Białka znajdują się we wszystkich komórkach i płynach ustrojowych żywego organizmu. Pełnią tam funkcje zarówno strukturalne jak i związków biologicznie czynnych. Opracowano szereg metod służących analizie tych związków. Jedną z nich jest próba biuretowa. Polega ona na zmieszaniu odczynnika miedziowego z badanym roztworem białka w wyniku czego otrzymujemy fioletowe zabarwienie.

Na rysunku obok przedstawiono wyniki próby biuretowej dla roztworów białka o różnym steżeniu.

Od lewej: 
- odczynnik miedziowy bez białka
- kazeina 0,2%
- kazeina 0,4%
- kazeina 0,6%
- kazeina 0,8%
- kazeina 1,0%

Zadanie

Pozytywny wynik próby biuretowej wskazuje na obecność w roztworze:

białka, dipeptydu, wiązań peptydowych, wiązań wodorowych, polipeptydu

Komentarz:

Podczas reakcji biuretowej powstaje barwny kompleks miedzi z wiązaniem peptydowym. Niezbędnym warunkiem jest obecność co najmniej 2 wiązań peptydowych czyli tripeptydu.
Dzięki tej reakcji możemy nie tylko potwierdzić obecność białka a więc wiązań peptydowych w roztworze, ale także w oparciu o intensywność powstałej barwy ocenić stężenie tego białka.
Metoda biuretowa może być stosowana do oznaczeń w roztworach gdzie przewidywane jest duże stężenie białka – ilości na poziomie gramów i miligramów. Do spodziewanych mniejszych ilości (mikrogramy) możemy używać metody Lowry z odczynnikiem Folina. W pierwszym etapie wykonujemy reakcję biuretową w środowisku zasadowym a w drugim redukcję kwasu fosforowolframowego i fosforomolibdenowego do tlenków przez miedź związaną z białkiem oraz tyrozyną i tryptofanem. Absorbancję odczytujemy przy długości fali 750 nm. Metoda Bradford wykorzystuje błękit kumazyny (Coomasie Brilliant Blue) przy długości fali 595 nm. Natomiast przy długości fali 280 nm można oznaczać stężenia niewielkich ilości białek dzięki właściwościom aminokwasów aromatycznych, które absorbują światło w zakresie ultrafioletu.

Grupy SH są bardzo istotne dla tworzenia mostków disiarczkowych i struktur wtórnych białek. Ze względu na łatwość utleniania i redukcji mają także swój udział w wielu procesach biochemicznych. Próba cysteinowa pozwala na wykrycie siarki z grupy SH.

Na rysunku od lewej: 2 negatywne wyniki próby cysteinowej, wynik pozytywny.

Zadanie   

Które aminokwasy wykrywamy tą próbą:

Cysteina

Wynik pozytywny próby ujawnia się wydzieleniem siarkowodoru oraz powstaniem siarczku ołowiu powodującego ciemnienie roztworu.
Alifatyczny łańcuch cysteiny ma charakter hydrofobowy. Aminokwas jest syntetyzowany endogennie z metioniny oraz seryny z tego powodu bywa uznawany za względnie egzogenny (w sytuacji niedoboru metioniny). Odwodorowanie cysteiny prowadzi do powstania cystyny, utlenienie do kwasu cysteinowego zaś dekarboksylacja do tauryny. Deaminacja wraz z desulfuracją prowadzą do wytworzenia kwasu pirogronowego dlatego zaliczamy ten aminokwas do glukogennych.
Cysteina bierze udział w syntezie koenzymu A oraz glutationu. Metabolit cysteiny – tauryna ulega sprzęganiu z kwasami żółciowymi tworząc kwasy taurocholowe.
Znana jest dziedziczna choroba metaboliczna – cystynuria w przebiegu której dochodzi do wzrostu wydalania z moczem cystyny oraz lizyny. Ze względu na słabą rozpuszczalność cystyny tworzą się wtedy w kanalikach nerkowych kamienie cystynowe. 
Próba daje wynik negatywny w przypadku metioniny, ponieważ atom siarki zablokowany jest przez grupę CH3. Metionina jest aminokwasem egzogennym. Jako adenozylometionina jest donorem grupy metylowej w ważnych reakcjach biochemicznych np. w syntezie adrenaliny kreatyny, choliny czy metylohistydyny

Tyrozynemia (tyrozynoza) to choroba genetyczna będąca skutkiem mutacji. Efektem tej mutacji jest brak enzymu hydroksylazy fumaryloacetooctanowej (FAH) oraz/lub niedobór aminotransferazy tyrozynowej. 
Skutkiem choroby jest opóźnienie rozwoju umysłowego i uszkodzenie narządu wzroku, a także uszkodzenie wątroby mogące prowadzić do zmian nowotworowych oraz uszkodzenie nerek z krzywicą hipofosfatemiczną.
W moczu chorego pojawia się nadmiar tyrozyny w postaci kryształów (tyrozynuria). 

