Wpływ pożywki na mikroorganizm

Prawa dotyczące pożywek:

1. Teoria Finka:

• odnosi się do procesu nagromadzenia biomasy drożdży

• 1/3 węgla zawartego w podłożu jest zużywana na procesy energetyczne, a 2/3 ilości węgla na przyrost biomasy

• w biomasie drożdży stosunek zawartości C:P:N wynosi 6:1:0,2 i taki również powinien być zachowany w podłożu

Drobnoustroje rozwijają się jedynie w pewnym zakresie zawartości odpowiedniego składnika (lub ze względu na warunki hodowli). Mówią o tym prawa minimum i tolerancji.

1. Prawo minimum Liebiega – stwierdzają, że rozwój organizmu ogranicza ten czynnik, który pierwszy wystapi w ilości minimalnej (krytycznej) i jest on nazywany czynnikiem „w minimum”.

2. Prawo tolerancji Schelforda – określa wytrzymałość organizmu na nadmiar jakiegoś czynnika, powyżej którego jest niemożliwy ich rozwój.

Nieodpowiedni dobór składnika podłoża, niewłaściwa wartość pH, niedostosowany do potrzeb namnażania drobnoustroju dobór substratu powodują, że składniki zostaną wykorzystane do poziomu „w minimum”, pozostałe zaś nie zostaną wykorzystane.

Wpływ H⁺ na pożywkę:

Wytwarzanie metabolitów jest ściśle uzależnione od odpowiedniego poziomu stężenia jonów wodorowych środowisku hodowlanym. W wielu procesach kontrola i stabilizacja ma istotne znaczenie. Korygowanie kwasowości pożywki w czasie procesu dokonuje się najczęściej automatycznie przez dozowanie roztworów zasad, kwasów, glukozy lub świeżej sterylnej pożywki za pomocą pH-statu.

Do niektórych pożywek dodaje się specjalne czynniki buforujące. Należy do nich węglan wapnia, który utrzymuje obojętny odczyn podłoża. Funkcje buforujące spełniają również fosforany stosowane często jako istotne składniki pożywek.

Alkalizacja lub zakwaszenie podłoża:

W wyniku metabolizmu drobnoustrojów w podłożu na skutek preferencyjnego wykorzystania określonych kationów lub anionów może zachodzić zakwaszanie lub alkalizacja roztworu, np. obecność soli amonowych i potasowych jako źródło azotu, gdzie zużycie kationu amonowego prowadzi do zakwaszenia zakwaszenia roztworu, zaś w przypadku wykorzystania anionu azotowego obserwuje się jego alkalizację.

W przypadku stosowania azotanu amonu:

1. w pierwszej fazie następuje zakwaszenie roztworu w wyniku preferencyjnego asymilowania jonu amonowego (asymilacja azotanu jest hamowana)

2. w drugiej fazie (po wyczerpaniu jonu amonowego ) następuje wykorzystanie azotanu jako alternatywnego źródła azotu i zwiększenie pH roztworu.

Efekt hamowania asymilacji azotanów jest związany z tym, ż reduktaza azotanowa, podstawowy enzym uczestniczący w przemianie azotanów w jon amonowy, ulega represji przez ten jon.

Opracowanie podłoża hodowlanego:

O efektywności procesy fermentacyjnego decyduje opracowanie podłoża hodowlanego, gdzie jego skład wpływa na wzrost organizmów, jego biomasę, wydajność bioprodukcji .

Dobrze opracowany skład podłoża:

• może znacznie obniżyć koszty procesu,

• ułatwić separację metabolitu wytwarzanego przez mikroorganizm.

Największe efekty możemy osiągnąć poprzez połączenie opracowania pożywki i skriningu drobnoustrojów. Takie skoordynowane połączenie zmniejsza możliwość przeoczenia efektywnie pracującego układu.

Doboru pożywki dokonuje się na zasadzie:

1. eliminacji lub uzupełniania jej zestawu określonymi składnikami i ustalenia ich gradientu,

2. przy pomocy metod matematycznych.

Optymalne podłoże musi zawierać dobrane źródła:

• węgla,

• azotu,

• fosforu,

• siarki,

• potasu

• mikroelementów,

Źródło energii, które nie tylko umożliwiają optymalny wzrost, ale także korzystnie wpływają na wzrost biomasy, ograniczają syntezę związków spokrewnionych z produktem oraz ułatwiają odzyskanie gotowego produktu o dużej wydajności.

