BIOLOGIA MOLEKULARNA

Prowadzący dr hab. Grzegorz Bartoszewski

Egzamin: test+ kilka pytań, gdzie trzeba wpisać krótkie odpowiedzi

ZAKRES:

1. Geneza biologii molekularnej

2. Struktura DNA, jego właściwości

3. Struktura genów i genomów

4. Replikacja DNA

5. Molekularne aspekty zmienności genetycznej

6. Rekombinacja DNA

7. Struktura RNA i jego właściwości

8. Transkrypcja: polimerazy RNA, promotory i aktywatory transkrypcji, składniki kompleksu transkrypcyjnego.

4 najważniejsze przyczyny, dla których uczymy się biologii molekularnej:

1. Pełni przewodnią rolę w badaniach biologicznych

2. Pozwala zrozumieć zjawiska biologiczne na poziomie molekularnym (podstawowym)

3. Zastosowanie w genetyce, medycynie, rolnictwie, ogrodnictwie, przemyśle spożywczym- odkrycia biologii molekularnej tworzą podstawy współczesnej biotechnologii.

4. Jesteśmy dociekliwi i chcemy zrozumieć w jaki sposób działają np. leki

Biologia molekularna koncentruje się na badaniu oddziaływań kwasy nukleinowe a białka

Centralny dogmat biologii molekularnej Cricka

- schemat przekazu informacji genetycznej:

Geneza biologii molekularnej:

Jaka jest natura dziedziczności?

W jaki sposób cechy organizmów są przekazywane z pokolenia na pokolenie?

Co jest nośnikiem dziedziczności?

Thomas Hunt Morgan (1866-1945)

- pracował na muszkami owocowymi

Drosophilla melanogaster- muszka owocowa Wywilżna karłowata

- geny znajdują się na chromosomach i mogą ulegac rekombinacji

- geny są przenoszone na chromosomach

Jakim związkiem chemicznym są geny?

- substancje mogące potencjalnie być nośnikami genów:

• Polisacharydy

• Białka

• Kwas deoksyrybonukleinowy

Bakteria- Pneumococcus wywołuje zapalenie płuc

-Szczepy o różnych antygenach: I, II, III

- niepatogenne [R] i patogenne [S]

II R mysz żyje

III S mysz nie żyje

II P 65 °C mysz żyje

III S 65 °C mysz żyje

II R + III S65°C mysz nie żyje

DNA- nośnik wirulencji

DNA jest liniowym, nierozgałęzionym biopolimerem, którego monomerami są deoksyrybonukleotydy. Ich cząsteczki zbudowane są z: pięciowęglowego cukru deoksyrybozy, którego grupa hydroksylowa znajdująca się przy ostatnim atomie węgla (5') jest zestryfikowana resztą fosforanową, a pierwszy atom węgla (1') połączony jest wiązaniem N-glikozydowym z jedną z czterech zasad azotowych:

- dwóch purynowych: adeniną (Ade lub A) i guaniną (Gua lub G)

-oraz dwóch pirymidynowych: cytozyną (Cyt lub C) i tyminą (Thy lub T).

-Zasady te łącznie z deoksyrybozą tworzą deoksynukleozydy, odpowiednio dA, dG, dC i T

Materialnym nośnikiem genów jest DNA, jest ono czynnikiem transformującym II R do III S.

Fag (otoczka w środku DNA) oznakowany jest siarką S³⁵ i S³² /^izotop/ zainfekowanie faga odczepienie bakterii.

- Informacja genetyczna znajduje się na otoczce, nie odwrotnie.

I odkrycie struktury podwójnej helisy DNA (Watson I Crick )

1961- odkrycie informacyjnego DNA

1966- ‘złamanie’ kodu genetycznego (język 4-lierowy, język 20-literowy)

1970- enzymy restrykcyjne (Hamilton Smith)

1972- pierwsza rekombinacja DNA In vitro ( Paul Berg)

1973- Klonowanie DNA (Herb Berg, Stanley Cohen)

GENOMIKA:

1977- sekwencjonowanie DNA (Fredrick Sanger )

1995- poznanie sekwencji genomu (Craig Venter i Hamilton Smith)

2000- poznanie sekwencji genomu człowieka ( Craig Venter i Francis Collins)

Wykład 10.03. 2014

Materialne podłoże dziedziczności:

dsDNA- nośnik informacji genetycznej u Eucaryota i Procaryota

ssDNA- nośnik informacji u niektórych wirusów

- kwasy nukleinowe są polimerami nukleotydów

Regulacje ekspresji genów na poziomie translacji po translacyjne

- inicjacja translacji

- transport białek

- cięcie białka

- modyfikacje potranslacyjne

- degradacja białka

1. Ekspresja genów jest regulowana przez szereg procesów na wielu poziomach

Monomery- nukleotydy

Nukleozyd:

- zasady azotowe

- puryny

- pirymidyny

Pentozy

-ryboza

-deoksyryboza

Nukleozyd + reszta fosforanowa nukleotyd?

Puryny: Adenina , Guanina

Pirymidyny: Cytozyna, Tymina (tylko w DNA) , Uracyl ( tylko w RNA)

Rys. deoksyryboza

Rys2. Ryboza

NUKLEOZYD

Wiązanie N- glikozydowe!

Łączy zasady azotowe z pentozą w nukleozydach

Jest stosunkowo stabilne

NUKLEOTYDY PURYNOWE

d AMP- kwas deoksyadenylowy, monofosforan deoksyadenozyny

d GMP- deoksyguanozyno-5'fosforan

STRUKTURA DNA:

-Polimer deoksyrybonukleotydów

-Dwuniciowy- nici powiązane wiązaniami wodorowymi

-Pojedyńcze deoksyrybonukleotydy są połączone wiązaniami fosfodiestrowymi:

Łączą C 3’ deoksyrybozy z węglem 5’ kolejnej deoksyrybozy

Końce 5’ i 3’ polarność

STRUKTURA PODWÓJNEJ HELISY:

- ujemnie naładowane łańcuchy cukrowo- fosforanowe znajdujące się na zewnątrz

- jedna oś symetrii

- nici ułożone są antyrównolegle

- są komplementarne

- około 10 nukleotydów na 1 skręt pełny helisy ( ok. 2 nm)

- stabilność

- łatwość replikacji

Stabilność struktury DNA a wiązania wodorowe i komlementarność:

-Wiąz. Wodorowe- stosunkow słabe ale jest ich stosunkowo dużo

- zasocjowanie warstwowo ułożonych płaskich i hydrofobowych par zasad

- sztywne boki ‘drabiny’ chroniące zasady przed środowiskiem zewnętrzym

W strukturze podwójnej helisy występuje mały rowek (1,2nm) i duży rowek (2,2nm). Duży rowek ma znaczenie przy szukaniu np. sekwencj promotorowych w DNA

1. Akceptor wodoru

H- wodór (nie polarny)

D- dawca wodoru

M- grupy metylu CH3

Na podstawie tych informacji możliwe jest rozróżnienie poszczególnych zasad: AADH-GC, HDAA-CG, ADAM-AT, MADA-TA

Białka mogą rozpoznać poszczególne zasady nie rozplatając DNA.

