Blokowanie translacji przez przyłączenie antysensownego RNA do mRNA

Jeśli mRNA jest transkrybowany na nici sensownej powstaje antysensowny RNA. Antysensowny RNA łączy się komplementarnie z mRNA i nie pozwala na jego przyłączenie się do rybosomu blokując translację.

Interferencja RNA (RNAi)

Jest to mechanizm „wyciszania” genów indukowany przez małe dwuniciowe cząsteczki RNA (dsRNA) o długości 21-26pz. W tym procesie bierze udział indukowany przez RNA kompleks wyciszający (RNA-induced silencing complex, RISC). Uważa się, że RNAi wywodzi się z mechanizmu obronnego organizmu przeciwko wirusom.

Małe cząsteczki RNA wyciszają geny poprzez:

• zapoczątkowanie degradacji komplementarnej nici dsRNA lub ssRNA,

• zablokowanie translacji komplementarnego RNA.

Ze względu na pochodzenie tych cząsteczek wyróżnia się:

• siRNA (small-interfering-RNA),

• miRNA (micro-RNA).

siRNA wchodzą w skład specjalnej rybonukleazy i nadają jej specyficzność do sekwencji. Ten kompleks siRNA-białko (RISC) rozpoznaje i degraduje mRNA o tej samej sekwencji co siRNA. W konsekwencji odpowiedni gen jest wyciszony, bo nie powstaje kodowane przez niego białko.

miRNA są podobne do siRNA, ale blokują specyficznie translację przyłączając się do mRNA. miRNA mają kilka niesparowanych zasad, w przeciwieństwie do całkowicie homologicznych siRNA. Są zaangażowane w negatywną regulację ekspresji genów podczas rozwoju.

Nagrodę Nobla w dziedzinie medycyny i fizjologii w 2006 r. otrzymali dwaj Amerykanie, Andrew Z. Fire i Craig C. Mello za odkrycie „zjawiska interferencji RNA” – polegające na wyłączaniu genów za pomocą dwuniciowych fragmentów RNA.

Translacja

Rola tRNA w syntezie białek

Cząsteczki tRNA tworzą połączenie pomiędzy mRNA i syntetyzowanym polipeptydem – tRNA wiąże się jednocześnie z mRNA i wydłużającym się polipeptydem, a także gwarantuje, że sekwencja aminokwasów polipeptydu jest zgodna z sekwencją zapisaną w mRNA.

W cytoplazmie każdej komórki znajduje się ok. 50-60 różnych typów tRNA. Ponieważ w kodzie genetycznym zapisanych jest tylko 20 aminokwasów, oznacza to, że we wszystkich organizmach występuje przynajmniej kilka izoakceptorowych tRNA (cząsteczek różniących się od siebie, które są specyficzne w stosunku do tego samego aminokwasu), np. tRNA^Gly1 i tRNA^Gly2.

Struktury tRNA

Sekwencja liniowa (struktura pierwszorzędowa) tRNA jest długości 60-95nt, zazwyczaj 76nt. W cząsteczce tRNA znajduje się 15 niezmiennych i 8 względnie niezmiennych nukleotydów; reszta nukleotydów zawiera zmodyfikowane zasady.

Cząsteczki tRNA, dzięki łączeniu się zasad w pary mogą tworzyć struktury drugorzędowe, nazywane liściem koniczyny. W skład tej struktury wchodzą:

• ramię akceptorowe – tworzy je siedem par zasad, powstałych z połączenia zasad wchodzących w skład 5’ i 3’ końcowej części cząsteczki. Aminokwas przyłączany jest do adenozyny znajdującej się na końcu 3’ tRNA,

• ramię D – w tej strukturze występuje zawsze zmodyfikowany (poprzez nasycenie wiązania podwójnego) nukleotyd – dihydrourydyna,

• ramię antykodonowe – zawiera trzy nukleotydy zwane antykodonem, które w czasie translacji łączą się z mRNA,

• pętla zmienna – zawiera różną liczbę nukleotydów, od 3 do 21,

• ramię TψC – zawiera sekwencję – tymina-pseudourydyna-cytozyna.

