Hodowle komórek skóry w warunkach in vitro

1

hodowle kom skóry

Wykorzystanie w badaniach in vitro zastosowanie kliniczne

2 źródła pozyskiwania kom do badań in vitro

- z banków tkanek

- biopsji skóry

- izolacja ze zwłok

- z tk usuniętych podczas operacji plastycznych

- z wycinków tk uzyskanych przy usuwaniu guzów nowotworowych

3 izolacja kom skóry

a) pobieranie fragmentu skóry

b) mechaniczne usuwanie tk podskórnej

c) enzymatyczne rozdzielenie naskórka i skóry właściwej (dyspaza, ok. 16godz)

d) izolacja enzymatyczna kom z naskórka (trypsyna ok. 10 min)

e) analiza żywotności i fenotypu kom

f) hodowla pierwotna i wtórna kom naskórka (ekspansja in vitro 2-3 tyg.)

4 hodowla kom skóry in vitro

1. Monokultury – hodowle keratynocytów

Hodowle melanocytów

Hodowla kom Langerhansa

Hodowle fibroblastów

Hodowle kom endotelialnych

1. Kokultury

5 jednowarstwowe hodowle kom skóry

Monokultury – badanie mechanizmów regulujących różnicowanie, proliferację oraz inne fizjologiczne funkcje kom

Brak możliwości oceny wzajemnych oddziaływań kom skóry.

6 hodowle keratynocytów

Pierwsza metoda hodowli in vitro uwarstwionych ludzkich keratynocytów z warstwą odżywczą

cechy hodowli keratynocytów:

- w zwartych kulturach, kształt wielokątów

-, jako pojedyncze kom na obrzeżach kolonii – forma wachlarza

- nie tracą zdolności do różnicowania i proliferacji

- w odpowiednich pożywkach zachowują się stabilnie

- jony Ca2+ do hodowli keratynocytów – tworzą się zbite kolonie

- przeżywalność i namnażanie w warunkach in vitro zwiększają czynniki wzrostowe, interleukiny, ceramidy, witaminy rozpuszczalne w tłuszczach

Wady:

- krótka przeżywalność - przez 7-8 pasaży, następnie zaczynają się starzeć i zamierać lub ulegają transformacji

zastosowanie hodowli keratynocytów

- badanie wpływu substancji biologicznie aktywnych na żywotność, proliferację i migrację keratynocytów

- badanie wpływu subst biologicznie aktywnych na produkcję…

- badanie wpływu na morfologię i fizjologię keratynocytów:

• Czynników chem

• Promieniowania UV

• temp

hodowle autologicznych keratynocytów

- leczenie oparzeń

- leczenie trudno gojących się ran

hodowla melanocytów

cechy hodowli

- melanocyty izolowane ze skóry osób dorosłych charakteryzują się większą ilością wypustek cytoplazmatycznych niż melanocyty noworodków

- duże odległości

- w hodowli nie tworzą gęstych skupisk

- kształt kom gwiaździsty

trudności w prowadzeniu hodowli melanocytów

1. Stanowią ok. 3% wszystkich kom naskórka, co utrudnia proces ich izolacji oraz selekcji

2. wolniejsze tempo proliferacji w porównaniu z keratynocytami

hodowla autologicznych melanocytów – leczenie bielactwa

melanocyty izolowane ze skóry noworodków rasy negroidalnej – wyższa aktywność proliferacyjna, więcej wypustek cytoplazmatycznych niż od rasy celtyckiej

z powodu wolnego tempa proliferacji do hodowli należy dodawać czynniki przyspieszające podziały kom barwnikowych np.:

• ekstrakt z przysadki bydlęcej

• cielęca surowica płodowa

promieniowanie UV głównie z zakresu UVB nasila melanogenezę

16 zastosowania hodowli melanocytów

- badanie mechanizmów regulujących proces pigmentacji skóry

- testowanie subst aktywnych biologicznie wpływających na syntezę melaniny

- ocena skuteczności subst stymulujących lub hamujących melanogenezę

17 hodowla fibroblastów – cechy hodowli

- duża zmienność kształtów zazwyczaj wydłużony, wrzecionowaty lub gwiaździsty z widocznym jądrem kom

- sprawiają najmniej trudności w hodowli in vitro, rozmnażają się dynamicznie prawie na każdym podłożu

18- fibroblasty izolowane ze skóry od noworodków charakteryzują się większą aktywnością proliferacji niż fibroblasty izolowane ze skóry osób dorosłych

19 zastosowanie

- badanie żywotności, proliferacji, migracji fibroblastów po zastosowaniu subst biologicznie aktywnych

- badanie wpływu subst biol aktywnych na produkcję i uwalnianie cytokin oraz czynników wzrostu przez fibroblasty

- badanie wpływu subst. biol. aktywnych na produkcję składników ECM (kolagen, elastyna) oraz MMPS przez fibroblasty

20 hodowla autologicznych fibroblastów

- wypełnienie zmarszczek

- blizny potrądzikowe – poprawa wyglądu blizn

- leczenie oparzeń

21 hodowla kom endotelialnych

- kształt lekko wydłużony

- najczęściej wykorzystywana linia kom

22 zastosowanie

- badanie nad czynnikami wpływającymi na funkcjonowanie …..

- badanie subst aktywnych biol pobudzających lub hamujących tworzenie nowych naczyń krwionośnych

23 kom Langerhansa

- bardzo trudne w izolacji i hodowli

- nie prowadzi się jednorodnych hodowli (zawiesina keratynocytów wzbogaconych kom Langerhansa)

- czas życia w hodowli in vitro ok. 1 tyg.

- ilość uzyskanych kom Langerhansa w hodowli jest niewielka

24 zastosowanie

- badanie mechanizmów reakcji alergicznych i immunologicznych

Czynniki wzrostu: EGF, KGF, IGF-I

kokultura

Kom nie mają ze sobą bezpośredniego kontaktu Kom są ze sobą w bezpośrednim kontakcie

dzięki zastosowaniu półprzepuszczalnej

membrany pozwalającej na swobodną

dyfuzję płynu hodowlanego

cel – jak najlepsze odzwierciedlenie sytuacji panującej in vivo

zalety – możliwość obserwacji i oceny wzajemnego oddziaływania kom

najczęściej wykorzystywane kokultury – punkt wyjścia do zakładania hodowli przestrzennych

keratynocyty + kom Langerhansa

keratynocyty + kom śródbłonka

keratynocyty + fibroblasty

keratynocyty + melanocyty