Fizyczny i chemiczny układ kwasów nukleinowych:

- środowisko silnie kwaśne (bardzo niskie pH) następuje hydroliza kw. Nukleinowych do zasad, cukrów, fosforanów

- środowisko umiarkowanie kwaśnie (pH 3-4) hydroliza wiązań glikozydowych pomiędzy cukrami i zasadami purynowymi depurynacja

- środowisko zasadowe ( wysokie pH 7-8) zmiany tautomeryczne zasad, zerwanie wiązań wodorowych denaturacja (przydatne przy pracy ze strukturami in-vitro)

Spektroskopowe właściwości kwasów nukleinowych:

- sazasy aromatyczne, absorbcja świała 260 nm, wykrywanie, oznaczanie ilościowe i określanie czystości

- dsDNA jest hipochromiczny w stosunku do ssDNA (absorbuje więcej światła w niektórych temperaturach)

- pomiar ilościowy DNA i RNA- absorbancja A₂₆₀

- czystość preparató DNA i RNA – stosunek A₂₆₀/ A₂₈₀

_* czysty DNA A₂₆₀/ A₂₈₀ = 1,8

_* czysty RNA A₂₆₀/ A₂₈₀ = 2

_* białka A₂₆₀/ A₂₈₀ = powyżej 1 (ok. 0,5)

Właściwości chemiczne i fizyczne kwasów nukleinowych:

- denaturacja termiczna (topnienie) ds DNA

Ma charakter kooperatywny- zaczyna się od denaturacji końców, bardziej stabilnych obszarów bogatych w A=T, bo C ma 3 wiązania a nie dwa

- Temp. Topnienia DNA- Tm

Temp. przy której dochodzi do utraty połowy helikalnej struktury przez daną cząsteczką DNA

- Renaturacja- ochładzanie roztworu zaw. DNA

* szybkie splatanie się krótkich fragmentów

* powolne odnalezienie się w całości nici komlementarnych i odzyskanie struktury dwunicowej helisy

- Hybrydyzacja

Renaturacja komlementarnych regionów między różnymi kwasami nukleinowymi

Rys. krzywa denaturacji DNA

Zawartosć GC

- zawartość A =T, G =_C, zawartość AT nie musi być równa GC

- ogólnie zawartość GC to około 50%

- Dystrybucja GC w DNA nie jest jednolita

- Denaturacja chemiczna kw. Nukleinowego- mocznik, formamid

- lepkość- duża i łatwość zrywania nici DNA w roztworze , Sonikacja

Formy przestrzenne DNA:

DNA może występować w kilku formach jeśli chodzi o układ helisy, forma B jest preferowana w in-vitro

Forma Z-DNA, trójniciowa jest związana z chorobami genetycznymi

B-DNA, A-DNA, Z-DNA, trójnicowe DNA

Metylacja DNA:

- DNA może występować w formie zmetylowanej

- grupa metylowa- CH₃ przyłączona do zasady

- N⁶- metyloadenina (m⁶A) N⁴- metylocytozyna (m⁴C) C⁵- metylocytozyna (m⁵C)

Większość DNA w genomach ssaków i roślin podlega metyzacji

- Metylacja DNA jest sposobem zatrzymania ekspresji genów!!!

Wyspy CpG u ssaków:

3. Cytozyna, p- wiązanie fosfidiestrowe, G- Guanina

- wyspy CpG- obszary DNA bogate w CG, najczęściej promotorowe o wielkości ok. 300-3000 pz, które nie podlegają metylacji

(geny typu housekoeping mogą działać dzięki wyspom CpG)

Imprinting- piętro rodzidzielskie

- określony zwór metylacji genu zależy od tego, czy dany allel pochodzi od ojca czy od matki

- Różna metylacja genów w gametach

Piętrowanie matczyne

Allel mateczny jest nieaktywny na skutek zmetylowania i ekspresji ulega gen ojca.

Piętrowanie ojcowskie

Odpowiedzialny za rozwój łożyska

Zjawisko zabezpieczające przed partenogenezą? Próby uzyskania partenogenetycznej myszy nie powiodły się

-do prawidłowego rozwoju zarodka potrzebne są genomy matczyny i ojcowski- ok. 100 genów dochodzi do imprintingu

- u roślin endosperm w nasionach

Zaburzenia epigenetyczne metylacja de Novo

Czynniki środowiskowe prowadzące do metylacji genów:

- metale ciązkie (nikiel, kadm, arsen)

- alfa toksyny, czynniki jonizujące, dym papierosowy

- czynniki infekcyjne

Wykład 3 i 4 (24-31.03.2014)

Struktura genów i genomów

Sekwencje powtórzone

- Typ I powtórzenia rozproszone

- Typ II powtarzajacy się tandemowo DNA

Znaczenie sekwencji mikrosatelitarnych

- elementy strukturalne chromosomow

-itp.

Powtórzenia rozproszone

-RETROELEMENTY

-Przemeszcanie się dzieki odwrotnej transkrypcji (kopiuj się i wklei w inne miejsce)

Grupy retroelementow:

-retrowirusy

Wirusny RNA

Wykorzystują odwrotną transkrypcje

- wbudowują się do genomu , czasami na stałe

RETROTRANSPOZONY

Nie posiadają RTL ów

Szczególnie dużo w genomie ludzkim np. NINE i SINE

Transpozony typu I

Transpozony typu II

-skaczące geny

-Barbara McClintock (1902-1992)

-Zawierają odwócone powtorzenia na końcu i gen kodujący transpozazę-autonomiczne

Badała kolor ziarniaków kolby kukurydzy, ich różnorodność była spowodowana somatyczną transpozycją elementu Ac/Ds.

*Genomy zawierają bardzo różne ilośći transpozonów typu pierwszego i typu drugiego.

* rozmieszczenie genów na chromosomach nie jest symetryczne ani regularne, w dolnych częściach ramion genów ilosc chromosomów jest większa u eukariotów.