Nukleotydy wchodzące w skład pętli D i TψC łączą się w pary, wskutek czego cząsteczka tRNA zwija się i tworzy strukturę w kształcie litery L (struktura trzeciorzędowa).

Aminoacylacja tRNA

W reakcji z ATP następuje aktywacja aminokwasu, który następnie przenoszony jest na koniec 3’ tRNA. Wytwarza się wiązanie między grupą –COOH aminokwasu i grupą –OH połączoną z węglem 2’ lub 3’ reszty cukrowej ostatniego nukleotydu (A) → powstaje
aminoacylo-tRNA.

Produkt reakcji aminoacylacji:

• aminokwas + ATP → aminoacylo-AMP + PPi

• aminoacylo-AMP + tRNA → aminoacylo-tRNA + AMP

Aminoacylacja tRNA przeprowadzana jest przez syntetazy aminoacylo-tRNA. Organizmy mają zwykle 20 różnych rodzajów tych enzymów, po jednym dla każdego aminokwasu (np. syntetaza seryno-tRNA – dla seryny, syntetaza leucylo-tRNA – dla leucyny). Syntetazy charakteryzują się dużą specyficznością w stosunku do cząsteczek tRNA, a także mają zdolność do korygowania błędów w przyłączaniu aminokwasów (redagowania). Syntetazy rozpoznają swoiste dla nich cząsteczki tRNA na podstawie sekwencji antykodonu oraz sekwencji ramienia akceptorowego.

Oddziaływania kodon-antykodon

Specyficzność oddziaływań między kodonem w mRNA i antykodonem w tRNA gwarantuje, że synteza białek zachodzi zgodnie z zasadami kodu genetycznego. Kod genetyczny jest trójkowy – jeden znak kodu (kodon) składa się z trzech nukleotydów.

Ramka odczytu – jedna z trzech zachodzących na siebie sekwencji trójek nukleotydowych zawartych w sekwencji DNA.

Otwarte ramki odczytu (ORF, open reading frame) – rejony, które potencjalnie kodują białka (nie jest znany polipeptyd będący ich produktem). W sekwencji DNA identyfikuje się ciąg kodonów zaczynający się kodonem start i kończący się kodonem stop. Jeśli wiadomo, że konkretne ORF koduje białko, to mówi się o rejonie kodującym.

Oddziaływanie kodon-antykodon jest procesem opierającym się na łączeniu się w pary zasad wchodzących w skład antykodonu w tRNA i kodonu w mRNA.

Kod genetyczny ulega translacji z udziałem dwóch współdziałających adaptorów:

• syntetazy aminoacylo-tRNA, która łączy aminokwas z tRNA,

• tRNA, którego antykodon tworzy pary zasad z kodonem mRNA.

Oddziaływanie kodon-antykodon

Niektóre cząsteczki tRNA rozpoznają więcej niż jeden kodon – zasada tolerancji Cricka:

• dwie pierwsze zasady kodonu tworzą standardowe pary z zasadami antykodonu, zatem kodony różniące się zasadami w jednej z pierwszych dwóch pozycji muszą być rozpoznawane przez różne tRNA,

• pierwsza zasada antykodonu decyduje, czy dany tRNA rozpoznaje dwa, czy trzy rodzaje kodonów. Tak więc degeneracja kodu genetycznego wynika po części ze swobodniejszego parowania się trzeciej zasady kodonu z pierwszą zasadą antykodonu.

• np. antykodon tRNA alaninowego u drożdży ma sekwencję IGC (I – inozyna, zmodyfikowany nukleozyd, tworzony w reakcji deaminacji adenozyny na poziomie tran skryptu) i rozpoznaje kodony GCU, GCC i GCA.

Odczytywanie informacji zawartej w mRNA odbywa się na rybosomach

Rybosom – duży kompleks złożony z 50 różnych białek i kilku cząsteczek rybosomowych RNA (rRNA). Typowa komórka zawiera w cytoplazmie miliony rybosomów (część w stanie wolnym w cytozolu, część związana z białkami retikulum endoplazma tycznego).

Rola rybosomów:

• koordynują syntezę białka poprzez umieszczenie we właściwych w stosunku do siebie pozycjach mRNA, aminoacylo-tRNA i czynników białkowych biorących udział w translacji,

• składniki rybosomu katalizują przynajmniej kilka reakcji chemicznych zachodzących w czasie translacji.

