuronami. Ciekawym zjawiskiem jest, że zwierzęta po potrafią utrzymywać rytmikę w stałej ciemności przez wiele lat, lecz w stałym świetle powoli stają się arytmiczne w wyniku wzajemnej desynchronizacji neuronów w SCN (Albrecht, 2006).
Badania wykazały, że istnieje kilka mechanizmów synchronizacji pomiędzy neuronami w SCN: oparte synapsach elektrycznych, oparte na interakcjach neurotransmiterów oraz oparte na interakcjach synaptycznych (Reppert i Weaver, 2001).
GABA (kwas γ-aminomasłowy) jest nadrzędnym transmiterem neuronów SCN. Stwierdzono, że GABA pobudza neurony SCN podczas dnia, podczas gdy w nocy GABA hamuje aktywność elektryczną SCN (Wagner, 1997). Taki sposób działania może przyczyniać się do rytmicznych zmian koncentracji jonów (np. międzykomórkowych chlorków), a to z kolei wpływać na rytmiczną pobudliwość pojedynczych neuronów zegara. Dodatkowym skutkiem działania GABA może być zwiększanie amplitudy oscylacji neuronów w SCN (Reppert i Weaver, 2001). W hodowli komórek SCN, aplikacja GABA prowadzi do zmiany fazy rytmu, wyhamowując działanie mechanizmu zegarowego. Możliwe, że są tutaj zaangażowane również inne czynniki, takie jak neuropeptydy (np. AVP) oraz inne substancje łatwo przenikające przez błony.
W SCN neurony są bardzo mocno upakowane. Sugeruje to, że zmiany w środowisku SCN służą do koordynacji neuronów względem siebie. Dopatruje się tutaj dużego znaczenia PSA-NCAM (ang. polysialic acid-neuronal cell adhesion molecule), którego rolą jest najprawdopodobniej wspieranie oddziaływań pomiędzy poszczególnymi neuronami SCN i ich synchronizacji względem siebie. U myszy pozbawionych PSA-NCAM w stałych warunkach amplituda oscylacji stopniowo zmniejsza się. Nie bez znaczenia pozostaje glej, który ze względu na swoje biochemiczne i izolacyjne właściwości może mieć duży udział w synchronizacji neuronów względem siebie (Theodosis i in., 1999).
Komunikacja za pomocą synaps elektrycznych nie jest niezbędna, jednak wspiera koordynację podzespołów neuronów SCN i tym samym może przyczyniać się do wzmocnienia sygnału przesyłanego do oscylatorów obwodowych.
Synchronizacja między regionami SCN.
Cykl dobowy u wszystkich zwierząt jest determinowany przez wypadkową znacznie rozproszonych cyklów pojedynczych komórek zegara w SCN. Zatem SCN jest układem, którego oscylacje wraz ze wzrostem wzajemnej synchronizacji neuronów powodują wzrost amplitudy rytmu zegarowego. Sygnały informujące tkanki obwodowe będą generowane z fazą będącą wypadkową oscylacji we wszystkich neuronach SCN i bliski rytmice przeważającej w populacji (Reppert i Weaver, 2001). Niesie to ze sobą zaletę , jaką jest elastyczność dostosowania się zegara okołodobowego do środowiska. W wypadku, kiedy część oscylującego układu zostaje przesunięta w fazie, cały układ resynchronizuje do nowej fazy. Zatem nawet jeśli tylko część komórek zegara zmieni swą fazę pod wpływem jakiegoś bodźca, doprowadza do przesunięcia fazy zegara okołodobowego w całym układzie (Reppert i Weaver, 2001).
W obrębie układu, jakim jest SCN można wyodrębnić dwa główne elementy anatomiczne: część brzuszną, odbierającą bodźce z siatkówki i wzgórza, oraz część grzbietową, która odbiera sygnały z innych obszarów mózgu (Urban i wsp., 2006). Wiadomo, że światło najpierw indukuje ekspresję genów mPer1 w brzuszno-bocznym SCN, co wpływa na zmianę fazy całego jądra w późniejszym czasie (Reppert i Weaver, 2001). Bodźcami, mogącymi mieć wpływ na zmianę fazy części grzbietowej są otrzymywane informacje o środowisku wewnętrznym organizmu, a także bodźce sensoryczne, żywieniowe i społeczne, z serotoniną i neuropeptydem Y jako neuroprzekaźnikami przekazującymi informacje (Andrys-Wawrzyniak, Jabłecka, 2008).
Stała faza zegara SCN utrzymywana w normalnych warunkach naprzemiennego światła i ciemności jest swoistym bilansem pomiędzy wewnętrzną synchronizacją zegara, a przesunięciem w fazie związanym z odpowiedzią działające bodźce. SCN jest precyzyjnie regulowanym układem, w którym koordynowane są międzykomórkowa synchronizacja procesów z wewnątrzkomórkowymi mechanizmami molekularnymi (Reppert i Weaver, 2001).
Wpływ zegara na oscylacje w komórkach
Centralny zegar wytwarza rytmiczne sygnały wyjściowe, aby instruować liczne zegary obwodowe zlokalizowane w innych tkankach i narządach. Z kolei te obwodowe oscylatory stanowią podstawę rytmów fizjologicznych, metabolicznych i tych uzewnętrzniających się w zachowaniu (Borgs i wsp., 2009). Okołodobowy system u ssaków wpływa na najbardziej fizjologiczne aktywności jak sen, czuwanie, temperatura ciała, perystaltyka jelit, aktywność wątroby, aktywność układu sercowo-naczyniowego i wrażliwość zmysłów (Albrecht, 2006).
Wiele genów istotnych dla funkcjonowania SCN jest związanych z oddziaływaniem na procesy związane nie tylko z generacją oscylacji organizmu. Przykładem może być tutaj rola kilku genów zegarowych w uczuleniu kokainowym. Jednak wciąż istnieją inne, nadal niepoznane nierytmiczne biologiczne procesy u ssaków regulowane albo modulowane przez geny zegarowe. Poznanie ich właściwości otwiera drogę do sterowania zegarem okołodobowym, a także leczenia jego zaburzeń. (Reppert i Weaver, 2001).
Funkcjonowanie FEC.