Temat: Replikacja DNA

1. Doświadczalne potwierdzenie semikonserwatywnego charakteru replikacj DNA

2. Etapy i enzymy biorące udział w replikacji

3. Regulcja replikacji genomu eukariotycznego

4. Telomery i telomeraza

Replikacja DNA

Proces prowadzący do podwojenia ilości DNA w komórce

Polega na syntezie 2 komletnych helis DNA z jednej wyjsciowej przy czym obydwie helisy mają sekwencję nukleotydową identyczną z helisą wyjsciową ( z wyjątkiem rzadko występujących błędów)

REPLIKON:

-niezalezni/automatycznie replikująca się cząsteczka DNA np.:

chromosomy, plazmidy, chromosom mitochondrialny, ch. Chloroplastowy

REPLIKACJA DNA

-Kopiowanie informacji genetycznej

-Decyduje o stabilnosci genetycznej organizmu jeden z bardziej złozonych procesow zachodzacych w komorkach

-Musi ona zajsc zanim komorka wytworzy komorki potomne

-Bledy w replikacj mogą prowadzic do zmian w inf. genetycznej-mutacji

-Z replikacją związane sa systemy rekombinacji i naprawy DNA

-REPLIKACJA DNA= synteza DNA

- zawsze w kierunku 5’ do 3”

‘przez dołączenie nowych nukleotydow do grupy –OH

Na koncu 3’ syntetyzowanej czasteczki

Sybstrat trójfosforany nukleotydow

Enzym- polimeraza DNA zalezna od DNA

POLIMERAZA DNA

-Potrafi dobudowywac nukleotydy do istniejącego łańcucha kwasy nukleinowego

- Nie potrafi rozpocząc syntezy zupełnie nowej cząsteczki

-Primaza /primer/ systeza nowej komplementarnej nici DNA

PROPONOWANE MODELE REPLIKACJI DNA

1. konserwatywna

2. semikonserwaywana (realna)

3. rozdzielna (dyspresyjna)

Replikacja DNA jest semikonserwatywna

Na pozywce z ‘cieżkim ‘ izotopem azoty 15 N

Hodowano bakterie, które przenoszono na pozywke z lekkim 14 N.

Izolowano i wirowano DNA w gradiencie CsCl by rozroznic rozniące się gestoscią formy DNA.

Zaobserwowano 2 podziały, 1 pokolenie bez nowej cząsteczki, drugie pokolenie z cząsteczką nowej nici.

*W kazdej rundzie replikacji kazda z dwóch nici DNA jest wykorzystywana jako matryca do syntezy komlementarnego łańcucha DNA

ETAPY PROCESU REPLIKACJ:

1. Inicjacja

2. Elongacja

3. Terminacja

Rozpoczyna się w miejscach ‘startu replikacji’ – origin of replication-ori

Rozpoznanie ORI .Rozplecenie duniciowego Dna i przygotowanie go do syntezy nowych NICI.

-chromosomy bakteryjne, plazmidy- 1 ori

- chromosom ludzki – ok. 10 tys miejsc ORI

Replisomy- replikują matryce

PODSTWOWA MASZYNERIA REPLIKACYJNA

1.Topoizomeraza- usuwa naprężenia DNA

2.Helikaza- rozdzella komplementarne nici

3.Białka SSB- stabilizują jednoniciowe DNA

4.Prymaza- syntetyzuje startert (primery)

5.Polimeraza- (-y)- synteza DNA i korekta błędów

6.Ligaza- łączy fragmenty OKAZAKI

* nić druga (opóźniona) jest replikowana po kawałku, potem jej elementy są łączone

* widełki replikacyjne sa asymetryczne

INNE MODELE REPLIKACJI U PROCARIOTA

1.Replikacja przemieszczającej się pętli D, rozpoznanie miejsca Ori, pojawia się tylko jeden timer

, jednoniciowe DNA z cząsteczki wyjściowej 2. Model toczącego się koła- rolling circle

REPLIKACJA U PROCARYOTA

Regulacja replikacji:

- na etapie inicjacji: masa/ długość komórki

- metylacja miejsca oriC

1. Inicjacja

- rozpoczęcie nowej rundy replikacyjnej

- powstanie widełek replikacyjnych

(replisomu)- miejsce ori

DnaA- ATPaza- inicjator replikacji

DnaB-helikaza

DnaC- białko opiekuńcze helikazy

DnaG-prymaza

Syntetyzuje starter RNA, który polimeraza wydłuża- 1 dla nici wiodącej, wiele dla opóźnionej

Dołączenie Polimerazy III

Białka Ssb- ochronne

Kompletowanie replisomu

*Ruch widełek replikacyjnych w przeciwnych kierunkach

POLIMERAZA III DNA

2 aktywności:

Polimerazy 5’ 3’

i egzonukleazy 3’ 5’ (aktywność korekcyjna)

POLIMERAZA III DNA (holoenzym)

Podjednostki:

a-Alpha- aktywnosc polimerazy

T- tau- decyduje o procesowosci

Gamma, delta delta prim

Chi, fi

Procesywnosc polimerazy

-Zdolnosc do replikacj DNA bez odlaczania się bez matrycy

-Duza podczas syntezy nici wiodącej

-Mała podczas syntezy nici opóźnionej

2. ELONGACJA

Uczestniczące białka:

- helikaza DnaB

-prymaza DnaG

-białka Ssb- ocgronne

-POLIMERAZA III DNA

-Polimeraza IDNA

-Ligaza polinukleotydowa

-Gyraza DNA (topoizomeraza typu II)

POLIMERAZA I DNA (kornbergowska)

1 białko z trzech domen (jedna pol i dwie egzo)

- usuwanie starterów RNA i zabudowanie luk krótkimi odcinkami DNA

- Polimeraza I DNA izolowana z bakterii termofilnych jest stosowana w reakcji PCR

3. TERMINACJA

- zakończenie rundy replikacyjnej

Region ter i białka TUS – wiązą się z sekwencją teri i zatrzymuje ruch widełek replikacyjnych – inhibitor helikazy (rozpad)

Antybiotyki hamujące synteze DNA

Mogą:

-hamować działanie enzymów replikacyjnych np. topoizomerazy II- gyrazy

- uszkadzać matrycę- nitrofurany

- blokowac syntezę nukleotydów

REPLIKACJA EUCARIOTA

1. Etay replikacji-takie same

2. Liczba miejsc i białej uczestniczących w procesie duzo większa

3. Aparat cyklu komórkowego kontroluje replikacje

4. Rozplatanie chromatyny

5. Problemy z replikacją końców chromosomów

Cykl komórkowy- 4 fazy

Replikacja u Eucariotow

1. ORC i inicjacja- faza G1

Miejsce ori połączone jest z kompleksem ORC- 6 białek (DnaA0

Cdc6 i Cdt1- umożliwiają zapakowanie do kompleksu helikazy Mcm (dnaC)