Struktura rybosomu:

• każdy rybosom składa się z dwóch podjednostek o wielkości 60S i 40S u Eucaryota oraz 50S i 30S u bakterii,

• duża podjednostka rybosomu eukariotycznego zawiera trzy cząsteczki rRNA – 28S, 5,8S i 5S, a bakteryjnego dwie – 23S i 5S,

• w obydwu grupach organizmów mała podjednostka rybosomu zawiera jedną cząsteczkę rRNA: u eukariotów 18S, a u prokariotów 16S,

• w skład obydwu podjednostek wchodzą różne białka rybosomowe.

Rybosom pełni funkcje:

• podjednostki dekodującej, przepisującej kod zapisany w mRNA na sekwencje białka (mała podjednostka),

• transferazy peptydylowej, katalizatora powstawania wiązania peptydowego (duża podjednostka),

• mikroautomatu przemieszczającego się wzdłuż łańcucha mRNA i przepuszczającego przez siebie w procesie translokacji kolejne cząsteczki tRNA (całość rybosomu).

Etapy translacji:

• inicjacja – organizowanie się kompleksu rybosom-mRNA,

• elongacja – powtarzane cykle dodawania aminokwasów,

• terminacja – uwolnienie łańcucha polipeptydowego.

Inicjacja u bakterii

Rybosomy rozdysocjowują na podjednostki pozostające w cytoplazmie aż do wejścia w nową rundę translacji. Translacja rozpoczyna się, gdy mała podjednostka rybosomu, połączona z czynnikiem inicjacyjnym IF-3 (initiation factor), przyłącza się do miejsca wiązania rybosomu (rbs, ribosome binding site), gdzie jest sekwencja najwyższej zgodności 5’-AGGAGGU-3’, położona w odległości 3-10 nukleotydów powyżej kodonu inicjacyjnego, komplementarna do konserwatywnej sekwencji na końcu 3’ 16S rRNA.

Dzięki temu mała podjednostka zostaje umiejscowiona w rejonie kodonu inicjacyjnego – najczęściej 5’-AUG-3’, kodującego metioninę. Inicjatorowy tRNA jest poddawany aminoacylacji przez metioninę, a następnie modyfikowany przez konwersję metioniny do N-formylometioniny (przyłączanie grupy formylowej –COH do grupy aminowej).

Wolna grupa karboksylowa inicjatorowej metioniny uczestniczy w tworzeniu wiązania peptydowego. Inicjatorowy tRNA_j^met jest dostarczany do małej podjednostki przez czynnik inicjacyjny IF-2. Inicjacja kończy się w momencie związania czynnika IF-1, który stabilizuje kompleks inicjacyjny, umożliwiając przyłączenie dużej podjednostki rybosomu.

Inicjacja translacji u E. coli

• powstanie kompleksu preinicjacyjnego, złożonego z czynników inicjacyjnych IF-1 i IF-3 oraz podjednostki 30S. Wiązanie z kodonem inicjacyjnym, przy współudziale sekwencji wiążącej 16S rRNA,

• tworzenie kompleksu inicjacyjnego poprzez dołączenie fM-tRNA^fMet oraz czynnika inicjacyjnego związanego z GTP,

• zakończenie formowania kompleksu inicjacyjnego. Hydroliza GTP, uwolnienie czynników inicjacyjnych IF-1 i IF-2 oraz dołączenie dużej podjednostki rybosomowej 50S.

Stuktura typowej prokariotycznej cząsteczki mRNA

Rybosomy prokariotyczne inicjują syntezę białka po rozpoznaniu miejsc wiązania rybosomów – w początkowych odcinkach transkryptu oraz wewnątrz sekwencji mRNA. Umożliwia to prokariotom syntezę więcej niż jednego białka na podstawie informacji zawartej w jednym mRNA.