Produkując pożywki w warunkach laboratoryjnych należy pamiętać o tym, że powinny się sprawdzić w skali przemysłowej. Powinny być uwzględnione:

• koszty używanych surowców

• ewentualne reakcje precypitacji

• jakość wody

• rozpuszczalność związków stałych

• wpływ składników pożywki na oczyszczanie produktu

Nie istnieje uniwersalna pożywka, która mogłaby być stosowana równie efektywnie dla różnych drobnoustrojów. Niemożliwe jest otrzymanie udoskonalonego mikroorganizmu, gdy nie dysponuje się udoskonalonym podłożem i odwrotnie, optymalizacja podłoża wymaga użycia określonego szczepu.

W doskonaleniu i selekcji szczepów zaleca się użycie optymalnego podłoża, opracowanego dla jednego szczepu. Istnieje też możliwość stosowania niezmodyfikowanego podłoża i późniejsze ulepszanie jego składu dla wybranego najlepszego szczepu.

(Żadna z tych metod nie gwarantuje, że wśród szczepów odrzuconych podczas trwania doświadczenia nie będzie takich, które będą bardziej efektywne przy zastosowaniu innego podłoża)

Opracowanie należałoby rozpocząć os ustalenia celu jaki ma być osiągnięty podczas przygotowania nowego podłoża i zdefiniowania czynnika, który ma zostać użyty.

Strategie doboru podłoża:

1. strategia „zamknięta” – opiera się na ustaleniu optymalnych proporcji wybranych składników podłoża ; przyjmuje się, że eksperymentator dysponuje najlepszymi składnikami, dlatego nie uwzględnia pozostałych, które teoretycznie również mogłyby okazać się korzystne

2. strategia „otwarta” – nie zakłada z góry określonych składników, lecz poszukuje najbardziej korzystnej kombinacji wszystkich dostępnych związków; jest to więc metoda najbardziej kompleksowa, ale bardziej czasochłonna i trudniejsza do zaplanowania i zrealizowania

• Ustalenie optymalnego składu podłoża ma bardzo duże znaczenie dla utrzymania odpowiednio wysokich stężeń oczekiwanych produktów hodowli.

• Dobór składników nie może być całkowicie przypadkowy, opiera się na doświadczeniach i dostępnych uniwersalnych danych. Ilość powinna zostać oszacowana przy uwzględnieniu możliwości czasochłonnych, finansowych i „zdrowego rozsądku”.

Etapy opracowania podłoży:

W klasycznym opracowywaniu podłuż pod uwagę brane są:

• pojedyncze zmienne np. źródła węgla i azotu.

• Celem jest zdefiniowanie profilu składników odżywczych, który będzie naśladował elementarny skład komórek.

• Strategia ta zakłada, że mikroorganizm zawierający 50% węgla i 8% azotu będzie dobrze rósł na pożywce o stosunku C:N = 6,25.

• Zbilansowana musi być zawartość pozostałych składników, takich jak N, P, Mg czy S.

• Do doboru odpowiednich związków można zastosować technikę zaliczaną do strategii „otwartej”, polegającej na wymianie jednego składnika na inny. Metoda ta jest stosowana najczęściej do porównywania zmiennych jednego typu np. różnych źródeł węgla. Pozwala to zrozumieć wpływ składników na produktywność mikroorganizmów i umożliwia porównanie wielu komponentów podłoża.

Woda nie uwzględnia stężeń rozpatrywanych substancji i ewentualnych interakcji między nimi.

Chcąc określić koncentrację danego związku w podłożu można zastosować metodę polegającą na zmianie jego stężenia przy jednoczesnym utrzymaniu niezmienionego poziomu pozostałych składników.

Obie techniki są proste, ale bardzo pracochłonne. Alternatywą jest zastosowanie strategii „zamkniętej”. Teoria tych zabiegów zakłada, że zmiana więcej niż jednego czynnika w czasie jest bardzo efektywna. Metody eksperymentalne obejmują m. in.