Na rysunkach obok przedstawiono wzór tyrozyny, oraz wynik próby umożliwiającej wykrycie tego aminokwasu w (licząc od lewej) peptonie, żelatynie i białku jaja kurzego. 
Jaka jest nazwa tej próby?
 próba Millona

Komentarz:

Próba Millona jest testem charakterystycznym na wykrycie obecności tyrozyny. Podczas ogrzewania tyrozyny z odczynnikiem Millona (mieszanina jonów rtęciowych oraz azotanowych) powstają rtęciowe pochodne nitrotyrozyny o zabarwieniu czerwonym.

Tyrozyna jest uznawana za aminokwas względnie egzogenny, którego łańcuch boczny ma charakter słabo hydrofobowy ze względu na obecność grupy hydroksylowej, która może uczestniczyć w tworzeniu wiązań wodorowych oraz w procesach fosfoestryfikacji. Jest aminokwasem gluko- i ketogennym ponieważ w wyniku jej przemian uzyskujemy kwas fumarowy oraz acetooctowy. Tyrozyna ulega przemianie do hormonów: tarczycy (trijodotyronina, tyroksyna), tyraminy, dopaminy, adrenaliny oraz noradrenaliny a także barwników skóry oraz tęczówki – melanin. Stąd brak tego aminokwasu może być związany z niedoczynnością tarczycy, co może objawiać się w postaci zmęczenia i wyczerpania. Zmniejszenie ilości tyrozyny powoduje niedobór norepinefryny i dopaminy, co może spowodować depresję. Jest ważnym składnikiem w produkcji kolagenu, głównego włóknistego białka ustroju.
Tyrozyna powstaję endogennie z fenyloalaniny. Fenyloalanina może także być wykorzystywana do syntezy ubichinonu.

Wśród testów wykrywających aminokwasy jest wiele reakcji charakterystycznych dla aminokwasów aromatycznych.
Jedną z nich jest reakcja sprzęgania z kwasem glioksalowym (reakcja Adamkiewicza-Hopkinsa).
 

Komentarz: W środowisku kwaśnym tryptofan reaguje z aldehydami, między innymi z kwasem glioksalowym (CHO-COOH) (reakcja Adamkiewicza-Hopkinsa) lub aldehydem mrówkowym (reakcja Voisseneta), dając barwne produkty kondensacji. W kwaśnych hydrolizatach peptydów lub białek wynik tej reakcji jest ujemny, ponieważ tryptofan podczas kwaśnej hydrolizy ulega zniszczeniu.

Tryptofan jest aminokwasem egzogennym, jego łańcuch boczny ma charakter silnie hydrofobowy. W wyniku przemian tryptofanu powstaje kwas nikotynowy a następnie jego amid. Noworodki z tryptofanu mleka matki uzyskują witaminę B3. Tryptofan przekształca się także w hormony: melatoninę, serotoninę oraz tryptaminę. W przewodzie pokarmowym przy udziale bakterii powstaje indol i skatol.

Po zmieszaniu roztworu aminokwasów ze stężonym kwasem azotowym(V) i podgrzaniu w płomieniu palnika powstają żółte pochodne nitrowe.

Na rysunku obok przedstawiono wynik próby ksantoproteinowej dla peptonu, żelatyny i białka jaja kurzego (w kolejności od lewej).

Jakie ugrupowania w strukturze aminokwasów można wykrywać tą reakcją? Jakie aminokwasy je posiadają?

