• Wstęp i cel badań

Testom poddano preparaty oznaczone jako: LAS-A (1), 2 a-g. Jako związku referencyjnego użyto cisplatyny oraz zbadano kontrolę rozpuszczalnika, tj. etanolu, w takim samym stężeniu jak w próbkach z badanymi związkami. Roztwory wyjściowe (stock solutions) testowanych związków o stężeniu 10mg/ml przygotowywano do każdego doświadczenia ex tempore, rozpuszczając 1 mg preparatu w 100 μl etanolu 99,8%. Rozpuszczalnikiem dla dalszych rozcieńczeń było medium hodowlane. Związki przetestowano w przedziałach stężeń od 100 do 0,1 μg/ml. Cisplatyna była badana w stężeniach od 100 do 0,1 μg/ml.

Naważki preparatów do sporządzenia roztworów wyjściowych przygotowywano na wadze analitycznej firmy Mettler Toledo XP26 o dokładności 0,001mg.

1. Linie komórkowe

Do oznaczenia cytotoksyczności badanych związków zastosowano następujące linie komórkowe:

1. MCF-7 - ludzki rak sutka,

2. A549 - ludzki rak płuca,

3. HT-29 - ludzki rak okrężnicy,

4. HLMEC - ludzki śródbłonek pochodzenia płucnego,

5. P388 - mysia białaczka,

6. BALB 3T3 - mysie fibroblasty.

Linie te znajdują się w kolekcji linii komórkowych IITD. Komórki linii MCF-7 hodowane były w medium Eagle z dodatkiem 10% FBS, L-glutaminy (2mM), aminokwasów oraz insuliny. Komórki linii A549 hodowane były w medium OptiMEM+RPMI1640 (1:1) z dodatkiem 5% FBS oraz L-glutaminy (2mM). Komórki linii HT-29 hodowane były w medium OptiMEM+RPMI1640 (1:1) z dodatkiem 5% FBS oraz glutaminy (2mM) i pirogronianu sodu (1mM). Komórki linii HLMEC hodowane były
w medium RPMI1640 z dodatkiem 10% FBS oraz L-glutaminy (2mM). Komórki linii BALB 3T3 hodowane były w medium Dulbecco z dodatkiem 10% FBS, glutaminy (4mM) oraz glukozy (4,5g/L). Komórki linii P388 hodowane były w medium RPMI1640 z dodatkiem 10% FBS, L-glutaminy (2mM) oraz pirogronianu sodu (1mM). Wszystkie media zawierały antybiotyki: 100 μg/ml streptomycyny i 100 U/ml penicyliny. Komórki hodowano w wilgotnej atmosferze, 5% CO₂ w 37^oC.

1. Oznaczanie cytotoksyczności

Oznaczenie działania cytotoksycznego badanych związków wykonywano
w 96-godzinnych hodowlach in vitro. Wobec linii komórek adherentnych zastosowano test kolorymetryczny SRB, mierzący zahamowanie proliferacji docelowych komórek na podstawie pomiaru ilości białka komórkowego. Dla komórek ludzkiej białaczki MV4-11 wykonano test redukcji soli tetrazolowej MTT, jako ocenę aktywności metabolicznej komórek. W każdym doświadczeniu próbki zawierające określone stężenia preparatu nanoszono na płytki 96-dołkowe w trzech powtórzeniach. Doświadczenia powtarzano minimum trzy razy.

2. Wyniki - ocena działania antyproliferacyjnego

Wszystkie badane związki (LAS-A (1), 2 a-g) testowano pod względem ich aktywności cytotoksycznej wobec komórek mysiej białaczki P388. Spośród nich wybrano do dalszych badań te, które wykazały największą aktywność cytotoksyczną, tu scharakteryzowaną parametrem IC₅₀ < 5 µg/ml.

Związkami tymi były: LAS-A (1), 2 a, c, f, g. IC₅₀ tych preparatów zawierało się
w zakresie 3.23- 6.35 µM. Związki o numerach 2 b, d nie wykazywały aktywności antyproliferacyjnej wobec komórek mysiej białaczki P388, IC₅₀ w tym przypadku było nieoznaczalne w badanym zakresie stężeń, a w najwyższym testowanym stężeniu wynoszącym 100 µg/ml zahamowanie proliferacji komórek sięgało około 20-40%.

W dalszym etapie badań testowano aktywność antyproliferacyjną wyselekcjonowanych związków wobec adherentnych linii komórkowych nowotworowych: A549, HT-29 i MCF-7 oraz wobec prawidłowych komórek mysich fibroblastów Balb3T3 i komórek śródbłonka HLMEC.

Najsilniejsze działanie antyproliferacyjne wobec testowanych linii nowotworowych, tj. A549, HT-29 oraz MCF-7, a także komórek śródbłonka HLMEC wykazywał związek LAS-A (IC₅₀ poniżej 4 µM). Najsłabszą aktywnością antyproliferacyjną wobec komórek linii HT-29 oraz MCF-7 odznaczał się związek 2f (IC₅₀ wynoszące odpowiednio 75.64±22.18 µM i 18.43±11.15 µM).

Otrzymane związki przebadano również wobec prawidłowych komórek mysich fibroblastów. W przeprowadzonych doświadczeniach stwierdzono, że związek o numerze LAS-A (1) wykazywał silniejsze działanie cytotoksyczne (IC₅₀ = 7.35±0.89 µM) w porównaniu do pozostałych związków. W przypadku substancji 2f stwierdzano zahamowania proliferacji sięgające około 50% w najwyższym testowanym stężeniu. Wyniki zebrano w Tabeli 1.

Kontrola rozpuszczalnika wykazała, że etanol nie wpływał znacząco na proliferację badanych komórek, tylko w przypadku komórek śródbłonka HLMEC, zahamowanie proliferacji sięgało maksymalnie 20% przy najwyższym stężeniu etanolu, tj. 1%.

Tabela 1. Stężenie IC₅₀ wyselekcjonowanych związków wyrażone w μM (średnia + odchylenie standardowe) wobec komórek linii P388, A549, HT-29, MCF-7, HLMEC oraz Balb3T3.

Badany związek	Linia komórkowa / IC50 [µM]
		P388	A549	HT-29	MCF-7	HLMEC	BALB3T3
1	4.54±1.00	1.80±0.61	1.95±0.78	3.12±1.21	1.75±0.54	7.35±0.89
2a	3.58±0.82	5.30±0.24	7.03±2.67	5.62±1.06	4.12±0.52	22.72±16.33
2b	4.79±0.55	5.62±0.45	5.33±1.77	5.50±0.92	4.63±0.42	17.05±7.03
2c	6.35±2.07	5.27±0.81	7.02±2.04	6.11±0.51	4.43±0.78	uv*
2f	4.11±0.38	36.79±68.61	75.64±22.18	18.43±11.15	4.61±0.50	76.94.±17.14
2g	3.23±0.89	6.81±0.52	5.74±1.35	2.08±0.57	4.86±0.31	14.33±5.45
Cisplatyna	0.80±0.26	8.24±0.50	27.37±1.02	13.62±1.66	1.43±0.20	8.87±2.45

uv* - dla badanego związku odnotowano zahamowania proliferacji sięgające około 50% w najwyższym testowanym stężeniu

Związki 2d i 2e są nieaktywne.

---