Metody oznaczania bialek

Metody oznaczania białek:

Metody ilościowego oznaczania białek:

• Metoda Kjeldahla- oznaczanie azotu białkowego

• Metoda pomiaru absorbancji w UV

• Metoda biuretowa

• Metoda mikrobiuretowa

• Metoda Lowrey`ego

• Metoda Bradforda

• Metoda z kwasem bis-cynchoninowym (BCA)

Metoda Kjeldahla- oznaczanie azotu:

Zasada:

Zawartość azotu w różnych białkach jest względnie stała i wynosi ok. 16%.

Znając odsetek azotu w badanej próbie, można obliczyć, ile zawiera

białka.

Etapy:

1. Przeprowadzenie azotu grup aminowych białek w jony amonowe przez mineralizację w stężonym kwasie siarkowym.

2. Oddestylowanie uzyskanego z grup amonowych amoniaku

3. Oznaczenie amoniaku. Istnieją różne metody oznaczania: np. metodą miareczkowania, metodą kolorymetryczną z odczynnikiem Nesslera (K2HGI4)

Metoda kolorymetryczna z odczynnikiem Nesslera

Reakcja z amoniakiem zachodzi wg równania:

Żółtozielony roztwór jodku rtęciowo-potasowego przechodzi w czerwony jodek amidooksyrtęciowy. Pomiar absorbancji 490-510 nm

Zalety: duża specyficzność da wszystkich białek

Wady: duża pracochłonność

Metoda pomiaru absorbancji w UV

Zasada:

Białka, dzięki obecności w swoim składzie aminokwasów aromatycznych (tyrozyna, tryptofan) wykazują zdolność absorpcji światła o długości fali 280 nm

Zalety:

• Proste i szybkie oznaczenie

• Oszczędność materiału

Wady:

• Mała specyficzność

• Metoda nadaje się do oznaczania stężenia oczyszczonego białka (na podstawie znanego wsp. absorpcji)

• Obecność kwasów nukleinowych w badanym materiale przeszkadza w oznaczeniu (max absorbcji 260 nm)

Metoda biuretowa

• Oznaczanie natężenia barwy powstałej w wyniku utworzenia związków kompleksowych białek z jonami miedzi (II) w środowisku zasadowym

• Intensywność barwy w reakcji biuretowej jest proporcjonalna do liczby wiązao peptydowych

Zalety:

• Wysoka specyficzność dla wszystkich białek – absorbancja nie zależy od rodzaju oznaczanego białka tylko od jego stężenia w próbie

• Prostota wykonania

Wady:

• Niska czułość ((a=0,4 (g/l)-1xcm-1))

Metoda mikrobiuretowa

Modyfikacja metody biuretowej

• Mechanizm podobny, ale zastosowana długość fali 310 nm zwiększa ok 10 x jej czułość

• Każdą próbę wykonuje się w dwóch szeregach: biały (B) i

niebieski (N)

• Szereg biały zawiera roztwór białka + 30% NaOH, szereg niebieski roztwór białka + CuSO4 w 30% NaOH

• Właściwą absorbancję do obliczeń otrzymuje się z różnicy N-B.

Zalety: wysoka specyficzność w stosunku do wszystkich białek

Wady: duże zużycie roztworu białka (dwa szeregi)

Metoda Lowry’ego

ZASADA:

W metodzie tej wykorzystuje się 2 odrębne reakcje:

Reakcję aminokwasów z odczynnikiem Folina:

Tyrozyna,tryptofan,cysteina oraz przypuszczalnie histydyna występujące w bialkach redukują jony Mo6+/W6+ zawarte w odczynniku Folina-Ciocalteau do niższych tlenków.

Reakcję biuretową:

Jony miedzi(II) tworzą kompleksowe połaczenia z wiązaniami peptydowymi,uczestniczą

również w redukcji odczynnika Folina,przez co zwiększa się czułość reakcji.

Końcowa barwa jest wynikiem tych dwóch reakcji

Metoda Lowry i wsp.