A    aromatyczne    pierścień aromatyczny

B    tryptofan    tryptofan

C    tyrozyna    tyrozyna

D    fenyloalanina    fenyloalanina
Komentarz:

Dzięki reakcji ksantoproteinowej wykrywamy obecność pierścieni aromatycznych w aminokwasach aromatycznych w roztworze zarówno samych aminokwasów jak i białek.
Do aminokwasów aromatycznych zaliczamy egzogenne tryptofan i fenyloalaninę oraz względnie egzogenna tyrozynę 

Poszczególne białka różnią się ilością i kolejnością poszczególnych aminokwasów wchodzących w ich skład. Wpływa to na wartość odżywczą danego białka. Wyróżniamy białka doborowe zawierające wszystkie egzogenne aminokwasy w odpowiednich proporcjach oraz białka niedoborowe, które nie spełniają obydwu tych warunków. 

Jakie próby laboratoryjne można wykonać w roztworze białka w celu stwierdzenia jego doborowości? 

A				Adamkiewicza Hopkinsa
B				Millona
C				Ksantoproteinowa
E				Cysteinowa

Komentarz:

Liczba i sekwencja aminokwasów w białku jest zdeterminowana genetycznie. Pozwala to na stworzenie ściśle określonej struktury przestrzennej a tym samym ściśle zdefiniowanej aktywności biologicznej.
Aminokwasy egzogenne nie mogą być syntetyzowane w komórkach i dostarczane są z dietą. Stąd odpowiednia zawartość tych aminokwasów w danym białku czyni je wartościowym i koniecznym dla właściwego funkcjonowania organizmu.
Próba biuretowa pozwala na stwierdzenie obecności ewentualnie pomiar stężenia białka, nie daje możliwości oceny jakościowej tego białka.
Próba cysteinowa wykrywa obecność cysteiny, która nie jest aminokwasem egzogennym ale według niektórych autorów zaliczana jest do grupy względnie egzogennych z powodu udziału metioniny w jej endogennej syntezie. 
. 
Próby Adamkiewicza Hopkinsa oraz ksantoproteinowa pozwalają na wykrycie obecności aminokwasów aromatycznych, które są egzogenne. Próba Millona wykrywa tyrozynę, która jest względnie egzogenna. Jest egzogenna w sytuacji braku fenyloalaniny, z której powstaje w komórkach.

Komentarz:

A – jajko jest białkiem doborowym i stanowi wzorzec optymalnego składu aminokwasowego. Według białka jaja oceniane są właściwości odżywcze i dietetyczne innych białek w diecie.
B – żelatyna jest białkiem niedoborowym. Pozyskiwana jest z kości i chrząstek zwierzęcych, i zawiera duże ilości glicyny, proliny i hydroksyproliny. Rozpuszczona w wodzie tworzy układ koloidowy (zol), który łatwo przechodzi w żel, o ile temperatura otoczenia nie jest zbyt wysoka.
Żelatyna ma szerokie zastosowanie w przemyśle spożywczym (emulgator i dodatek do żywności (E441). Używana jest także do produkcji emulsji światłoczułych oraz stosowana jako zagęszczacz w licznych farmaceutykach i kosmetykach.
C – pepton to mieszanina polipeptydów tworząca się podczas enzymatycznej hydrolizy białek pod wpływem pepsyny. Może zawierać także wolne aminokwasy. Nie koaguluje, nie wysala się. Jest rozpuszczalny w wodzie ale nierozpuszczalny w etanolu i eterze. Jest używany jako pożywka do hodowli bakteryjnych.

Aminokwasy są związkami dwufunkcyjnymi a ich właściwości chemiczne opierają się na właściwościach tych grup.
W zależności od pH roztworu, w jakim się znajdują zachowują się jak kwas lub zasada. Istnieje charakterystyczne dla każdego aminokwasu pH, w którym zjonizowane są obydwie grupy. Wtedy aminokwas jest elektrycznie obojętny. Jest to tzw. punkt izoelektryczny. Odnosi się to także do cząsteczek peptydów i białek.

Komentarz:

Amfoteryczność aminokwasów przekłada się na właściwości buforowe białek osocza krwi i układ ten bierze udział w regulacji równowagi kwasowo-zasadowej krwi. Znajomość właściwości aminokwasów i białek w różnych zakresach pH środowiska wykorzystywana jest do izolacji białek podczas elektroforezy. 

Ze względu na obecność grup funkcyjnych odpowiednio naładowanych w zależności od pH roztworu białka tam się znajdujące otoczone są płaszczem hydratacyjnym stworzonym przez dipole wody. To powoduje, że cząsteczki białek są utrzymywane w pewnej odległości od siebie i są w stanie rozpuszczonym. Dodanie do takiego roztworu, soli nieorganicznych jak np. siarczan amonu lub zimnego alkoholu czy acetonu powoduje odciągnięcie dipoli wody od cząsteczek białka, zniszczenie płaszcza wodnego i w konsekwencji agregację cząsteczek i ich wypadanie na dno probówki. Każde białko ze względu na specyficzną budowę i charakterystyczny rozkład ładunków wymaga innego stężenia soli nieorganicznych do wysolenia.