• pełne czynnikowe opracowanie, pozwalające zbadać możliwa kombinację parametrów jakimi mogą być np. składniki podłoża; technika ta umożliwia oszacowanie ilości wymaganych wariantów, użyteczna jest jednak dla niewielkiej liczby zmiennych;

• niepełne czynnikowe opracowanie, stosowane gdy ilość możliwości okazuje się zbyt duża ; zastosowanie tej metody ogranicz się do czynników, których efekty są sumowane; składniki nie mające wyraźnego, korzystnego wpływu na fermentację są eliminowane, zaś te które taki efekt wywierają analizowane są ponownie.

Określenie optymalnych poziomów wszelkich parametrów podłoża, jak jego składu, temp. czy pH możliwe jest dzięki zastosowaniu technik optymalizujących, np. metody odpowiedzi powierzchniowej dla zdefiniowania od 2 do 5 zmiennych.

Strategia ta polega na konstrukcji modelu często będącego formą równania drugiego stopnia, który pozwala przewidzieć zawartość składników odżywczych jaka pozwoli na osiągnięcie maksymalnych wyników fermentacji .

Zastosowanie metody komputerowej pozwoliło na optymalizację szerszej gamy zmiennych jednocześnie Technika ta nie wymaga żadnych wcześniejszych przewidywań dotyczących np. stężenia produktów czy warunków bioprocesu.

Do takich metod należą algorytmy genetyczne, nazywane tak przez analogie do procesu mutacji i naturalnej selekcji.

Technika ANN – skuteczna sieć neuronowa, stosowana bardziej do kontroli procesów niż do optymalizacji, ANN działa podobnie do mózgu; wada - nie wnika w biologię molekularną.

KWASY ORGANICZNE

Proces utlenianie niecałkowitego – „fermentacje utleniające” (oksydatywne)- są to procesy fermentacyjne przebiegające w warunkach tlenowych, w wyniku których powstają częściowo utlenione związki organiczne wydalone na zewnątrz komórki

Do produktów końcowych takich procesów należą m. in.:

• kwas octowy,

• kwas glukonowy,

• kwas cytrynowy,

• kwas fumarowy,

• kwas bursztynowy

Z uwagi na to, że produkty otrzymane w beztlenowych procesach fermentacyjnych są podobne (np. kwas mlekowy, masłowy, pirogronowy) oraz ze względu na specyfikę stosowanych urządzeń (fermentatorów) proces utleniania niecałkowitego przyjęto określać tez jako „fermentacje utleniające” w tym ujęciu ma znaczenie raczej technologiczne i często teoretyczne w rozumieniu biochemicznym

„utlenianie całkowite” – w wyniku procesów oddechowych nie zostaje wydalony z komórki żaden związek organiczny, gdyż ograniczające związki pokarmowe zostają utlenione maksymalnie do CO₂ i H₂O

Mikroorganizmy w wyniku fermentacji utleniających uzyskują większą ilość energii niż klasyczne fermentacja i mniejszą ilość energii niż oddychanie tlenowe

Fermentacja octowa

Fermentacja octowa to proces biochemicznego utleniania etanolu do kwasu octowego

Równanie ogólne reakcji:

Utlenianie etanolu do kwasu octowego to proces 2-etapowy przebiegający w obecności tlenu:

I etap – utlenianie alkoholu etylowego do aldehydu octowego , reakcję katalizuje dehydrogenaza alkoholowa sprzężona z cytochromem 553

II etap – przekształcenie aldehydu octowego do kwasu octowego przy udziale dehydrogenazy aldehydu octowego współdziałającej z cytochromem 553 lub sprzężonej z NADP+

Enzymy są zlokalizowane na zewnętrznej powierzchni błony cytoplazmatycznej komórek.