Mcm- kompleks 6 nialek o aktywności helikazy (DnaB u bakteri)

Kontrola CDK-kinazy

1.c.dinicjacja- początek fazy S

Gemininia –inhibitor

Przejscie do replikacji jest kontrolowane przez kinazyy CDK i DDk

Fragmenty Okazaki są krótsze- 180pz

Prymaza-polimraza a- jedyna polimeraza DNA, która potrafi samodzielnie rozpocząć synteze nici polinukleootydowej

*wiele miejsc replikacji, pierwsze miejsca startu replikacji znajdują się w pobliżu centromeru

REPLIKACJA EUKARIOTYCZNA

1. Kompleksy ORC powstają w wielu mijscach

2. Licencjowane ORC polega na przyłączeniu Cdc6 i Cdt1

3. Kompleks MCM/helikaza jest nastepnie załadowany na nić

4. Powstaje kompleks pre-replikacyjny (pre-RC)

5. W faze S cyklu kom. Kinazy regulowane przez cykl komorkowy inicjuja replikację

6. Po replikacji kompleks pre-RC jest blokowany by nie doszło do re-replikacj bez podzialu komorkowego

7. Replikacja zaczyna się w 2 rodzajach miejsca Ori

Wierność replikacji

Zalezy od polimerazy

Polimerzay opierające wierność syntezy DNA tylko na chemicznym parowaniu zasad

- 1 błąd na 10 do 1 – 10 do 3 włączonych nukleodytów

Polimeraza III e.coli

- 1 bląd na 10 do 6-10 do 8

Duzą wiernosc syntezy DNA wynika:

Ze srodka- wykluczona wod

-korekcyjna aktywnosc polimerazi I i III. E. coli (Q i E ssakow)

ROZPLATANIE CHROMATYNY:

DNA eukariotów jest spakowane i tworzy chromatynę

1. Białaka wiązace się z ori muszą dotrzec do DNA i w tych miejscach

2. Chromatyna musi ulec rozluznieniu na drodze przesuwajacych się widelek replikacyjnych

Problem telomerow podczas replikacji liniowej DNA:

-Polimeraza nie może odtworzyć odcinków DNA w miejscu wyciętego primera ostatniego fragmentu Okazaki.

- to powoduuje nieodreplikowanie nici opoznionej

-jednoniciowe DNA są degradowane przez maszynerię naprawczą (nukleazy)

Mogą komplementować ze sobę prowadzące do fuzji chromosomów

TELOMERY:

1.Końce chromosomów

2.Zawierają sekwencje powtórzone np. TTAGGG

3.Skracają się przy każdym podziale komórki- komórki mają ograniczoną liczbę możliwych podziałow

4.Telomeraza może odbudowac telomery

TELOMERAZA- kompleks białko i RNA- aktywna konstruktywnie u 1komórkowych eukariontów

U człowieka tylko w komórkach intensywnie proliferujących zarodkowych ale także nowotworowych.

Wykład 5 i 6

MOLEKULARNE ASPEKTY ZMIENNOŚCI GENETYCZNEJ

- mutacje np. kolor u papryki

- naprawa DNA

- rekombinacja

Zmienność rekombinacyjna wynika z crossing-over

Np. mieszańce pomidorów małych x duże czerowne

F1 średnie pomidory

F2 duże czerwone

TERMINY PODSTAWOWE:

Mutacja- zmiana w sekwencji nukleotydowej DNA

Rekombinacja- przebudowanie strutury części geneomu

Mutant- termin określający stan organizmu w odróżnieniu od formy ‘dzikiej’

Mutagen- środek/ czynnik wywołujący mutację

Mutageneza- proces tworzenia mutacji

Promieniowanie x (rentgenowskie) indukuje mutacje:

-normalnie częstość mutacji jest znikomo niska

- przez naświetlanie promieniami x H.J Muller w tydzień uzyskał tyle mutantów ile Drosophylla przez 15 lat

- otrzymał Nobla za te badania

Podział mutacji:

1. Ze względu na zakres zmienionej sekwencji

2. Ze względu na warunki w których mutacje się ujawniają

3. Ze względu na sposób powstawania mutacji

4. Ze względu na konsekwencje fenotypowe

5. Inne

ad 1.

1. Punktowe

2. Chromosomowe

ad a.)

- substytucje – najczęstsze zamiana

- delecje- usunięcie pary zasad

- insercje- włączenie pary zasad

- inwersje- obrót krótkiego fragmentu sekwencji

Model substytucji nukleotydów:

Tranzycje- są częstsze Tr/tu >1

- jest ich dwukrotnie więcej niż transwersji

SUBSTYTUCJE:

Substytucje ciche, synonimiczne:

Neutralne – nie prowadzące do zmiany w sekwencji aminokwasowej białka

AGG CGG

Arg. Arg.

Substytucja unissens (zmiana sensu)

- zmiana kodowanego aminokwasu na inny

CAC CGC

His. Arg. (oba te aminokwasy sa zasadowe, nie musi to prowadzić do zmiany funkcji białaka)

Substancje nonsensowe:

- zmiana kodowanego aminokwasu na kodon STOP amber (UAG), opal (UGA) i ochre (UAA) silny efekt fenotypowy

UGG UAG

GAG UAG synteza białka kończy się w złym miejscu

Substytucje mogą również dotyczyc obszarów niekodujących ale wpływających zasadniczo na ekspresję genów

- mutacje w obszarach promotorów

- obróbka RNA (destrukcja miejsca splacingu…)

SNP- single nucleotide polymorphin

Zmiennosć sekwencji polegająca na zmianach pojedynczych nukleotydów

Zastosowania: markery genetyczne, genotypowanie

Mutacje punktowe: Indel – delecja lub insercja

Dodanie lub usunięcie niewielkiej liczby par zasad:

-mutacja- zmiana ramki odczytu ( frame shife)

Liczba nukleotydów indel jest inna niż 3 lub nie jest wielokrotnością 3

AUA UAU AUA UAA

AUA UAU AUA UAA

AUU AUA UAU AA

Mutacje utraty, zyskania kodonu ‘’ lose organ of codon??’’

Liczba nukleotydów indel jest = 3 lub jest wielokrotnością 3

AUA UAU AUA UAA

AUA AUA UAU AUA UAA

Ad b.)

Mutacje chromosomowe- zmiany dużych odcinków DNA

- zmiany w strukturze chromosomów:

Mutacje chromosomowe, strukturalne lub abberacje chromosomowe

• Inwersje

• Duplikacje

• Delecje

• Translokacje

Zmiany liczbie chromosomów – mutacje chromosomowe liczbowe np.