Zalety:

• bardzo wysoka czułość reakcji (ok. 70 x wyższa niż w metodzie biuretowej)

• względna prostota wykonania

Wady:

• wrażliwość na obecne w próbach substancje interferujące

– fenole, zasady purynowe i pirymidynowe, odczynniki

sulfhydrylowe oraz detergenty (zwiększają natężenie barwy)

– inne związki jak ZnSO4, siarczan amonu w stężeniach powyżej

0,1%, 1% etanol i eter obniżają intensywność barwy

• mała specyficzność wobec różnych białek

Metoda Bradforda

W metodzie wykorzystuje się zdolność wiązania barwnika błękitu brylantowego - Coomassie Brilliant Blue G-250 (CBB G250) z grupami aminowymi białek

• Wiązanie ma charakter oddziaływań elektrostatycznych

• CBB G-250 w środowisku kwaśnym ma brunatne zabarwienie, które po reakcji z białkami zmienia się na błękitne

• Wiąże się z tym zmiana maksimum absorpcji z 465 nm na 595 nm

• Natężenie barwy jest proporcjonalne do zawartości białka w roztworze

Zalety:

• prostota i szybkośd oznaczenia

• duża czułośd porównywalna z metodą Lowry

• oznaczenia można wykonywad w obecności powszechnie stosowanych buforów, EDTA, związków

tiolowych, sacharozy, glicerolu

Wady:

• mała specyficznośd wobec różnych białek

• detergenty (SDS ,Triton X-100) dają dodatkowy interferujący kolor

Metoda z kwasem bis-cynchoninowym (BCA)

• W alkalicznym środowisku niektóre składniki białek (tyrozyna, tryptofan, cysteina, cystyna) redukują jony Cu2+ do Cu1+

• Cu1+ tworzą barwny kompleksowy związek z kwasem biscynchoninowym

(BCA)

Zalety:

• wysoka czułośd reakcji (porównywalna z metodą Lowry)

• mniejsza zmiennośd dla różnych białek w porównaniu z metodą Lowry

• względna prostota wykonania

Wady:

• metoda stosuje się do prawa L-B w wąskim zakresie stężeo (do 100 ug białka w próbie)

• silna interferencję powodują

– cukry redukujące

– związki redukujące (merkaptoetanol, ditiotreitol)

– związki chelatujące jony miedzi

Wpółczynnik absorpcji:

A = k x l x c

kwspółczynnik absorpcji - ma charakterystyczną stałą wartość dla każdej substancji przy danej dł. fali

Miano i wartość liczbowa k zależą od jednostek stężenia:

• molowy współczynnik absorpcji (mol/l) (liczbowo = absorbancja 1M r-ru)

• właściwy współczynnik absorpcji (g/l) (liczbowo a = absorbancja r-ru o stężeniu 1g/l)

• Współczynnik absorpcji A1% (g/100 ml)

• Absorpcja właściwa A (1 g/ml)

Czułośd metody - najmniejsza ilośd substancji (białka), którą można oznaczyd w roztworze kolorymetrowanym

Porównanie czułości metod oznaczania białka właściwy współczynnik absorpcji jest dogodnym wskaźnikiem porównywania czułości metod. Wyraża absorbancję roztworu

kolorymetrowanego o stężeniu 1 g/l (1 mg/ml)

Im > jest wartość (a), czyli im > intensywność zabarwienia w danej metodzie

wykazuje roztwór białka o stężeniu 1 mg/ml kolorymetrowanego, tym bardziej

czuła jest metoda


Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
metody oznaczania białek
Metody oznaczania bialek, Technologia Żywnośći UR, II rok, biochemia
metody oznaczania białek
Wykład 12 Metody oznaczania białek
Metody oznaczania ogólnej liczebności drobnoustrojów
pwsz kalisz Metody oznaczania mikroorganizmów w powietrzu, inżynieria ochrony środowiska kalisz, a p
12. Metody oczyszczania białek (1), Biotechnologia w Ochronie Środowiska
Metody badania białek, Materiały - Biotechnologia
metodyka oznaczania parametrów hydrogeologicznych skał 7AEVHXD5KRVR3RLFDAXYW2FTBYJAVOCNH77UQDA
Metody oznaczania oraz identyfikacji związków przeciwutleniających
Metodyka oznaczanie zawartosci azotanow
Metody oznaczania Ag zgodności tkankowej
Metody oznaczania zawartosci wegla
metodyka oznaczania glukozy Che Nieznany
Metody oznaczania markerow nowotworowych
Metody Oznaczania Związków Nieorganicznych 1
METODYKA -oznaczanie witaminy C, Biotechnologia UKW I ST, Biotechnologia żywności UKW

więcej podobnych podstron