Niektóre z bakterii octowych (peroksydanty) mają zdolność dalszego utleniania kwasu octowego:

CH₃COOH + 2 O₂ 2 CO₂ + H₂O

Cechy bakterii octowych:

• rodzaje Acetobacter (urzęsienie peritrychalne) lub Gluconobacter (urzęsienie polarne)

• pomimo urzęsienia są mało ruchliwe

• w naturze występują gł. na roślinach i w sokach zawierających cukry w towarzystwie drożdży

• kształt – pałeczki, mogą występować pojedynczo, po dwie lub w łańcuszkach

• cechuje je duża zmienność morfologiczna, tworzą formę inwolucyjną o nieznanym znaczeniu

• są ścisłymi tlenowcami, mogą być na powierzchni pożywki tworząc kożuszek zbudowany z komórek zawieszonych na włókienkach celulozy

• mają zdolność utleniania alkoholu etylowego do kwasu octowego co wykorzystuje się w przemyśle do produkcji octu; mają zdolność utleniania innych alkoholi I-rzędowych do odpowiednich kwasów tłuszczowych oraz alkoholi II-rzędowych do odpowiednich ketonów

• są mezofilami

• rozmnażanie przez podział poprzeczny, brak przetrwalników

• młode komórki barwią się gram ujemnie, starsze – zmiennie

PODZIAŁ BAKTERII OCTOWYCH

Cechy bakterii należących do Gluconobacter:

• nie dysponują kompletem enzymów cyklu Krebsa

• nie mogą utleniać kwasu octowego do CO₂ (suboksydanty)

• są bardziej rozpowszechnione w środowisku niż Acetobacter

• powodują psucie się soków, owoców, moszczów, kwiatów

• wykorzystują sacharydy

• powodują straty w plonach jabłek i gruszek rzędu 20%

• trudne do izolacji ze względu na towarzyszącą im mikroflorę zaadaptowaną do kwasowości i wysokiego stężenia etanolu

Metabolizm bakterii octowych:

• do syntezy kwasu octowego wykorzystują: etanol, proste alkohole, sacharydy (glukoza i fruktoza) i ich pochodne (mannitol)

• heksozy metabolizują w cyklu pentozowym (HMP) oraz glukoneogenezie (która służy do syntezy glukozy , nie jest odwróceniem glikolizy)

• nie posiadają fosfofruktokinazy

• nie powodują przemian szlaku EMP

Znaczenie bakterii octowych:

• do fermentacji octowej, w której wykorzystuje się bakterie fermentacji octowej jest podstawowym procesem w przemysłowej produkcji octu (ocet to 6-10% roztwór kwasu octowego

• używany do produkcji tworzyw sztucznych np.: sztucznego jedwabiu, barwników, substancji zapachowych, rozpuszczalnych leków (aspiryna)

Działanie niekorzystne:

• bakterie powodują psucie się soków oraz uszkodzonych owoców jagodowych

• szkodniki w przemyśle winiarskim i browarnictwie( wywołują zmętnienie i zmiany smakowo-zapachowe)

• są przyczyną zakażeń produktów mleczarskich, ciast, galaretek, przetworów owocowych i marynat warzywnych

Metody otrzymywania octu:

1. Metoda orleańska – tradycyjna, wolno przebiegająca (kilka tygodni) metoda wytwarzania octu z wina (rzadziej piwa), leżakującego w poziomo ułożonych beczkach. Na powierzchni płynu tworzy się błona zawierająca bakteria octowe, niekiedy wzmacnia się ją rusztowaniem z cienkich listewek lub trzciny. Wino poddawane przerobami na ocet miesza się z niewielka ilością świeżego octu w takiej proporcji, że do 2/3 wina dodaje się 1/3 octu gotowego, zawierającego żywe bakterie octowe.

W ten sposób uzyskuje się zalewę, która zawiera ok. 2% kwasu octowego i 4 % alkoholu etylowego (obecność octu reguluje pH i zapobiega infekcjom). Otrzymany ocet zawiera 5-6 % kwasu octowego. Zaleta tej metody jest produkcja octu charakteryzująca się najlepszymi walorami smakowo-zapachowymi. Jest to proces mało wydajny ze względu na czas trwania, zachodzi bardzo powoli.

1. Metoda szybkiego octowania (Schwitzenbacha) - wykorzystuje bakterie octowe osadzone na
   wiórach bukowych umieszczonych w specjalnych kadziach (twornikach) (5-10 m³), do których od góry wprowadza się 10 – 12% roztwór etanoli z dodatkiem kwasu octowego (2%).
   Napowietrzanie pożywki następuje w wyniku konwekcji naturalnej, z boku twornika zazwyczaj znajduje się otwór zapewniający lepszą cyrkulację powietrza, W celu uzyskania octu o odpowiedniej koncentracji zalewa jest zawracana wielokrotnie.