Równolegle ze zgłębianiem tajemnic SCN, poszukiwano innych obszarów mózgu i organów ciała, które mogłyby mieć wpływ naoscylacje w tkankach obwodowych. W 1979 roku, Stephan i współpracownicy zaobserwowali, że u szczurów z obustronnie uszkodzonym SCN mogą zostać przywrócone okołodobowe oscylacje aktywności ruchowej poprzez karmienie tych zierząt codziennie w tych samych punktach czasu. Szczury takie wykazują zwiększoną aktywność ruchową w czasie poprzedzającym podanie jedzenia (Stephan i in., 1979). Była to pierwsza przesłanka o możliwości istnienia innych nadrzędnych oscylatorów w organiźmie ssaków, a hipotetyczny mechanizm zegarowy odpowiadajacy za zaobserwowane przejawy nazwano zegarem zorientowanym żywieniowo (ang. Food-Entrainable Clock; FEC lub Feeding-Entrainable Oscillator; FEO) (Stephan, 2003).
Okazało się, że wraz z aktywnością zorientowaną na żywienie (ang. Food Anticipatory Activity; FAA), idą w parze zmiany temperatury ciała (ang. Food Anticipatory Thermogenesis; FAT) oraz podobnie zmiany poziomu kortykosteronu (ang. Food Anticipatory Corticosterone; FAC). W przypadku zmiany pory karmienia, zarówno aktywność ruchowa jak i inne przejawy fizjologiczne stopniowo dostosowywują się do nich, przy czym żywność musi być podawana w cyklu okołodobowym, tzn. trwającym między 22,5 a 29 godzin (Feillet i wsp., 2006).
Warto zaznaczyć, że u zdrowych zwierząt te specyficzne reakcje na regularne żywienie również wytępują (zegar biologiczny tych zwierząt jest wypadkową działania SCN i FEC)., jednak w przypadku zmiany sposobu żywienia i umożliwienia zwierzętom ciągłego dostępu do żywności, ich zegar biologiczny przechodzi całkowicie pod kontrolę SCN (Challet, 2003).
Trzeba zaznaczyć, że sam FEC nie jest dokładnie przebadany i jego lokalizacja oraz sposóbdziałania nie są jeszcze dokładnie określone. Analizy genówpodejrzewanych o wchodzenie w skład mechanizmów regulacyjnych FEC zostały przeprowadzone głównie poprzez badanie myszy-mutantów (Stephan, 2003).
Mutanty takie pozbawione ekspresji określonego genu lub z istotną mutacją genu zostały poddane w warunkach regularnego karmienia analizie pod względem wykazywania FAA. Zbadano pod tym względem główny gen SCN – Clock, jego analog występujący w tkankach obwodowych – Npas2, a również Cry1, Cry2, Per1 i Per2. Spośród tych genów tylko Npas2 i Per2, a takżew nieznacznym stopniu Cry1 i Cry2 wykazywały wpływ na wykazywanie FAA. Przy czym brak Npas2 u myszy karmionych regularnie wedle harmonogramu powoduje opóźnienie FAA. Natomiast Cry1 i Cry2 biorą udział jedynie w stabilizowaniu funkcji FEC. Geny Per 1 i Per2 istotne do synchronizacji SCN do naprzemiennych warunków światła i ciemności, okazały się również ważne dla funkcjonowania zegara FEC (Feillet i wsp., 2006). Mutanty pozbawione genu Per2 nie wykazują jakiegokolwiek zorientowania funkcji fizjologicznych czy aktywności ruchowej na warunki regularnego karmienia bez ingerencji na synchronizaje wtkankach obwodowych (Feillet i wsp., 2006b). Nawet protokół żywienia znany z bardzo silnego wpływu na mechanizm zegarowy SCN – gdy myszom podaje się dietę hypokaloryczną dostarczającą im 66 % normy wartości energetycznej nie wspomógł wykazywania aktywności ruchowej i wzrostu temperatury związanej z porą karmienia u myszy pozbawionych ekspresji genu Per2. Pełni on zatem kluczową rolę w regulacji FEC (Feillet i wsp., 2006).
Ze względu na zbyt małą ilość genów zanalizowanych pod kątem udziału w funkcjonowaniu FEC nie jest możliwe przedstawienie modelu mechanizmu obrazującego ten aspekt zegara biologicznego.
Lokalizacja FEC.
Liczne analizy nie zdołały również określić dokładnie położenia struktur mających odpowiadać za funkcjonalność zegara zorientowanego żywieniowo. Istnieje wiele hipotez na temat struktur tworzących FEC. Można przypuszczać, że FEC podobnie jak SCN jest pojedynczą strukturą w mózgu. Równie prawdopodobnym wydaje się, że jest on systemem multioscylatorów połączonych ze sobą w centralnym układzie nerwowym. Najmniej prawdopodną hipotezą jest istnienie FEC jako w organach obwodowych (Feillet i wsp., 2006).
Badania szczurów z lucyferazą podpiętą pod promotor Per1 wykazały, że nie wykazuje ona rytmicznych oscylacji w przewodzie pokarmowym. FEC nie znajduje się zatem w tkankach obwodowych systemu trawiennego. Jednak można się domyślać, że te organy prawdopodobnie zawierają sensory, które przesyłają informacje o stanie metabolicznym organizmu do mózgu (Davidson i in., 2003).
Liczne eksperymenty nie zdołały określić położenia FEC. Może on istnieć jako centralna struktura lub sieć struktur, które otrzymują i integrują informacje zbierane z tkanek obwodowych i generują sygnały, które są rozpoznawane we wszystkich narządach obwodowych. Jednak coraz większa liczba badań odrzuca istnienie FEC jako pojedynczej struktury w centralnym układzie nerwowym, co sugeruje, że FEC warunkuje wspólna działalność sieci struktur. Dotychczasowe eksperymenty na zwierzętach z uszkodzeniami różnych obszarów mózgu wskazują na możliwość zaangażowania struktur korowo-limbicznych w synchronizacji zorientowanej na żywienie. Hierarchiczność i rodzaje powiązań w tych strukturach nadal oczekuje na dalsze analizy (Feillet i wsp., 2006).
Szlaki i struktury przenoszące i wykazujące przejawy w wyniku sygnałów z SCN i FEC.
Informacje o bieżącym czasie zakodowane w tym mechanizmie są tylko wtedy użyteczne dla organizmu, kiedy ulegają przeniesieniu na jego fizjologię. Jest to osiągane poprzez sprzęganie mechanizmu zegarowego z biologicznymi szlakami, które są kompozycją sekwencji aktywacji genów. Połączenie ogranicza szybkość działania zegara przekłada wszystkimi szlakami wykazywaną rytmikę okołodobową i tym samym staje się „rękami wykonawczymi zegara” OUTPUTS. Jest to również nazywane „clock output” (Albrecht, 2006).
