Transformacja to proces nabywania przez komorki nowych genów poprzez aktywne pobranie DNA z otoczenia.
W przypadku gdy pobierane jest genomowe DNA, musi nastąpić trwała integracja z własnym materiałem genetycznym, tak aby ulegał on replikacji. W wyniku tego procesu komorki nabjwvająnowych cech, ktore zwiększają ich szanse przeżycia w niekorzystnych warunkach środowiska i mogą być przekazywane komarkom potomnym. Transfonnacja nie wymaga bezpośredniego kontaktu dwoch komórek ani pośrednictwa faga.
Transformacja niehomologicznym DNAjest możliwa, o ile transfonrrujące DNAjest zintegrowane w wektorze prokariotycznym (plazmidowym lub fagowym). Wektory to cząsteczki DNA mające zdolność samoreplikacji w komórce gospodarza, co umożliwia nanmażanie włączonych do nich fragmentów DNA.
stopnia pokrewiefistwa (maleje wraz z malejącym stopniem pokrewieństwa),
liczby kompetentnych komórek biorcy,
stężenia DNA (zależność ta jest liniowa, ale zwiększenie stężenia powyżej dawki nasycenia nie powoduje wzrostu liczby transformantów),
odpowiedniej temperatury.
Plazmidy to pozachromosomowe, stabilne cząsteczki kwasów nukleinowych koduj ące niewielką liczbę genów nieistotnych dla podstawowego metabolizmu komórki.
Podstawowe cechy plazmidów:
l. Posiadają sekwencje art (ang. origirr) odpowiedziahre za inicjację replikacji.
Replikują zależnie lub niezależnie od chromosomowego DNA. Do replikacji wykorzystują enzymy komórkowe (kodowane przez DNA chromosomowe), większe plazmidy kodują własne enzymy.
Zawierają geny, które nie występują na chromosomie bakteryjnym (np. geny opomości na antybiotyki).
Niektóre integrują do genomu i w tak zintegrowanej formie zwanej episomem przechodzą podziały komórkowe, po czym ponownie oddzielają się od chromosomu.
W komórce może występować kilka rodzajów plazmidów, o ile wykazują zgodność (liczba plazmidów jest różna u różnych gatunków bakterii).
plazmidy typu R - niosą geny oporności na antybiotyki, np. ampicylinę, chloramfenikol,
plazmidy typu F - przenoszą geny w procesie koniugacji, warunkują wytworzenie Íimbrii, w formie F‘ mogą przenosić geny dodatkowe przejęte z chromosomu,
plazmidy kolicynowe - kodują białka zwane kolicynami, zabijające inne bakterie,
plazmidy degradacyjne - kodują białka iunożliwiaj ące rozkład nietypowych związków (np. toluenu, kwasu salicylowego),
plazmidy wirulencji - nadająbakteriom zdolność do wywoływania chorób (np. plazmid Ti z Agraóncraritaa raarefaciens, powodujący chorobę roślin zwaną guzowatością korzeni).
Wejście komórki w stan kompetencji.
Absorpcja DNA na powierzchni komórki.
Pobranie DNA do wnętrza komórki.
Wbudowanie egzogemiego genomowego DNA do własnego genomu poprzez rekombinację lub doreplikowanie drugiej nici DNA w przypadku transformacji plazmidowym DNA.
Stan, w którym bakterie mogą być transformowane nazywamy stanem kompetencji. Przypuszcza się, że stan ten związany jest z protoplastyzacją ściany komórkowej. Protoplastyzacja polega na miej scowym braku lub niedorozwoju ściany komórkowej, skutkiem czego błona cytoplazmatyczna styka się bezpośrednio ze środowiskiem.
Komórki wytwarzają białkowy czynnik kompetencji, którego ilość zmienia się w czasie wzrostu bakterii (bakterie niewytwarzające tego czymżiika nie ulegają transformacji). Czynnik kompetencji wchodzi w interakcję z błonowym receptorem, który po aktywacji wysyła sygnał do chromosomowego DNA i umożliwia ekspresję genów kompetencji . Produktami tych genów są białka specyficzne dla stanu kompetencji, jednym z nich są autolizyny, które ułatwiają ekspozycję nukleaz i białek wiążących DNA na powierzchni komórki.
dla uzyskania kompetentnych komórek E. coli
zastosowali CaCl1, jony Cel* bowiem zwiększają przepuszczalność ściany komórkowej. Potraktowane Cali komórki stają się kompetenme imożna je transfonnować, inkubując najpierw z DNA w 4“C, a następnie stosując metodę szoku cieplnego (temp. ok. 42°C przez ok. 2 min).
Irmym sposobem transformacji jest elektroporacja Polega ona na zadziałaniu prądem o wysokim napięciu, który powoduje czasowe tworzenie się porów w błonie komórkowej co ułatwia wnikanie DNA.
W warunkach laboratoryjnych transformację można. prowadzić wprowadzonym do pożywki:
liniowym, wysokocząsteczkowyrn, dwuniciowym DNA,
• plazmidowym DNA.
Kolisty plazmidowy DNA transformuje ze znacznie wyższą wydajnością w porównaniu do fragmentów liniowego DNA.
Mutacje to nagłe, trwałe, dziedziczne zmiany informacji genetycznej. Osobniki o zmienionym genotypie nazywamy mutantami. Mutacje mogą zachodzić w kodujących i niekoduj ących częściach genomu.
Podatność na mutacje jest rózna dla róznych genów, dlatego możemy podzielić je na geny labilne i stabilne.
Gen czynnika VIII krzepliwości krwi jest przykładem genu labilnego. U 1/3 ludzi chorych na hemotilię zaobserwowano mutacje de nowo.
Gen pląsawicy Huntingtona nalezy do genów stabilnych, choroba jest efektem dziedziczenia mutacji, a nie mutacji powstających de novo.
Częstość mutacji jest niejednakowa dla róznych locí. Mutacje spontaniczne mogą powstać z większą częstością w charakterystycznych miejscach genu zwanych gorącymi miejscami (z ang. hot spot).
W genie hemofilii A gorącymi miejscami są wyspy CpG (odcinki bogate w dinukleotydy GG).
W genie dystrofiny (DMD) związanym z dystrofią mięśniową Duchenne‘a, odkryto dwa miejsca, w których mutacje występują z większą częstością.
Mutacje mutatorowe – zwiększają częstość mutacji spontanicznych różnych genów.
Mutacje antymutatorowe – obniżają częstość mutacji spontanicznych i indukowanych, ponieważ zwiększają właściwości korektorskie polimerazy (nie wbudowuje ona tautomerycznych odmian zasad.
(Page 71).
(Page 70).