Triploidy bezpestkowe arbuzy, banany

Ad2.

- Mutacje letalne- prowadzą do śmierci organizmu

- mutacje utraty lub nabycia funkcji

- morfologiczne

-biochemiczne

-ciche- kryptyczne

Ad3.

1. Bezwzględne- obligatoryjne, mają zawsze efekt fenotypowy

2. Względne- fakultatywne, takie , które ujawniają się tylko w pewnych warunkach np. podwyższonej temperatury.

Mutacje komórek płciowych- są dziedziczne, u mężczyzn to choroby genetyczne u kobiet zmiany nowotworowe

Mutacje komórek somatycznych- nie dziedziczne ale mogą mieć duży wpływ na funkcje biologiczne organizmu

Ad 4.

1. Spontaniczne- powstają bez udziału czynników zewnętrzych

Tworzenie zmienności i napędzanie ewolucji

- w trakcie replikacji w wyniku pomyłek

- na skutek uszkodzeń DNA

b) indukowane- wywołane przez czynniki zewnętrzne mutagenne

- czynniki fizyczne

- czynniki chemiczne

Ad a)

Pomyłki polimeraz

- Polimerazy mylą się rzadko- posiadają aktywność korekcyjną

- Pomyłki 1 raz na 10⁷-10⁸ nukleotydów polimeraza naprawia błędy

- 1 na 10¹⁰ nukleotydów- niepoprawia błędów

- Błędy te są najczęściej:

* substytucje

* poślizg polimeraz

* tautomeryzacja zasad

Tautomeria- wystąpienie zasad w formie izomerów strukturalnych

Izomeracja A do formy inminowej replikacja i błędne parowanie C-A

Deaminacja np. cytozyny/ adeniny (gubi resztę NH₂)

- Cytozyna staje się uracylem, paruje się z tyminą

- Pomyłki polimeraz znajdują zastosowanie w technologii markerów mikrosatelitarnych

Uszkodzenia DNA

- utrata zasady- uszkodzenia nici DNA , ‘ wybicie zęba’ , zaburzenie integralności DNA

- modyfikacje zasad, deaminacje

- chemiczne modyfikacje

- fotouszkodzenia

- połączenie linii DNA

- połączenie DNA z białkami

- pękniecia DNA

Uszkodzenia DNA

Reaktywne formy tlenu (ROS) rodnik hydroksylowy OH.

Rodnik ponadtlenowy 0^-2, nadtlenek wodoru H₂O₂

uszkadzają DNA lub nukleotydy

To one powodują najczęściej mutacje

Reaktywne formy tlenu powodują utlenianie par zasad

Ad b)

Wywołane przez mutageny:

Czynnik jest mutagenem , gdy ok. 1000 razy zwiększa częstotliwosc mutacji w porównaniu z częstotliwościami spontanicznych mutacji.

TYPY MUTAGENÓW:

1. Związki chemiczne

- analogi zasad- bromomacyl, aminopuryna

- związki powodujące modyfikacje zasad- H₂O, hydroksylamina, zw. alkilujące

- związki powodujące konwalencyjne połaczenie zasad

II- Fizyczne

- związki interkalujące

- UV

- promieniowanie o wysokiej energii

Ad I)

ANALOGI ZASAD:

Włączenie zamiast zasad w czasie replikacji błędne parowanie

S-bromauracyl (Bu) Tranzycja TA GC

Z-aminopuryna

-Czynniki deaminujące- po utracie grupy aminowej

Zasady inaczej się parują

- związki alkilujące- tworzą addukty

Metylujące i etylujące zasady w DNA:

EMS- etanosulfonian metylowy

MMS- etanosulfonian metylowy

Benzopiren- dym papierosowy

Ad II)

-Związki interkalujące z DNA- barwniki np. proflamina, bromek etydyny, akryflamina

-Ultrafiolet (UV) promieniowanie nadfioletowe

UVB 280-320nm

UVC 200-280 nm

- promieniowanie alfa,beta, gamma, neurony, promieniowanie X

Test Omega- jest wykorzystywany do sprawdzania czy związek jest mutagenem

Test wykonywany na 4 szczepach Salmonella Typhimurium wrażliwe na różne mutageny

Systemy naprawy DNA

1. Bezpośrednie usunięcie uszkodzenia

2. Naprawa z wycięciem zas. BER (base excision repair)

3. Naprawa z wycięciem nukleotydu NER ( nucleotide excision repair)

4. Naprawa błędu parowanych zasad MMR (mismatch repair)

5. Naprawa pęknięć dwuniciowych (na drodze rekombinacji)

Ad 1)

1. enzym foliaza- białko zawierające chromofory, potrzebne do działąnia światła 300nm , rozpoznaje dimery tymidynowe i fotoprod 4-6

2. białka de alkilujące

MGMT metylotransferaza metyloguaniny; zdejmuje CH₃ z guaniny i bierze na siebie

Ad 2)

BER- rozpoznanie uszkodzenia przez glikozylazy DNA i pręcik wiązania N-glikozydowego pomiędzy zasadą

Deoksyryboza- usunięcie błędnej zasady, powstawanie miejsca AP

- wykonanie nacięcia obok nici AP przez endonukleazę AP- powstaje wolny koniec 3’ -OH

- polimeraza syntetyzuje nić komplementarną

Ad 3)

U E. Coli jest to białko UvrA, UvrB, UvrC

Globalna genomowa GGR: naprawiane są rejony nie ulegające transkrypcji, umożliwia to usuwanie uszkodzeń utrudniających przesuwanie się polimerazy RNA

Ad 4)

Bakterie , ssaki

Uszkodzenia na skutek np. deaminacji, utleniania, metylacji zasad, błędy w replikacji

Mut H- u bakterii- odróżnia nić z błędnie wstawionym nukleotydem- nowa nić nie jest zmetylowana

Są też białka Mut S

Ad 5)

Bardzo złożone mechanizmy łączenia dwóch nici. Z tym zjawiskiem związane są nowotwory. Złe działanie białek Bre 1, Bre 2 rak piersi

Podsumowanie

- DNA może ulegać uszkodzeniom różnego typu

- uszkodzenia te naprawiane są na różne sposoby

- Brak naprawy uszkodzenia prowadzi do mutacji

WYKŁAD ( 7.04.2014)

Rekombinacja- proces, w którym następuje przerwanie ciągłości 1 lub 2 nici DNA i połączenie z 1 lub 2 niciowymi innymi fragmentami DNA

Technologia zrekombinowanego DNA- np. przy produkcji insuliny

Podstawowa rola:

- usuwanie pęknięć w cząsteczkach DNA

- umożliwienie zmienności genetycznej

Typy rekombinacji:

1. Homologiczna:

- wymaga homologii sekwencji pomiędzy partnerami o długości rzędu 1 gen

- może zachodzić w każdym miejscu chromosomu pod warunkiem obecności sekwencji homologicznych

- całkowicie zależna od białka RecA

2. Zlokalizowana

- zależna od miejsca, partnerzy muszą mieć homologię sekwencji, ale bardzo krótką- kilkanaście nukleotydów

- nie wymaga białka RecA, ale wymaga innych białek np. integraza faga laubda

3.) Transpozycja

- nie wymaga homologii sekwencji

- nie wymaga działąnia białka RecA, ale wymaga działania transporazy

4.)