U ssaków siatkówka, szyszynka i SCN są jedynymi znanymi komórkami ulegającymi synchronizacji do warunków świetlnych i odpowiednio ustawianymi przez nie w fazie. W związku z tym, zegary w organach obwodowych, jak nerki czy wątroba, muszą być synchronizowane przez neuronalne (nerwowe) albo humoralne sygnały z SCN (które otrzymuje informacje z siatkówki i szyszynki). Wydzielanymi czynnikami z SCN mającymi możliwość synchronizacji zegarów w różnych strukturach mózgu są TGFα i prokinetycyna 2. Jednakże te czynniki nie wydają się być głównymi synchronizatorami tkanek obwodowych, ponieważ ich receptorów brakuje w większości organów obwodowych (Albrecht, 2006).
Dimery CLOCK:BMAL1 są zdolne do aktywacji transkrypcji genów kontrolowanych zegarowo (ang. clock-controlled genes, CCG), przez interakcję z sekwencjami E-box w ich promotorach. CCG następnie dostarczają rytmicznego sygnału wyjściowego do kontroli fizjologii i zachowania. Wśród tych CCGów jest białko wiążące miejsce D wazopresyny i albuminy (DBP) jest często brane jako punkt odniesienia fazy SCN (Feillet i wsp., 2006).
Analizy rytmiki genów w wątrobie wykazały ich udział w regulacji metabolizmu, podczas gdy geny oscylujące w SCN są przewodnie zaangażowanie(rolę) w sygnałowanie i neurosekrecję. Wydaje się, że trzy elementy promotorów są istotne dla regulacji okołodobowej: Eboxy – cele przyłączania się kompleksu CLOCK:BMAL1, Dboxy – cele DBP:E4BP4 i elementy regulacyjne REV-ERBα:ROR (RREs). Kombinacja tych trzech elementów w promotorach pozwala generować różne fazy i amplitudy transkrypcji okołodobowej, w których elementy Ebox pełnią decydującą rolę. Duże znaczenie w koordynacji rytmu mają także mechanizmy posttranskrypcyjne lub posttranslacyjne. U sinic jest możliwe odtwarzanie rytmu bez transkrypcji przez fosforylację komponentów zegarowych (Albrecht, 2006).
Aby organizm pracował w zoptymalizowany sposób czas wewnętrzny organizmu powinien być dostosowany do czasu zewnętrznego środowiska (Albrecht, 2006).
Szlaki neurochemiczne zaangażowane w ekspresję FAA.
Glutaminergiczne, histeminergiczne i opioidergiczne szlaki .
Indukcja surowicza genów zegarowych w fibroblastach sugeruje, że czynniki pochodzące z krwi stymulują szlaki przekazywania sygnału, które mają wpływ na molekularne oscylatory w komórkach obwodowych tkanek ssaków. Glukokortykoidy mogą pełnić ważną rolę w tym względzie, ponieważ mogą resetować (ponownie nastawiać) zegar okołodobowy przez zmianę ekspresji genu Per, a oś przysadkowo nadnerczowa reguluje ekspresje tych genów (glukokortykoidy są hormonami tej osi i one reguluje ekspresje genu Per). Innymi czynnikami wpływającymi na ekspresję genów Per i tym samym fazę zegara są interleukiny-6 i kwas retinowy. Ostatnie badania sugerują, że światło indukuje ekspresję genów w nadnerczach poprzez SCN-współczulny układ nerwowy. Ekspresja genów jest powiązana ze wzrostem kortykosteronu w osoczu i w mózgu, bez aktywacji osi podwzgórzowo-przysadkowej. Te czynniki wskazują, że poziomy glikokortykoidów zależne od zegara światło zależnego mogą regulować metabolizm komórkowy w zależności od zmian w cyklu światła i ciemności (Albrecht, 2006).
Wśród ścieżek neurochemicznych zaangażowanych w FAA są sieci glutaminergiczne. Blokada receptorów NMDA redukuje ekspresję FAA w sposób zależny od dawki. Receptory NMDA są rozsiane w całym centralnym układzie nerwowym (Feillet i wsp., 2006).
Mózgowa histamina jest uważana za pełniącą regulację zachowań towarzyszących karmieniu. Dalsze badania mają stwierdzić, czy podwzgórzowe histaminergiczne neurony są umiejscowione na drodze wejściowej czy wyjściowej sieci FEC (Feillet i wsp., 2006).
Mezolimbiczny opioidowo-dopaminowy system posiada kluczową rolę w motywacji zachowań (Feillet i wsp., 2006).
Myszy z mutacją knock-out mu-opioidowego receptora w warunkach ograniczonego karmienia według harmonogramu porównano z dzikimi, u których system dopaminergiczny pozostawiono bez zmian. Te pierwsze wykazywały zredukowane FAA. Te badania wskazują, ze system opioidergiczny odgrywa rolę w regulacji FAA (Feillet i wsp., 2006).
Szlak oreksynergiczny, odprowadzający z FEC i promujący FAA.
System oreksynergiczny również jest zaangażowany w regulację pobierania pokarmu. Oreksyny A i B są neuropeptydami, których receptory są zlokalizowane głownie w przodomózgowiu, w podwzgórzu, jądrach wzgórza i pnia mózgu, a także w rdzeniu kręgowym. Promują one aktywność ruchową, pobieranie pokarmu i motywację zachowań w koordynację wzorców snu i czuwania. Myszy pozbawione zarówno obu genów oreksyn lub neuronów oreksynergicznych wykazują fenotypy podobne do ludzi cierpiących na narkolepsję. Ponadto, główne zarządzanie oreksyami wyzwala zachowania związane z karmieniem. Biorąc pod uwagę ważność oreksyn w kordynacji czuwania i zachowań motywowanych jak poszukiwanie pożywienia, Akiyama i wsp. Zbadali aktywność neuronów oresyn pod RF i FAA dzikiego typu i myszy pozbawionych neuronów oreksynergicznych. Oreksynergiczna neuronalna aktywacja jest przesunięta o 6 h u myszy typu dzikiego w odpowiedzi na czas dnia RF. Interesujące, że FAA jest ograniczone u myszy pozbawionych oreksynergicznych neuronów w tych samych warunkach. Wydaje się, że neurony orek synergiczne nie generują FAA same z siebie, ale mają udział w jednym z komponentów FAA – czuwaniu. Interesujące, że aktywność neuronów oreksynergicznych znacznie rośnie trakcie warunków ograniczonego żywienia według harmonogramu u dzikich myszy. Podsumowując, te badania sugerują, że neurony oreksyn mogą przekazywać sygnał odprowadzający z FEC, zwiększając tym samym aktywność w trakcie czuwania i promując utrzymywanie czasu FAA w godzinach poprzedzających żywienie (Feillet i wsp., 2006).