Inicjacja u eukariotów

Kompleks preinicjacyjny (podjednostka rybosomu 40S + inicjatorowy tRNA_j^met + czynnik inicjacyjny eIF-2) wiąże się z końcem 5’ mRNA przy udziale kompleksu wiążącego się z czapeczką eIF-4F oraz eIF-3. W inicjacji translacji bierze również udział poli(A). Może on odgrywać rolę regulacyjną – wydaje się, że jego długość koreluje z wydajnością inicjacji z różnych cząsteczek mRNA.

Po połączeniu z końcem 5’ kompleks inicjacyjny skanuje mRNA i znajduje kodon inicjacyjny 5’-AUG-3’, który wchodzi w skład konserwatywnej sekwencji Kozak 5’-ACCAUGG-3’. Potem przyłącza się duża podjednostka rybosomu. W procesie tym biorą udział czynniki inicjacyjne eIF-5 i eIF-6. Taki mechanizm inicjacji powoduje, że eukariotyczny mRNA zwykle zawiera informacje o syntezie tylko jednego białka.

Elongacja translacji

Przebiega podobnie u bakterii i eukariotów. Po przyłączeniu dużej podjednostki rybosomu powstają dwa miejsca, z którymi moż się wiązać aminoacylo-tRNA:

• miejsce peptydylowe (P) - tRNA_j^met połączony z kodonem inicjacyjnym,

• miejsce akceptorowe (A) – drugi kodon otwartej ramki odczytu.

Etapy elongacji:

• dostarczenie aminoacylo-tRNA,

• tworzenie wiązań peptydowych,

• translokacja (przemieszczanie).

Miejsce A zajmuje odpowiedni aminoacylo-tRNA, umiejscowione przez czynnik elongacyjny EF-Tu. Następnie peptydylotransferaza odłącza aminokwas od inicjatorowego tRNA_j^met, który znajduje się w miejscu P i tworzy wiązanie peptydowe między tym aminokwasem a aminokwasem połączonym z drugim tRNA.

Następnym etapem translacji jest translokacja, przebiegająca z udziałem kompleksu EF-G (translokazy), który wiąże się do rybosomu. Rybosom przesuwa się o trzy nukleotydy tak, że następny kodon wchodzi w miejsce A, a peptydylo-tRNA przesuwa się z miejsca A na miejsce P. U bakterii deacetylowany tRNA przesuwa się z miejsca P na miejsce wyjścia (E), a u eukariotów jest usuwany z rybosomu.

Cykl elongacyjny jest powtarzany aż do końca otwartej ramki odczytu.

Terminacja translacji

Proces syntezy białka kończy się w momencie napotkania jednego z trzech kodonów terminacyjnych /nonsensownych (UAA, UGA, UAG). W miejsce A wchodzi nie cząsteczka tRNA, a czynnik uwalniający (RF, release factor). W wyniku terminacji następuje odłączenie od tRNA kompletnego polipeptydu, znajdującego się w miejscu P oraz rozdysocjowanie kompleksu translacyjnego. W dysocjacji podjednostek rybosomowych bierze udział czynnik RRF (ribosome recycling factor), a w odłączeniu tRNA od rybosomu i w zahamowaniu ponownego przyłączania się podjednostek niezbędny jest IF-3 (podwójna rola tego czynnika w translacji).

Ulegające translacji cząsteczki mRNA zwykle występują w postaci polirybosomów (polisomów) stanowiących duże cytoplazmatyczne agregaty, w skład których wchodzi kilka (a nawet do 50) rybosomów działających na jednej cząsteczce mRNA i odległych od siebie o około 80 nukleotydów. Stwarza to możliwość wielokrotnej inicjacji i powstanie w jednostce czasu więcej cząsteczek białka.

Końcowym efektem ekspresji jest proteom, zestaw funkcjonalnych białek w żywej komórce.

„Omiki”:

• genomika – dziedzina nauki, której celem jest badanie całych genomów oraz analiza funkcjonowania zawartych w nich genów,

• proteomika – zajmuje się całościową analizą białek zawartych w komórce, czyli proteomu,

• transkryptomika – bada transkryptom, czyli cząsteczki mRNA,

• interaktomika – zajmuje się badaniem całokształtu oddziaływań między białkami w komórce,

• metabolomika – stara się całościowo przedstawić wszystkie reakcje biochemiczne oraz ich substraty i produkty.