- Wszystkie typy rekombinacji, których nie można wytłumaczyć

Dwie klasy zdarzeń rekombinacyjnych

1. Intermolekularna

Single crossover

Double crossover

1. Intramolekularna

Direct repeats może prowadzić do utraty genu

Inverted repeats może dojść do inwersji genu

Modele rekombinacji:

Holidacja- ‘wakacyjny’

Rekombinacja jest zapoczątkowana przynajmniej jednym pęknięciem w obrębie sekwencji homologicznych każdego z partnerów

Struktura Holidacja krzyż rekombinacyjny

Białko RecA, CH odpowiedzialne za specjalne nici i inicjowanie struktury holodacja kluczowa rola obu białek również RuvA, RuvB ( kontrola wymiany fragmentów) oraz RuvC, gdzie RuvCktóre rozcinaje strukturę holidacja w pionie i poziomie

Systemy rekombinacji zlokalizowanej są częścią transgenezy roślin

- cre/loxP- łatwo przenoszony do organizmów wyższych

- FLp/FRT- z drożdży

Rekombinacja niehomologiczna (grupa 4)

- nie wymaga homologacji i generuje wiecej błędó niż HR

- uczestniczą w niej białka Ku

Rekombinacja V(D)J- jest związana z receptorami układu limfatycznego

- rekombinacja pozwala na wytwarzanie licznych kombinacji i miejsc wiążących się z antygenem

- zachodzi we wczesnych etapach

TRANSPOZYCJA

Mechanizmy:

- rekombinacja zlokalizowana- site specific

- rekombinacja niehomologiczna- NHEJ

Podsumowanie:

1.Rekombinacja zlokalizowana i niezlokalizowana przebiega inaczej niż rekombinacja homologiczna

2.Proste systemy rekombinacji zlokalizowanej znalazly zastosowanie w inżynierii genetycznej

3. Rekombinacja V(D)J jest rekombinacja fizjologiczna prowadząca do powstawania białek receptorowych w komórkach limfatycznych, związanych z odpornością immunologiczną

Ekspresja genów:

Jest to odczytanie informacji biologicznej zapisanej w DNA (kolejność zasad i par zasad w odpowiednich fragmentachten zapis)

Etapy:

1.Transkrypcja

2.Translacja

DNA(transkrypcja) Pre-mRNAmRNA(translacja) Białka umieszczenie w odpowiednich miejscachfunkcjonowanie degradacja

Regulacja ekspresji genów:

1)Jakie są mechanizmy regulacji ekspresji genów?

2)Na jakich poziomach ekspresja genów jest regularna?

Ad 1)

-Istnieją białka złożona i białka różne

Ad2)

- Na bardzo różnych poziomach, najczęściej jest to regulacja transkrypcji

Znaczenie regulacji ekspresji genów:

- rozwój i zróżnicowanie

- odpowiedz na warunki środowiska

- procesy chorobowe

- produktywność organizmów użytkowych

Poziomy , na których regulowana jest ekspresja genów:

- dostęp do DNA problem jak DNA jest zmetylowany

- inicjacja transkrypcji

-terminacja transkrypcji

- splicing i editing RNA posttranskrypcyjnie

- Stabilność DNA posttranskrypcyjnie

- inicjacja translacji translacyjnie

- germinacja translacji translacyjnie

- transport białka postrranslacyjnie

- cięcie białka postrranslacyjnie

- modyfikacje posttranslacyjne białka postrranslacyjnie

- degradacja białka postrranslacyjnie

Acetylacja lizowanych reszt w ogonach histonów prowadzi do rozluźnienia struktury przestrzennej i reguluje ekspresję genów u Eucariota.

Acetylacja histonów prowadzi do rozluźnienia struktury DNA

Ekspresja genów i transkrypcja:

Transkrypcja- przepisanie informacji genetycznej z DNA na RNA;

Polimeryzacja rybonukleotydów katalizowana przez polimerazę RNA zależna od DNA, która łączy się z DNA w rejonie zwanym promotorem.

- zachodzi na matrycy jednoniciowej DNA

- nić RNA jest syntetyzowana zawsze w kierunku 5’3’

- pierwszym nukleotydem na końcu 5’ transkryptu jest puryna do inicjacji transkrypcji nie jet wymagany starter

- potrzebne są białka inicjujące

Czynniki transkrypcyjne kontrolujące ekspresję genów wiążą się z obszarem promotorowym- cis-regulatorowym

Białka wiążące się z DNA posiadają charakterystyczne domeny:

- Domena typu helisa-skręt-helisa (HTH) posiada rep resor laktozowy

- Domena homeotyczna np. białka odpowiadające za rozwój kwiatów

Uszkodzenia DNA:

Białka wiążące się z DNA mają charakterystyczne motywy:

- Palce cynkowe- u Eucariota (11?21%?) koduje białka z kodonem

- Białka wiążące się z DNA tworzą zazwyczaj dimery

- Suwak leucynowy

Etapy transkrypcji:

1.inicjacja transkrypcji

2.przyłączenie i utworzenie kompleksu transkrypcyjnego

3. wlasciwa transkrypcja

4. powstawanie RNA

Procariota

Polimeraza RNAtranskrybuje wszystkie geny

Eucariota

Polimeraza RNA transkrybuje geny

Polimeraza I, II, III- geny kodujące białko

Polimeraza RNA mitochondrialna geny mitochondrialne

Polimeraza chloroplastowa geny chloroplastowe

U Procariotów nie ma rozdzielenia procesów transkrypcji i translacji, a u eucariotów jest to białko złożone transkrypcja zachodzi w jądrze a translacja w cytoplazmie.

Polimerazy RNA wiążą się ze specyficznymi strukturami DNA- promotorem

- u eucriotów rejony promotorowe są bardziej rozbudowane i dłuższe niż u procariotów.