W warunkach naturalnych te neurony mogą mieć zasadnicze znaczenie dla zwierząt do zachowań poszukiwania żywności w odpowiedzi na zmniejszoną dostępność jedzenia (Feillet i wsp., 2006).
Jednak one nie mogą być komponentem FEC, ponieważ zarówno uszkodzenie elektrolityczne powierzchni bocznej podwzgórza, ani kierowane usunięcie neuronów oreksynergicznych nie znoszą FAA. Jest również możliwe, że neurony oreksynergiczne specyficznie kontrolują aktywność lokomotoryczną wychodzą przez nie z FEC. Biorąc pod uwagę, ze nie istnieją dane zmian temperatury i wydzielania kortykosteronu, te dwa przejawy FEC mogą być normalnie wykazywane u tych mutantów (Feillet i wsp., 2006).
Po 30 latach badań nad FEC tylko fizjologiczne i behawioralne aspekty zegara są jasno określone – jak aktywność ruchowa, temperatura i wydzielanie kortykosteronu. Sam FEC jest tajemnicą: jego dokładna lokalizacja, drogi doprowadzające i odprowadzające (pełne spektrum przejawów jego działania i mu podległych) są jeszcze nie w pełni zdefiniowane. Dobrym kandydatem stanowiącym jego mechanizm jest DMH. Neurony oreksynergiczne mogą stanowić drogę wyjścia z FEC, a połączenie noradrenergiczne stanowi prawdopodobnie część sieci FEC. Ostatnio poczyniono wiele wysiłku, aby rozwikłać mechanizm zegarowy, który reguluje oscylacje FEC: szczególnie Per2, w mniejszym stopniu w to zaangażowane geny Npas2 i Cry, mające wpływ na machinerię FEC. Inne czynniki molekularne znane z zaangażowania w SCN nie zostały przebadane w kwestii zaangażowania w FEC (Feillet i wsp., 2006).
Oscylacje w zegarach komórkowych tkanek.
Analizy profilu ekspresji genów zegarowych u ssaków wykazały, że wiele z odpowiadających im produktów mRNA gromadzi się podczas cyklu okołodobowego w wielu tkankach obwodowych łącznie z wątrobą, mięśniami, nerkami, płucami, błonami śluzowymi jamy ustnej i skórą. Ponadto, pokolenie transgenicznych myszy skrywające gen lucyferazy wstawiony do wewnątrz promotorów Per1, Per2 lub Bmal1, pokazuje że tkanki obwodowe w hodowli zachowują rytmikę okołodobową. Wyniki tych analiz wykazały, że SCN nie jest niezbędne do napędzania oscylacji obwodowych. Rzeczywiście gryzonie z uszkodzonym SCN zachowują obwodowe oscylacje mRNA genów zegarowych. Ekspresja okołodobowa wszystkich obwodowych genów jest opóźniona o 3-9 godzin w porównaniu do ich maksymalnej ekspresji w SCN, sugerując że SCN posiada rolę w synchronizacji obwodowych rytmów okołodobowych (Borgs i wsp., 2009).
Jedną ze wspaniałych korzyści wynikających ze znalezienia transkryptów oscylująch w kulturach komórkowych jest możliwość przyśpieszenia biochemicznych i molekularnych analiz głównego mechanizmu zegarowego u ssaków. Wydaje się to być częściowo interesujące dla analiz transdukcji sygnału kaskadami indukowanej mediatorami, ponieważ szok osmotyczny wywołuje szybką indukcję ekspresji genów Per1 i Per2 w hodowanych komórkach, podobnie do efektu światła na ekspresję Per1 i Per2 w SCN. Przyjmując to podejście Akashi i Nishida wykazali, że kaskada kinaz MAP jest zaangażowana w indukcję okołodobowej ekspresji genowej w hodowanych komórkach. To wygląda analogicznie do sytuacji w SCN, którego stymulowanie kinazami MAP prowadzi do fosforylacji CREB. Nie jest do końca poznane, czy ekspresja genowa indukowana surowicą w hodowanych komórkach jest analogiczna do indukowanej światłem ekspresji mPer1 i mPer2 w SCN. Zdaje się, że w komórkach kultury indukcja genowa rozpoczyna oscylacje okołodobowe, natomiast w SCN indukcja genowa przez światło nastawia już chodzący zegar okołodobowy. Nasuwa to podstawowe pytanie: czy mechanizm centralny zegara jest taki sam w SCN i oscylatorach obwodowych? Dane sugerują, że istnieją istotne różnice. W dodatku do opóźnionych faz rytmu RNA mPer w tkankach obwodowych, w stosunku do tych w SCN, rytm RNA Bmal1 wykazuje zdecydowanie inną odpowiedź w SCN niż w tkankach obwodowych myszy mutanta Clock/Clock. Poziomy RNA Bmal1 są podwyższone so górnego zakresu normalnej oscylacji w tkankach obwodowych myszy mutanta Clock/Clock, podczas gdy te same zwierzęta mają rytm RNA mocno spłycony w SCN. Podwyższenie poziomu Bmal1 w tkankach obwodowych myszy mutanta Clock sugeruje, że heterodimery CLOCK:BMAL1 są normalnie represorami transkrypcji genu Bmal1 w obwodowych tkankach, analogicznie do tego została zaproponowana represja transkrypcji clock przez CLOCK:CY w zegarze biologicznym Drosophila. W SCN taka represja nie występuje. Wydaje się zatem, że istnieją znaczne różnice w regulacji genów zegara w tkankach obwodowych porównując z SCN. Dalsze badania mogą dostarczyć molekularnego wyjaśnienia dla różnic pomiędzy prawdziwymi zegarami a tłumionymi oscylatorami. Tymczasem, starania zrozumienia mechanizmów okołodobowych w SCN poprzez użycie rytmów tkanek obwodowych jest szybkim, ale i potencjalnie niosącym zagrożenia sposobem (Reppert i Weaver, 2001).
Jak obwodowe oscylatory u ssaków są utrzymywane przez zewnętrzne sygnały upływającego czasu dnia? W odróżnieniu od Drosophila, u których zegary obwodowe są bezpośrednio regulowane i nastawiane przez światło, dane pochądzące z analiz nad szczurami transgenicznymi i z uszkodzoną przysadką sugerują, że sygnały światła i ciemności są przekształcane przez SCN na sygnały wychodzące, które dostarczają czasu (znaczniki czasu, dawcy czasu). Natura sygnału zależnego od SCN do tkanek obwodowych nie jest jeszcze znana. Jest mało prawdopodobne, że jest w to zaangażowana melatonina, ponieważ myszy niezdolne do wytwarzania melatoniny (szczep C57BL/6) ciągle posiada okołodobowe oscylacje ekspresji genów mPer w tkankach obwodowych. Jest natomiast prawdopodobne, że dawcą czasu jest komplek złożony z sygnałów nerwowych i humoralnych sterowanych przez SCN, podobnie do tego, co zostało zaproponowane dla sygnałów generowanych z macierzystego SCN, które nadaje płodowy zegar okołodobowy (Reppert i Weaver, 2001).