2. Metoda generatorowa - z wykorzystaniem generatora Fringsa – aparaty znacznie większe od tych stosowanych w metodzie szybkiego octowania ( do 120cm³) wyposażonych w instalację tłoczącą do środka jałowe powietrze oraz instalację chłodzącą zapewniającą optymalną temperaturę 26 -28⁰C. Zwykle dla uzyskania odpowiedniej koncentracji kwasu octowego (ok. 6%) konieczne jest przepuszczenie zalewy w generatorze Fringsa od 30 do 80 razy. Materiałem wspomagającym są również wióry bukowe.

3. Metoda wgłębna –metoda bezwiórowa, prowadzona w reaktorach zwanych acetatorami.

Są to aparaty ze stali kwasoodpornej zapewniające pełną sterylność i automatykę, umożliwiające uzyskanie najwyższej produkcyjności i wydajności procesu otrzymywania octu. Bakterie (w postaci czystych kultur) są tutaj zawieszone w roztworze, który zawiera odpowiednią ilość alkoholu etylowego, przy czym roztwór ten jest intensywnie napowietrzany.
Szybkość produkcji w tej metodzie wynosi do 40g kwasu octowego na dm³ w ciągu 24h. Jest ona dziesięć razy większa aniżeli ma to miejsce w generatorach Fringsa i sto razy większa
w porównaniu z metodą orleańską.

Szkodniki octownictwa

Bakterie z grupy peroksydantów i mezoksydantów, zwłaszcza Acetobacter xylinum. Jest to bakteria
utleniająca kwas octowy do CO2 i H2O, wytwarzająca ponadto znaczne ilości śluzu. Na skutek tego powoduje w krótkim czasie odcinanie bakterii octowych osadzonych na wiórach bukowych od dostępu powietrza co obniża efektywność procesu wytwarzania octu. Ilości śluzu, które tworzy ta bakteria, mogą być tak znaczne, że przechodzą do octu butelkowanego i są tam widoczne w postaci koloidalnych osadów.

Węgorek octowy (Anguillila aceti), przedstawiciel nicieni ( Nematodes, robaki obłe). Jego rozmiary dochodzą do 2,5 mm. Węgorki są żyworodne i rozmnażają się stosunkowo szybko. W occie o mocy 3,5 – 6%, w ciągu 8 dni(!) samica może dać potomstwo złożone w 45 osobników. W occie o mocy

9-10% żyją długo, jednak pozbawione są zdolności rozmnażania się. Węgorek nie przynosi żadnej szkody gotowemu octowi, ponieważ nie odżywia się octem lecz bakteriami octowymi. Jednak obecność węgorka w gotowym occie wpływa ujemnie na jego klarowność i nie jest akceptowana przez konsumentów, dlatego jest on usuwany na drodze filtracji, Węgorki octowe towarzyszą fermantacji prowadzonej metodami powierzchniowym i ociekowymi (występują m.in. w twornikach), zaś nie podczas prowadzenia fermantacji metodami wgłębymi.

Do pośrednich szkodników octownictwa należą niektóre owady, tj. muszki octowe – czerwono brunatne – Drosophila fenestrarum (długość ciała 2,5 – 3 mm) właściwa muszka octowa oraz ciemno – brązowa, większa o 1 mm od poprzedniej Drosophia funebris dla której właściwym środowiskiem są gnijące lub spleśniałe podłoża organiczne. Głównymi miejscami wylęgania się muszek Drosophila fenestrarum są resztki słodkich cieczy ulegających fermentacji alkoholowej, fermantujące owoce a także fermentory powierzchniowe i ociekowe. Muszki octowe nie są bezpośrednimi szkodnikami w octownictwie, ale mogą być one nosicielami bakterii nadoctujących i z tego względu ich obecność w octowniach jest wysoce niepożądana.

Produkcja kwasy octowego:

• maksymalne stężenie kwasu octowego produkowanego przy użyciu metod biologicznych
  wynosi 10 – 15%

• w celu konserwacji gotowego produktu i obniżeniem kosztów transportu zatęża się poprzez
  frakcjonowaną destylację ( do 20%) albo chemicznie usuwając wodę ( do 87%)

• metodami biologicznymi uzyskuje się wyłącznie ocet spożywczy

• ocet techniczny wytwarza się metodami chemicznymi: z aldehydu octowego z acetylenu (w Polsce) lub etanolu.

