24.11.2009 biochemia cwiczenia

Oznaczanie stezenia bialka metoda Robertsa i Stolnikowa w moczu .

Zasada metody :

opiera się na jakosciowej probie Hellera. Pierscien zdenaturowanego bialka pojawia się na granicy warstwy moczu i HNO₃ tym szybciej im wieksza jest zawartosc bialka w moczu. Wystepowanie wyraznego pierscienia pomiedzy 3-4 minuta odpowiada stezeniu 0,033g bialka w jednym litrze roztworu. Podczas denaturacji bialka za pomoca stezeonego kwasu azotowego HNO₃ wystepuja zmiany w jego strukturze 3,4, a nawet 2 rzedowej. Lancuch bialka w tych warunkach nie ulega hydrolitycznej degradacji.

Odczynniki i material :

1. 65% roztwor HNO₃

2. mocz

wykonanie :

I zestaw probowek Nr odczynnika	1	2	3	4	5	6	7
								Woda destylowana /ml/ 2. /ml/ rozcienczenie	1 1 → 1:2	1 1 → 1:4	1 1 → 1:8	1 1 → 1:16	1 1 → 1:32	1 1 → 1:64	1 1 → 1:128
								II zestaw probowek nr odczynnika	1	2	3	4	5	6	7
								1. /ml/	1	1	1	1	1	1	1
Nawarstwic po 5 kropli rozcienczonym moczem
Wynik /+/	+++	++	+	-	-	-	-
								Mg Bialka /100ml
								g/l

Obliczenia : zaznaczyc w tabeli probowke w krotej pojawia się pierscien po 3-4 minutach .

0,033g * rozcienczenie * 100 = mg bialka/100ml moczu

mg bialka/100ml : 100 = g bialka / litr

co to jest denaturajca bialka. Zapoznac się :P

0.033 * 0,125*100 = 0,4125

w badanym moczu stezenie bialka wynosilo 0,4125 mg / 100 ml.

Denaturacja bialka jest procesem powodujacym zmiane struktury 2 i 3 rzedowej. Co prowadzi do utraty ich właściwości biofizykochemicznych. Do fizycznych czynnikow denaturujacych bialko zaliczamy : cieplo, promieniowanie alfa, beta i UV, zmiany pH, ultra dzwieki ← czynniki mechaniczne. Do chemicznych czynnikow denaturujacych bialko zaliczamy : sole ( metali ciezkich zwlaszcza) , kwasy , zwiazki organiczne ( mocznik ) , detergenty i alkohole alifatyczne. Na skutek denaturacji bialko zmienia :

1. właściwości fizyczne np. maleje rozpuszczalnosc i stala dyfuzji, zanika elektroforetycznosc, zmienia się lepkosc roztworu,

2. właściwości chemiczne np. wzrasta ilosc grup czynnych, uwalniaja się grupy SH, zmienia się zdolnosc wiazania substancji drobnoczasteczkowych, zwieksza się podatnosc bialek na dzialanie enzymow proteolitycznych

3. właściwości biologiczne : zmianie ulegaja właściwości immunologiczne bialka i spada aktywnosc enzymatyczna.

Denaturacja może być, nie odwracalna i odwracalna. Odwrocenie denaturacji prowadzi do przywrocenia pierwotnych właściwości biologicznych i okreslane jest renaturacja bialka.

---