Zatem jaka jest funkcja obwodowych oscylatorów? Jedna z hipotez zakłada, że centralnie generowane sygnały w końcu wpływają na obwodowe oscylatory, wzbudzając je i koordynując ekspresję lokalnie kontrolowanych CCG-sów, które zmienianiają regulację biologicznych procesów. DBP jest prostym przykładem CCG w tkankach obwodowych, ponieważ jego ekspresja zachodzi rytmicznie w wielu obwodowych organach. Ponadto DBP reguluje transkrypcj kluczowych enzymów w hepatocytach bezpośrednio zaangażowanych w metabolizm cholesterolu, aminokwasów, ksenobiotyków i androgenów. Tak więc DBP może pełnić podwójną rolę, zdaje się być zaangażowane w regulację okołodobowego sygnału wyjściowego przez ekspresję zarówno w SCN jak i w wątrobie. Lokalnie kontrolowane CCGsy w organach obwodowych mogą zapewniać łatwość przystosowania się do kontroli rozległych sieci regulatorowych rytmów okołodobowych (Reppert i Weaver, 2001).
Każdy z ////ośmiu/ genów zaangażowanych w mechanizm zegarowy w SCN wykazuje szeroką ekspresję w całym organiźmie. To czyni analizy funkcji specyficznych genów trudnymi w hodowlach komórkowych, ze względu na zanieczyszczający wpływ efektów wewnętrznej ekspresji w ssaczych liniach komórkowych. Oprócz udziału genów zegarowych w tłumieniu okołodobowych oscylatorów okołodobowych, mogą one także pełnić funkcje w podwyższaniu częstotliwości oscylacji tych genów. Jako przykład, częstotliwość rytmu męskich zalotów Drosophila dotknięta przez mutacje PER wywiera podobny efekt na częstotliwość zegara okołodobowego (Reppert i Weaver, 2001).
///Ostatnio//// wykryto nierytmiczne funkcje kilku genów zegarowych. U Drosophila kilka genów zegarowych jest niezbędnych w uczuleniu na kokainę, podczas gdy inne geny nie. Muszki posiadające mutacje per, clock, cyc i doubletime nie są uczulone, rezultatami wielu tych mutacji (np. mutacja - brak per) są niefunkcjonujące zegary okołodobowe. Intrygujące jest, że muszki pozbawione funkcjoalnego genu tim uczulone są normalnie, mimo że nie wykazują rytmu okołodobowego. Dlatego efekt genów zegarowych na uczulenie kokainowe jest różny od efektów na zachowania okołodobowe. Te badania błagają o proste analizy funkcji genów zegara u ssaków, ponieważ uczulenie kokainowe jest obserwowane również u ssaków włącznie z ludźmi i jest powiązane ze wzrostem głodu narkotykowego (Reppert i Weaver, 2001).
Mogą istnieć inne nierytmiczne biologiczne procesy u ssaków regulowane albo modulowane przez podstawowe geny mechanizmu zegarowego. Dlatego ważnym jest, aby myszy z genetycznymi manipulacjami genów były dogłębnie przebadane pod kątem szerokiego zakresu fenotypów. Jak zademonstrowano przy roli oreksyn (urokortyn) w regulacji snu, kierowane zakłócenie genu może wytworzyć szeroki zakres łatwo identyfikowalnych fenotypów (Reppert i Weaver, 2001).
PODSUMOWANIE
Rytmy okołodobowe są ważnym aspektem ludzkiej biologii. Czasowe zmiany w poziomach hormonów, farmakokinetyce i aspektach wykrywania chorób, wszechobecne oddziaływanie zegara okołodobowego na ludzką fizjologię i patofizjologię. Zaburzenia ludzkiego systemu okołodobowego obejmują: zmęczenie występujące po długotrwałej podróży (tzw. jet lag), lecz również bardziej chroniczne warunki jak zaburzenia snu bazujące na systemie okołodobowym i praca na zmiany (Reppert i Weaver, 2001).
Zrozumienie jak geny zegara i ich białka oddziałują na siebie, aby formować zegar molekularny dostarcza bezprecedensowych możliwości dla manipulacji famakologicznych mechanizmami zegara SCN. Badania te mogą przynieść wiele korzyści, takich jak rozwój farmakologicznych interwencji, które mogłyby szybko adaptować zegar biologiczny do nowych warunków czasowych. To może zrewolucjonizować terapie dolegliwości jak „jet lag”, zaburzeń snu i kilku neuropsychiatrycznych schorzeń (Reppert i Weaver, 2001).
Powiązania zegara biologicznego z cyklem komórkowym.
GENY ZALEŻNE OD Clock poza SCN
Analizy profilu ekspresji genów zegarowych u ssaków wykazały, że wiele z odpowiadających im produktów mRNA gromadzi się podczas cyklu okołodobowego w wielu tkankach obwodowych łącznie z wątrobą, mięśniami, nerkami, płucami, błonami śluzowymi jamy ustnej i skórą. Ponadto, pokolenie transgenicznych myszy skrywające gen lucyferazy wstawiony do wewnątrz promotorów Per1, Per2 lub Bmal1, pokazuje że tkanki obwodowe w hodowli zachowują rytmikę okołodobową. Wyniki tych analiz wykazały, że SCN nie jest niezbędne do napędzania oscylacji obwodowych. Rzeczywiście gryzonie z uszkodzonym SCN zachowują obwodowe oscylacje mRNA genów zegarowych. Ekspresja okołodobowa wszystkich obwodowych genów jest opóźniona o 3-9 godzin w porównaniu do ich maksymalnej ekspresji w SCN, sugerując że SCN posiada rolę w synchronizacji obwodowych rytmów okołodobowych (Borgs i wsp., 2009).
GENY ZALEŻNE OD Clock REGULUJĄ TRANSKRYPCJĘ GENÓW CYKLU KOMÓRKOWEGO
Przejścia między różnymi fazami cyklu komórkowego (G1, S, G2, M) są regulowane przez aktywność cyklin, kinaz zależnych od cyklin (CDKs) i inhibitorów CDK (CKIs), wliczając rodziny cip/kip i INK4 (Borgs i wsp., 2009).