- Sekwencje promotorowe bakterii są stosunkowo proste

TTTACA-35 Box i TATGTT-10 Box Ramka Prova? Dwa miejsca konserwatywne

Miejsce rozpoczęcia transkrypcji – TTS

Sekwencje promotorowe eucariota są znacznie bardziej złożone

Dla polimerazy RNA II ważne jest TATA Box 1 miejsce konserwatywne

Ogólny schemat inicjacji transkrypcji:

- zamknięty schemat kompleks promotorowy

- otwieranie kompleksu promotorowego- rozplecenie DNA

-Rozpoczęcie syntezy RNA

- Ruch kompleksu transkrypcyjnego- opuszczanie promotora

- u Eucariota promotory mają budowę modułową- różnorodność elementów cis- regulatorowych

- sekwencje eukar?? mogą wpływać na ekspresję dalej położonych genów

Regulacja inicjacji transkrypcji:

- geny konstruktywne

- geny indukowane

Transkrypcja u procariota

Polimeraza RNA

- tylko jedna polimeraza

- holoenzym- zbudowany z rdzenia i czynnika

- metaloenzym- zawiera 2- atomy cynku związane z rdzeniem

Podjednostka : Funkcja:

- Łączenie wszystkich podjednostek

- czynnik syntezy RNA

- wiązanie matrycowe DNA

- rozpoczęcie transkrypcji w sekwencjach promotorowych

Regulacja ekspresji genów na poziomie inicjacji transkrypcji

Struktura promotora i czynnik sigma u E.coli

-Wariant główny

- Wariant alternatywny, rozpoznaje geny aktywowanew wysokiej temp- inne sekwencje i położenie boksów- 35, -10

Operator- motyw DNA w pozycji + 1, hamuje ekspresję genów

Np. u operatora laktozy, operator tryptofanowy

Regulon- zbiór genów kontrolowanych w podobny sposób np. jedno białko

Podsumowanie:

1.Szczególna rola i specyficzne właściwości białek z DNA

2.Typy polimeraz RNA- 1 u Procariota, 3+2 u Eucariota

3.Promotory są specyficznymi rejonami DNA w obrębie których powstaje kompleks transkrypcyjny

4. Regulacja inicjacji transkrypcji jest podstawowym problemem kontroli ekspresji genow

5.Można wyróżnić różne sposoby regulacji inicjacji transkrypcji (białka rep resorowe, aktywatorowe)

WYKŁAD 14.04.2014

Struktura RNA u Eucariotów

Złożona obróbka Pre- RNA (u niektórych organizmów nie wszystkie procesy zachodzą)

Transkrypcja zachodzi w jądrze+ procesy potrzebne do przemiany pre-RNA

Transkrypcja RNA dosyntetyzowana czapeczka i modyfikowany koniec 3’ splicing tran skryptów przecięcie tran skryptów modyfikacje (editing/modyfikowanie) powstanie mRNA

- u Prokariotów wszystko odbywa się w jednym miejscu

mRNA

Jądro transkrypcja i obróbka

Dojrzałe RNA

Cytoplazma przepisanie transkryptu na białko

Wytwarzanie czapeczki:

Czapeczka (CAP) powstaje , gdy koniec 5’ opuści kompleks transkrypcyjny. Dołączenie GTP (Gppp). Metylacja. Czapeczka posiada transkrypty syntetyzowane przez polimerazę II RNA.

Terminacja syntezy mRNA u Eucariota jest związana z poliadenylacją.

Poliadynelacja- polimeraza Poli (A), jest związana z inicjacją translacji

Dzięki temu łatwiej wyławiać z puli RNA transkrypty kodujące białka

Wycinanie intronów- splicing (przez splicosomy)

Konsensus intronów- splicing: GU…ciąg pirymidyn….AG

5’------I ^egzon--I ^intron—I ^egzon--------3’

^{GU AG}

Po wycięciu wygięty intron jest rozpoznawany i usuwany

Introny są różnie wycinane w zależności w jakiej części organizmu odbywa się ten proces.

Alternatywny splicing

- omijanie lub pozostawianie egzonu

- wycięcie lub pozostawienie intronu

- wybór egzonu początkowego

- wybór egzonu końcowego

Jeden gen może kodować więcej niż kilka rróżnych białek, u człowieka 30 tys. Genów koduje 100 tys. Białek.

Editing- redagowanie niektórych transkryptów

Deaminacja cytozyny Uracyl- może to doprowadzić do powstanie stop kodona.

Apolipoproteina u człowieka podlega editingowi

U roślin- geny mitochondrialne i chloroplastowe podlega editingowi

Degradacja RNA- następuje po translacji, jeżeli jest ono już niepotrzebne. Jest to degradacja tylko niepotrzebnych cząstek. Może ona zajsc , jeśli cząsteczka ma usunięte czapeczki znak do degradacji

Degradacja zachodzi dzięki degradosomom.

Interferencja RNA

Nagroda Nobla za odkrycie ‘Zjawiska interferencji RNA, które podlega na włączeniu genów za pomocą dwuniciowych RNA’

Dzięki temu można wylączać geny.

- stany ewolucyjne mechanicznego wyciszania genów opartych o homologię sekwencji

- odgrywa istotną rolę w obronie przed wirusami oraz regulacji rozwoju

- jest inicjowana przez dwuniciowe RNA, które inicjuje specyficzną degradację tran skryptów- regulacja negatywna

- daje możliwość specyficznego wlączania genów.

Przykład: RNA i uzyskanie odporności na nicienie

- inżynieria metabolizmu barwników

Translacja:

- końcowym efektem ekspresji genów jest zestaw funkcjonalnych białek w komórce- proteon

- ilość i rodzaj bialek w komórce odzwierdziedla równowagę pomiędzy syntezą nowych białek i degradacją już istniejących

- właściwości białek zmieniają się w wyniku modyfikacji chemicznych oraz innych rodzajów obróbki białek.

- Dzięki połączeniom procesów syntezy, degradacji i modyfikacji białka dostosowują się do zmiennych wymagań komórki i odpowiedzi na czynniki zewnętrzne.

- Translacja- ostatni etap ekspresji i informacji genetycznej

Polega ona na syntezie białka na matrycy mRNA, przebiega w rybosomach. Za interpretację kodu genetycznego odpowiada tRNA.