Komentarz:

Wysalanie to przede wszystkim proces służący rozdzieleniu i oczyszczeniu białek. Jest odwracalny – usunięcie czynnika wysalającego przywraca płaszcz wodny i stan rozpuszczenia. Wysalanie nie niszczy struktur białek, więc nie wpływa na ich aktywność biologiczną.

Metody spektrofotometryczne należą do instrumentalnej analizy ilościowej i są często wykorzystywane w laboratoriach diagnostycznych. Opierają się na pomiarach pochłanianego przez cząsteczki promieniowania elektromagnetycznego. Umożliwiają oznaczenie stężenia badanej substancji w oparciu o pomiar intensywności zabarwienia roztworu. Wykorzystuje się tu prawo Lamberta – Beera. Niezbędna do obliczeń jest krzywa wzorcowa.

Jaką zależność musi przedstawiać krzywa wzorcowa, aby mogła być wykorzystana do obliczeń?

zależność stężenia badanej substancji od intensywności zabarwienia
zależność stężenia badanej substancji od absorbancji

Komentarz:

Przyporządkowanie poszczególnym znanym stężeniom badanej substancji odpowiedniego zabarwienia wyrażonego absorbancją zmierzona przez aparat umożliwia wyznaczenie krzywej wzorcowej, która potem służy do obliczeń nieznanego stężenia w oparciu o pomiar absorbancji. Niezbędnym warunkiem jest przezroczystość roztworu oraz identyczna grubość warstwy roztworu badanego i wzorcowego. W zależności od zakresu wykorzystywanego widma można wyróżnić spektrofotometrię w nadfiolecie, w świetle widzialnym i w podczerwieni.

Do lekarza weterynarii trafił młody pies w słabej kondycji fizycznej, wychudzony mimo zachowanego apetytu, z przetłuszczającą się i matową sierścią, z objawami biegunki. Zalecono badanie biochemiczne krwi, moczu, kału. Zmierzono miedzy innymi także stężenie białka w osoczu przy pomocy próby biuretowej. Wynik badania widoczny jest na obrazku.

Jaki jest zakres prawidłowych wartości stężenia białka całkowitego w osoczu krwi?

66-87 g/dm3

Komentarz:

Pomiar stężenia białka w osoczu ma znaczenie diagnostyczne w szeregu jednostek chorobowych. Możemy mieć do czynienia z hypo- lub hyperproteinemią. Ze względu na niejednorodny charakter białek osocza zaburzenia mogą dotyczyć nie tylko stężenia białka całkowitego, ale także poszczególnych frakcji lub ich wzajemnego stosunku bez wpływu na stężenie białka całkowitego.
W podanym przykładzie pies cierpi na zewnątrzwydzielniczą niewydolność trzustki. W przebiegu tej choroby uszkodzeniu ulegają komórki trzustki produkujące enzymy trawiące białko (a także cukry i tłuszcze) w przewodzie pokarmowym. Białka z diety nie mogą więc być rozłożone a aminokwasy wchłonięte i wykorzystane do syntezy białek. Stężenie białka całkowitego w osoczu spada.
Aktualnie laboratoria diagnostyczne posługują się gotowymi zestawami odczynników do pomiaru stężenia białka całkowitego w osoczu. Ocena ilościowa i jakościowa poszczególnych frakcji białkowych wymaga innych metod np. elektroforezy.

W oparciu o budowę chemiczną aminokwasów stworzono szereg metod ich ilościowego oznaczania. Jedną z nich (a zarazem najprostszą) jest miareczkowanie formolowe według Sorensena.

Stężenie której grupy funkcyjnej aminokwasów oznaczamy tą metodą?

Aminowa

Komentarz:

Aldehyd mrówkowy reaguje z grupami aminowymi aminokwasów dając pochodne metylowe. Z każdej grupy aminowej uwalniany jest jeden jon wodorowy, który odmiareczkowuje się mianowanym roztworem zasady wobec fenoloftaleiny.
Do ilościowego oznaczania aminokwasów może służyć także metoda ninhydrynowa.