Istnieją istotne dowody, że progresja w ramach cyklu komórkowego pojawia się o określonych porach dnia i nocy cyklu, sugerując że funkcją systemu zegara okołodobowego jest kontrolowanie tego podstawowego procesu. Rzeczywiście, analizy mikromacierzy wykazały, że kluczowe elementy machinerii cyklu komórkowego włączając cyklinę D1, cyklinę B1, cyklinę E, cyklinę A, P53, Wee1, c-myc, Mdm2 i Gadd45 wykazują ekspresję zależną od cyklu okołodobowego (Borgs i wsp., 2009).
Fazy G1/S. p21 regulują negatywnie progresję G1/S i rytmiczną ekspresję w licznych organach obwodowych (Borgs i wsp., 2009).
Region promotorowy p21 posiada dwa konserwatywne elementy RORE, zatem ekspresja okołodobowa p21 bezpośrednio wynika z alternatywnej aktywacji albo represji za pośrednictwem RORα i REV-ERBα, odpowiednio (Rys. 2A). Aktywacja p21 przez RORα prowadzi następnie do inhibicji progresji fazy G1. I na odwrót: REV-ERBα bezpośrednio wiążąc hamuje p21, które promuje progresję fazy G1 (Borgs i wsp., 2009).
Cykliny D1 są także pod kontrol rytmu okołodobowego. Ekspresja cykliny D1 jest znacznie podwyższona u myszy mutanta genów Per1 -/- Per Brdm1 prowadzi do skrócenia cyklu komórkowego i do wzrostu proliferacji komórek. W tym kontekście, geny Per1 i Per2 bezpośrednio promują ekspresję cyklin D1 przez inaktywowanie transkrypcji c-myc (Rys. 2B). Promotor c-myc zawiera wielokrotne sekwencje Ebox i może być kontrolowany przez czynniki transkrypcyjne zegara okołodobowego. U myszy mutatnta Per 1 -/- i Per 2 Brdm1, represja ekspresji c-myc jest kasowana, w wyniku tego następuje podwyższenie ekspresji cykliny D1 i wzrost proliferacji. Natomiast wykazano, w warunkach in vitro, że nadekspresja PER2 prowadzi do zatrzymania przebiegu cyklu komórkowego (Borgs i wsp., 2009).
Fazy G2/M. Wee1 jest kinazą tyrozynową, która fosforyluje CDK1 i przez to inaktywuje kompleks CDK1:Cyklina B będący kluczem regulatora przejścia G2/M. Promotor Wee1 zawiera trzy Eboxy, które są aktywowane przez heterodimery BMAL1:CLOCK lub BMAL1:NPAS2 i hamowane przez CRY (Rys. 2C). W ten sposób wysokie poziomy heterodimerów BMAL1:CLOCK lub BMAL1:NPAS2 aktywują ekspresję Wee1, która w konsekwencji fosforyluje kompleks CDK1:Cyklina B i inhibuje przejście C2 -> M cyklu komórkowego. Zakłócenia ekspresji genów okołodobowych mają bezpośredni wpływ na ekspresję Wee1. Zarówno myszy pozbawione Cry1 jak i Cry2 wykazują wysokie poziomy WEE1, prowadzące do upośledzenia proliferacji komórek. Natomiast u myszy z niedoborem Clock, poziom mRNA Wee1 obniża się znacznie. Na podstawie tych danych możemy wnioskować, że funkcjonowanie zegara okołodobowego jest niezbędne do sprawnej proliferacji in vivo (Borgs i wsp., 2009).
Odpowiedź na uszkodzenia DNA. W warunkach stresu, uszkodzone DNA u ssaków powoduje aktywację punktów kontrolnych cyklu komórkowego, która prowadzi do zatrzymania cyklu komórkowego, zapewniając czas na zreperowanie uszkodzeń. Białka czujnikowe, które wykrywają uszkodzenia DNA składają się z dwóch członków rodziny białek kinazowych fosfatydyloinozytolu seryny/treoniny: Ataxia Telangiectasia Mutated (ATM) i ATM and Rad3-related (ATR). Aktywacja ATR i ATM przekazuje sygnał uszkodzenia DNA poprzez fosforylację odpowiednio kinazy punktu kontrolnego 1 – Checkpoint kinase 1 (Chk1) lub Checkpoint kinase 2. (Chk2). Zarówno Chk1 jak i Chk2 są z kolei odpowiedzialne za zatrzymywanie cyklu komórkowego przez inaktywację CDKów (Borgs i wsp., 2009).
Ostatnie badania sugerują, że główne białka cyklu okołodobowego – PER1 i TIM są niezbędne do aktywacji Chk1 i Chk2. Zależna od ATM fosforylacja Chk2 jest zaburzana w komórkach ze specyficzną inhibicją ekspresji Per1. Podobnie regulacja oddolna TIM powoduje zmniejszenie fosforylacji Chk1 przez ATR, w rezultacie powodując nienormalną progresję cyklu komórkowego. PER1 i TIM mogą funkcjonować jako kofaktory do aktywacji ATM albo ATR odpowiednio, albo jako białka adaptorowe do naboru ATM lub ATR. Ta demonstracja bezpośrednich interakcji między genami rytmu okołodobowego i białkami punktów kontrolnych cyklu komórkowego stanowi podstawę do zaangażowania białek cyklu okołodobowego w odpowiedzi na stres (Borgs i wsp., 2009).
ZAKŁÓCENIA GŁÓWNYCH GENÓW ZEGAROWYCH PROWADZĄ DO ZABURZEŃ CYKLU KOMÓRKOWEGO.
Istnieją niezbite dowody, że zakłócenie aktywności zegara okołodobowego jest związane z rozwojem nowotworów (Tabela 2). Dodatkowe dysfunkcje cyklu okołodobowego spowodowane przez obustronne odjęcie SCN przyśpiesza tempo wzrostu wszczepionych guzów. Te rezultaty, w połączeniu z badaniami klinicznymi i epidemiologicznymi podkreślają związek pomiędzy zakłóceniem funkcjonowania zegara okołodobowego w nocnej pracy a ryzykiem nowotworzenia, sugerują że dezorganizacja koordynacji rytmu okołodobowego znacznie przyśpiesza rozwój nowotworów złośliwych (Borgs i wsp., 2009).
Interakcje między elementami zegara okołodobowego a cyklem komórkowym są wzajemne. Przy raku piersi ekspresja genów Per jest rozregulowana, także wiele komórek nowotworowych traci rytmikę okołodobową i zależną od czasu dnia progresję cyklu komórkowego. Ta różnica może zostać wykorzystana przez stosowanie leków antyproliferacyjnych o czasie, w którym są mniej szkodliwe dla zdrowych komórek – chronoterapia (Albrecht, 2006).