Inne zastosowania fermentacji octowej:

• Acetobacter sucoxydans prowadzi niepełne utlanienia cukrów, alkoholi, kwasów, przy jego zastosowaniu wytwarza się:
  • L – sorbozę (do produkcji witaminy C) z D – sorbitolu (występuje w owocach, szczególnie
  w jarzębinie) przykład biotransformacji
  • Dihydroksyacetony z glicerolu, wykorzystuje się także Acetobacter xylinum, Acetobacter
  orleanense i Acetobacter aceti; jest to proces odwodornienia glicerolu
  • Kwas winowy powstaje z odfermentowania glukozy prowadzone przez G. oxydans w obecności soli wanadu.

Utlenianie D-sorbitolu i do L-sorbozy

• Poprzez fermentację metodą powierzchniową albo wgłębną, uzyskuje się przy zastosowaniu
  bakterii Gluconobacter oxydans utlenianie d-sorbitolu do l-sorbozy z wydajnością sięgającą
  niekiedy 90%.

• W procesie fermentacji, w podłoży na którym hodowana jest bakteria Gluconobacter oxydans, oprócz sorbitolu (30%), znajduje się ekstrakt drożdżowy, wyciąg z kukurydzy oraz węglanu wapnia w celu utrzymania pH na odpowiednim poziomie.

• Reakcja ta ma charakter tzw. transformacji mikrobiologicznej, której efektem jest stosunkowo drobna zmiana struktury sorbitolu, polegająca na odłączeniu od niego 2 atomów wodoru przy drugim atomie węgla. Nie jest to jednak reakcja łatwa do osiągnięcia metodami chemicznymi, choć ma doniosłe znaczenie.

• Na skutek utlenienia (przez odwodorowanie) przy udziale Gluconobacter oxydans D-soritol zostaje przekształcony w L- sorbozę. L-sorboza jest substratem do produkcji syntetycznej witami C, czyli kwasu askorbinowego.

• Witaminę tę można stosunkowo łatwo uzyskać z L-sorbozy przez odpowiednią przemianę chemiczną. Mamy tu więc do czynienia z przykładem harmonijnego współdziałania mikrobiologii przemysłowej z chemią, dzięki czemu stała się możliwa opłacalna produkcja przemysłowa syntetycznej witaminy C.

Dihydroksyaceton z glicerolu

• W przypadku produkcji dihydroksyacetonu (CH2OHCHCH2OH) substratem wyjściowym jest
  glicerol.

• Jest to proces odwrotny niż w tzw. fermentacja glicerynowej (utleniania glicerolu do
  dihydroksyacetonu). Tam dihydroksyaceton był tym zastępczym akceptorem wodoru, który
  przyjmował wodór i ulegał redukcji do glicerolu w przypadku kiedy aldehyd octowy został
  zablokowany dodaniem siarczynu. Tutaj mamy odwrotną sytuację. Gluconobacter oxydanas
  utlenienia glicerol do dihydroksyacetonu.

• Oprócz Gluconobacter oxydans proces ten mogą też prowadzić niektóre inne bakterie octowe jak Acetobacter xylinum i Acetobacter aceti. Oprócz glicerolu (6%) potrzebny jest dodatek substancji stymulujących rozwój bakterii, tj. wodę drożdżową. Fermentacja jest prowadzona w temp. 28-30 st. C, pH 5,5 do 7.0. W tych warunkach uzyskuje się wysoką (95%) wydajność dihydroksyacetonu.

Otrzymywanie kwasu d-winowego

• Kwas d-winowy uzyskuje się przez odfermentowanie glukozy przy użyciu Gluconobacter oxydans.

• Najczęściej w warunkach fermentacji wgłębnej, a więc na skutek intensywnego napowietrzania r-ru glukozy, przy czym proces ten zachodzi tylko w obecności specjalnych katalizatorów, których rolę spełniają w tym przypadku sole wanadu.

• Jako produkt końcowy tej fermentacji otrzymuje się kwas d-winowy (COOH – CHOH – CHOH – COOH) w postaci soli potasowej.