Kod genetyczny:

4 zasadowy (A,C,G,U) [ 4³= 64 aminokwasy]

Kod trójkowy gwarantuje unikalnośc niezbędną do kodowania 20 aminokwasów

Odkrycie kodu genetycznego- bezkomórkowe systemy translacji syntetyzowanych mRNA

Kod genetyczny:

1.Trójkowy- trzy sąsiadujące ze sobą nukleotydy tworza kodon i określają aminokwasy

2.Nie jest zachodzący na siebie

3. Nie ma znaków przystankowych (przecinków)

4. Kodon start: ATG (AUG)

5. Stop kodony: TAA, TGA, TAG

6. Jest odczytywany od ściśle określonego miejsca

7. Odczyt ma sens tylko w jednym kierunku

8. Jest uniwersalny od wirusów do człowieka

9. Jeden aminokwas może być kodowany przez kilka kodonów.

tRNA i aminoacylacja

Elementy struktury tRNA

1.Ramię akceptorowe

2. Ramie D-zawiera dihyhydroksydynę

3.Ramię antykodonowi

4.Pętla zmienna

5.Ramię zawiera pseudohrydynę

73-93 nukleotydy

7-15 nietypowych zasad

Tak naprawdę przypomina literę L w komórce- w wyniku oddziaływania ramienia D i

Aminoacylacja tRNA

‘Załadowanie’ odpowiednich aminokwasów na tRNA

Prowadzone przez syntetazę aminoacylo-tRNA- dołączenie aminokwasu do końca 3’- CCA

Potrzebna jest energia z ATP. Syntetazy rozpoznają różne elementy cząsteczki tRNA. Wysoka specyficzność w stosunku do tRNA. Aktywność korekcyjna.

Rybosomy

- jedna z bardziej złożonych struktur molekularnych

- organelle o średnicy 20nm

- występują w każdej komórce, a także w mitochondriach i chloroplastach

- zbudowane z 2 podjednostek

- kompleks białkowo-nukleinowy

-Skład: 2/3 RNA, 1/3 białka

Prokarioty rybosomy 70 s, duża pojedyncza 50 s, mała pojedyncza 30s

Eucarioty rybosomy 80 s, d.p. 60 s, m.p. 70s

Pojedyncza Komorka zawiera tysiące rybosomów.

Rybosomy są rybozymami!

Funkcje:

- jednostka dekodująca, przepisująca kod zapisany w mRNA na sekwencję białka (mniejsza podjednostka)

- aktywność transferazy peptydowej i katalizatora wiązania peptydowego (duża podjednostka)

- mikroautomat przemieszczającego się wzdłuż łańcucha mRNA i przepuszczająceo przez siebie

Struktura drugorzędowa rRNA- seria szpilek do włosów.

Ok. 70% cz. mRNA występuje w postaci sparowanych odcinków

Ok. 30% niesparowane- rozrzucone

Struktura trzeciorzędowa rRNA rybosomów 70s

Narzucenie kształtu przez sekwencję

rRNA decyduje o kształcie rybosomów

PPS- białka rybosomowe małej podjednostki

RPL- białka rybosomowe dużej podjednostki

Translacja:

Reakcja enzymatyczna – wytworzenie wiązania peptydowego

Rybosomy

Funkcja porządkująca- ustawienie cząsteczek w jedynych właściwych pozycjach zapewniających zajście reakcji

Tworzenie wiązania peptydowego:

Zaktywowane grupy karboksylowe estryfikują wolne grupy aminowe, potrzebna jest energia do aktywacji grup karboksylowych.

Synteza polipeptydu:

- mRNA jest aktywowane w kierunku od 5’ do 3’

- białka są syntetyzowane w kierunku od końca aminowego (koniec N) do karboksylowego (koniec C)

Inicjacja translacji u Procariota (etap I)

- utworzenie kompleksu rybosomu na mRNA

- czynniki inicjujące IF1 i IF3 wiązą się do pojedynczych 30 s rybosomów

- IF2 wiąze się z GTP i inicjatorowym tRNA a następnie kompleks wiąże się s kodonem start w mRNA

- przyłącza się pojedynczy 90s?, powstaje czynny rybosom

- 70s- czynniki IF są uwalniane

Rybosom zawiera 3 miejsca wiązania aminoacylo-tRNA

- Duża podjednostka katalityczna:

*miejsce A- aminoacylowe

* P- peptydylowe

* E- wyjście/ exit

- Mała podjednostka

* wiązanie mRNA

Elongacja translacji: (ETAP II)

1.Wejscie aminoacylo-tRNA do miejsca A

2.Tworzebnie wiązania peptydowego czynnik EF-Tu

3.Translokacja rybosomy, przesunięcie o 3 nukleotydy

Terminacja translacji: (ETAP III)

- koniec jest wyznaczany przez kodon STOP

- rozpoznawany przez białkowe czynniki uwalniające

- następuje dysocjacja rybosomy

Polisomy- wiele rybosomów może wiązać się do tego samego mRNA

Toksyczne białko izolowane z nasion Ricinus communis ma właściwości inaktywujące rybosomy

Antybiotyki hamujące syntezę białek:

- streptomycyna- wiąze się z pojedynczym 30s i hamuje inicjację translacji błędnie odczytane mRNA

- tetracyklina

- chloramenicol

- erytromycyna

Translacja u Eukariontów (cytoplazmatyczna)

Struktura białek u roślin:

75% białek w cytoplazmie- ponad 20 tys różnych białek

20% w chloroplastach

2-5% w mitochondriach

Mechanizmy translacji u Eukariontów:

- mechanizmy podstawowe: udział czapeczki, ogonka poli A i skanowanie w poszukiwaniu kodonu startowego

Stop kodony są rozpoznawane przez czynniki uwalniające

- czynniki RF ‘naśladują’ strukturalnie i funkcjonalnie tRNA

Tri peptyd czynnika RF rozpoznaje kodon STOP

Cykl życiowy białka:

- musi przyjąć odpowiednią strukturę 3 D

- obróbka proteolityczna

- wiele białek ulega modyfikacjom DNA

- wycięcie pewnych rejonów łańcucha peptydowego

Składanie białek:

2 klasy cha peronów:

H5p70- lokalnie oddziaływają z białkami już na etapie syntezy- chronią przed przypadkowym składaniem się w obszary hydrofobowe

- Chaperoniny

- Białak PDI

Obróbka proteolityczna białka:

- poliproteiny są rozcinane

- odcinanie końców białka

- wycinanie fragmentów ze środka białka

Preproinsulina isulina

Transport białek

- regulowanie transportu białek do różnych przedziałów komórkowych: do jądra komórkowego, mitochondriów, plastydów, RE.

- o przeznaczeniu bialka decyduje sekwencja sygnałowa białka

- po dostarczeniu sekwencji sygnałowej jest odcinana

Modyfikacje potranslacyjne białka:

- przyłączenie do białka różnych grup chemicznych

- zmienia to właściwości białka

Np. acetylacja, glikozydacja, metylacja, hydroksylacja, acylacja

Degradacja białka

Regulacja stabilności białek:

- sekwencja degradacji

- przyłączenie ubikwityny

- degradacja- proteasom- ‘’śmietnik’’