Transformacja zdrowej tkanki w nowotwór złośliwy zwykle występuje w rezultacie zakłócenia ekspresji genów zegara okołodobowego. Fu i in. byli pierwszymi, którzy wykazali, ze brak genu zegarowego (tzn. Per 2) czyni myszy bardziej podatnymi na raka po naświetlaniu promieniowaniem γ. Nadekspresja genów rytmów okołodobowych Per1 lub Per2 w linii komórek nowotworowych, doprowadza do hamowania ich wzrostu. Te badania sugerują, że do funkcji genu Per2 zalicza się supresję nowotworową. Efekt Per2 wydaje siębyć, przynajmniej częściowo, zależny od aktywności transkrypcyjnej β-kateniny. Wzrost aktywności β-kateniny, a w konsekwencji akumulacji swojej docelowej cyklazy D, która występuje u myszy mutanta Per2 Brdm1,przyśpiesza proliferację komórek rakowych. Podobnie, nadekspresja Per2 obniża aktywność β-kateniny (Borgs i wsp., 2009).
CKIε jest główną kinazą, która fosforyluje i degraduje PER2 poprzez proteosom. CKIε ulega nadekspresji w nowotworze i inhibicja CKIε powoduje spadek ekspresji cykliny B i cyklin A powodując zahamowanie wzrostu. W związku z tym jest prawdopodobne, że CKIε wywiera działanie onkogenne przez inhibicję funkcji supresji nowotworowej Per2 (Borgs i wsp., 2009).
Z drugiej strony, myszy mutanty Clock i Bmal1 nie wykazują skłonności do spontanicznego powstawania nowotworów nawet po naświetlaniu promieniowaniem γ, jednak wykazują wysoki stopień apoptozy i niski stopień proliferacji. Zaskakująco, zakłócenie genów Cry1 i Cry2 nie predysponują myszy do spontanicznego lub indukowanego promieniowaniem jonizującym powstawania nowotworu (Borgs i wsp., 2009).
Z powodu wadliwego działania zegar zdaje się przyśpieszać starzenie się, a tym samym wcześniejszą podatność na związane z wiekiem choroby, a w szczególności na rozwój raka. Trzeba zaznaczyć, ze Per2 pełni rolę hamującą rozwój raka i odpowiedź na uszkodzenia DNA przez regulację ekspresji genów zaangażowanych w regulację cyklu komórkowego jak C-Myc, Cyklin D1 i A, Mdm-2. Bezpośrednio steruje ekspresją genów cyklu komórkowego takimi jak wee1, który steruje ekspresją kinazy cykliny D1-Cd2, kluczowej w regulacji mitozy. Ekspresja genów zegarowych jest kontynuowana podczas podziału komórkowego i potomne komórki mają tą samą fazę jak ich komórka matczyna (Albrecht, 2006).
Jednak przy dzisiejszym, zmiennym, szybkim trybie życia, a szczególnie w systemie zmianowym, znacznie nadwyrężamy nasz system mechanizmu czasowego, a poprzez jego oddziaływanie na fizjologię organizmu, nadwyrężamy stan naszego zdrowia. Zmiany czasu są stosunkowo dobrze tolerowane u organizmów młodych, ale wraz z wiekiem mogą wystąpić liczne problemy jak zaburzenia układu pokarmowego, układu krążenia, choroby psychiczne, skłonności do nadużywania alkoholu – ilustruje to wzrost umieralności u starszych myszy z chronicznym jet-lag. Przyczyną tego jest zmienianie się organizacji mechanizmu okołodobowego wraz z wiekiem i w rezultacie zmniejszenie się amplitudy i rozdrobnienie spoczynkowej aktywności w trakcie cyklu tak samo jak zmniejszenie wrażliwości na przestawianie zegara przez światło przy zmianie strefy czasowej – dłużej więc trwa dostosowywanie (Albrecht, 2006).
Takie fenotypy zawansowane wiekiem mogą być spowodowane zmianami w mechanizmie zegarowym. Mutacja w genie Clock zakłóca cykl płciowy i utrzymywanie ciąży, prawdopodobnie jest to spowodowane regulacją poziomu prolaktyn przez zegar (Albrecht, 2006).
WNIOSKI
Geny zegara okołodobowego wykazujące ekspresję w SCN i w tkankach obwodowych posiadają wyraźnie znaczenie w kontroli cyklu komórkowego i supresji nowotworowej. Te wyniki teraz niosą ze sobą nowe pytania, które stanowią jeszcze większe wyzwanie, którym jest identyfikacja szczegółowych mechanizmów przez które geny zegara okołodobowego są związane z proliferacją komórek, nowotworzeniem i apoptozą w celu opracowania nowych, kierowanych terapii przezwyciężenia tych chorób (Borgs i wsp., 2009).
Trzeba pamiętać, że odkrycia FEC i dróg jego wyjścia otworzą drzwi na terapie zaburzenia rytmu jedzenia, takie jakich doświadczają pracujący na zmiany lub pacjenci cierpiący na syndrom nocnego jedzenia. Ich przypadłości często prowadzą do otyłości i schorzeń układu pokarmowego i krążenia (Feillet i wsp., 2006)
Lesions of the dorsomedial hypothalamus (DMH) – uszkodzenie grzbietowo-przyśrodkowe podwzgórza.
Porównaliśmy zmutowane myszy zarówno pod względem zarówno Per1 jak i Per2 przy ograniczonym dostępie do jedzenia i wykryliśmy, że nie ma znaczących zmian w wykazywaniu FAA u myszy mutantów Per1. Interesujące, ze myszy mutanty Per2 mają zaburzone wykazywanie jakiegokolwiek przystosowania do harmonogramu żywienia jak również brak zmian aktywności ruchowej, bez względu na stosowane warunki (LD, DD, LL, czy różne warunki żywienia). W drugim przypadku myszom dostarczano 66% ich normy spożycia kalorii, podając o różnych porach czasu, mierzonych jako średnia dzienna pobierania w przeciągu 2 tygodni ciągłego karmienia. Ten protokół żywienia jest znany z bardzo silnego wpływu na zegar SCN mając na uwadze nie tylko samo ograniczenie karmienia. Ponadto myszy tracą około 20 % swojej początkowej masy w czasie niskokalorycznego karmienia w przeciwieństwie do tradycyjnego ograniczonego sposobu karmienia, w którym myszy utrzymują zwykle stałą wagę. W dodatku do braku zmian aktywności ruchowej związanej z przewidywaniem karmienia zaobserwowano brak wzrostu temperatury – co wzmacnia hipotezę, że wykazują one poważne uszkodzenia funkcjonowania FEC, jak wynika z analizy zmienności obu objawów jego działania (Feillet i wsp., 2006). SYGNAŁY WYJŚCIA=OBJAWY DZIAŁANIA (przejawy)
Metabolizm i otyłość.
Zegary peryferyjne nie są wyłącznie podporządkowane SCN w mózgu. Harmonogram żywienia może działać bezpośrednio na zegary obwodowe, zmieniając ich fazę bez wpływu na SCN (Albrecht, 2006).
Połączenie między metabolizmem i zegarem biologicznym jest potwierdzone przez to, że DNA wiążące białka Clock jest regulowane przez stan redoks ko faktorów NAD. Ostatnie badania stwierdziły, ze zarówno metabolizm wpływa na zegar jak i odwrotnie. Zegar biologiczny jest np. zaangażowany w homeostazę glukozy (Albrecht, 2006).
Ze względu na nieregularny tryb życia nasze zegary są rozchwiane, a to może prowadzić do nieprawidłowych nawyków żywieniowych i otyłości. Ponadto krótki czas snu wiąże się z niskimi poziomami leptyny, podwyższonymi greliny, co w konsekwencji prowadzi do wzrostu masy ciała (Albrecht, 2006).
Stan psychiczny i sen.
Zegar wpływa przynajmniej częściowo na poziom glutaminianu, dopaminy, serotoniny oraz innych neuroprzekaźników, co może wpływać na stan psychiczny. Zatem jego zaburzenia mogą być jedną z przyczyn epilepsji. Ze względu na zbyt duży poziom glutaminianu przy mutacji genu Per2 zegar ma też wpływ na zachowanie i procesy uzależnień (brak wrażliwości muszek na kokainę) (Albrecht, 2006).
Co ciekawe narkotyki mogą także modulować działanie zegara. Wstrzyknięcie met amfetaminy powoduje wzrost ekspresji genu Per w niektórych tkankach i tym samym desynchronizować ich rytm względem SCN. Działanie niektórych narkotyków wydaje się także mieć wpływ na drogi przenoszenia sygnału, które mają także udział w resetowaniu mechanizmu zegarowego. Na przykład narkotyk Ecstasy zmienia odpowiedź agonisty receptora serotoninowego, który zmienia fazę zegara okołodobowego poprzez zwiększoną produkcję cAMP. Opioidy zaburzają system okołodobowy, sugerując możliwą jego rolę we wrażliwości na ból. Epizody depresji wynikają z zakłócenia homeostazy neuroprzekaźników. Równowaga ta mogłaby być przywrócona przez dostrojenie zegara okołodobowego, światło odgrywa ważną rolę w synchronizacji neuroprzekaźników do otoczenia (Albrecht, 2006).
Sen.
Fizjologiczny i psychiczny stan u ssaków zmieniający się w przeciągu dnia objawia się w cyklu snu i czuwania (Albrecht, 2006).
Neurony przez cały dzień są utrzymywane w stałej depolaryzacji. Także metabolizm glukozy w mózgu jest wyższy w trakcie czuwania i główny astroglejowy glukozowy przenośnik – GLUT1 tak samo jak geny mitochondrialne zaangażowane w oksydatywną fosforylację ulegają ekspresji w trakcie czuwania. Tak samo geny cyklu glutaminianowo-glutaminowego cyklu i geny glutaminergicznych receptorów. Chociaż czujność jest związana z nabywaniem pamięci, sen to czas sprzyjający konsolidacji pamięci. Wiele kluczowych komponentów za pomocą mechanizmów translacji ulega ekspresji w dużych ilościach podczas snu (Albrecht, 2006).
Podsumowując, sen jest stanem braku aktywności ruchowej, jest on związany z ekspresją wielu genów w mózgu. Sen i czuwanie działają na rzecz różnych procesów komórkowych. Transkrypcja w trakcie czuwania pomaga mózgowi w obliczu wysokiego zapotrzebowania na energię, wysokiej czułości synaptycznych połączeń, wysokiej aktywności transkrypcyjnej i w potrzebie odpowiedniego potencjału synaps do zapisywania nowych informacji, co wynika z regulacji wielu odpowiedzialnych za nie procesów. Sen, z drugiej strony działa na rzecz syntezy białek i wspomaga przejawy plastyczności synaptycznej (takie jak repolaryzacja synaptyczna) (Albrecht, 2006).
Sen składa się z homeostazy i procesów okołodobowych, a więc zegar okołodobowy jest częścią snu. Przykładowo, mutacje genów Per1 i Per2 u myszy wpływają na występowanie braku określonych pór snu w przeciągu 24h, ale nie mają wpływu na aktywność wolnofalowego EEG. Natomiast myszy z mutacjami dwóch genów naraz - zarówno Cry1 i 2 wykazują sen bez fazy REM. Występują silne powiązania miedzy regulacją snu a rytmem dobowym na poziomie molekularnym. Poziomy transkryptów związanych ze snem, a także te związane z czuwaniem zmieniają się w zależnosci od pory dnia. Przykładowo kwas retinowy wpływa na zegar okołodobowy obwodowych naczyń tak samo jak na synchronizację kortyzolu w czasie snu (Albrecht, 2006).
To prowadzi, oprócz bezpośredniej stymulacji wczesnych genów, do aktywacji genów Per1 i Per2 i do świetlnej regulacji akumulacji białek PER, biorących udział w dostosowywaniu zegara do światła dziennego. Mutacja Per2 prowadzi na przykład do takich przypadłości jak rodzinny zaawansowany syndrom fazy snu (FASPS) (Albrecht, 2006).
Mutacja Per2 prowadzi na przykład do takich przypadłości jak rodzinny zaawansowany syndrom fazy snu (FASPS) (Albrecht, 2006).
Opioidy zaburzają system okołodobowy (U. Albrecht, 2006)., sugerując możliwą jego rolę we wrażliwości na ból. Epizody depresji wynikają z zakłócenia homeostazy neuroprzekaźników. Równowaga ta mogłaby być przywrócona przez dostrojenie zegara okołodobowego, światło odgrywa ważną rolę w synchronizacji neuroprzekaźników do otoczenia (Albrecht, 2006).
Ciekawe pytania s.6 Clock 4 – 3 akapit
Związek z chorobą Alzheimera lub Parkinsona?
Poprawa efektywności środków farmakologicznych.
Indywidualne dostosowanie leczenia, wykrywanie niektórych chorób.
Czas jest wszędzie i ma ogromny wpływ na nasze zdrowie!
Ważne, Cymborowski, 31 strona.
s.10, Mammalian clock, 2001 – ważne
OUTPUTS – str. 2, Albrecht