WYKŁAD 1
Informacje ogólne
Możliwość egzystencji roślin w środowisku zależy od możliwości przystosowania
Same analizy genetyczne sprawiają, że znamy jedynie sekwencje genów nie znając mechanizmów ich działania i aktywności w danych warunkach
Kluczowym mechanizmem dla zrozumienia zachodzących procesów jest więc ekspresja
W sygnalizacji najważniejsza jest jej praktyczna strona, którą można odnieść do ekologii ewolucyjnej i zastosowania w przemyśle
Przez pryzmat sygnalizacji można rozważać, czy istnieje możliwość stworzenia super-organizmu. Musiałaby to być roślina zdolna do odebrania wszystkich sygnałów z środowiska
Podstawy sygnalizacji
Czynnik istotny z punktu widzenia protoplastu musi być odebrany i przetworzony na właściwy sygnał realizowany przez genom
Sygnał może być słaby lub silny, ale nie odzwierciedla to mocy odpowiedzi. Bardzo słabe sygnały mogą wzbudzić bardzo mocną odpowiedź i odwrotnie.
Siła odpowiedzi warunkowana jest przez transdukcję i amplifikację sygnału
Siła odpowiedzi może być mierzona i opisywana za pomocą różnych parametrów, ale musi być adekwatna z poziomu genomu. Jeżeli sygnał jest prawidłowo odebrany, to organizm reaguje adekwatnie.
Składowe sygnalizacji komórkowej
Wytworzenie i międzykomórkowy przekaz przez cząsteczki sygnałowe
Odbiór sygnału przez receptory komórkowe
Propagacja sygnału wewnątrz komórki przez wtórne przekaźniki, kaskady enzymatyczne i inne.
Podstawowe procesy metaboliczne
Poznanie zasad sygnalizacji jest niezbędne do zrozumienia funkcjonowania rośliny jako integralnej całości w zmiennych warunkach środowiska
Lokalizacja procesów jest różna w organizmie, ale jego przetwarzanie zależy od procesów w całym organizmie.
Czynniki zewnętrzne modyfikujące metabolizm, wzrost i rozwój
Temperatura, oświetlenie, wilgotność i inne.
Warunkiem dostosowania jest odbiór i przetworzenie sygnału
Organizm reaguje na stresory – każdy zmieniający się w czasie czynnik jest stresorem, zatem ciągle zachodzą procesy dostosowawcze
sygnały mogą pochodzić z zewnątrz i wewnątrz organizmu.
Rodzaje sygnałów
Zewnętrzne – pochodzące ze środowiska
Wewnętrzne – pochodzące z organizmu
Regulacja metabolizmu
czynniki – cukry, aminokwasy, białka, sygnały elektryczne, turgor, hormony, stymulatory wzrostu, cząsteczki o złożonej budowie, temperatura, patogeny, fragmenty ściany komórkowej, minerały, uszkodzenia, światło
odpowiedź – zmiany cytoszkieletu, regulacja ekspresji genów, zmiany w szlakach metabolicznych
Odpowiedź jest zatem specyficzna lub ogólna, ale im bardziej określony cel odpowiedzi, tym jest ona bardziej skuteczna (odpowiedź specyficzna)
Informacja zewnętrzna
Informacje pochodzące ze ściany komórkowej zalicza się do sygnałów zewnętrznych
Spektrum sygnałów jest bardzo szerokie
W jednej jednostce czasu komórka otrzymuje wiele sygnałów
Sygnały odbierane są za pomocą receptorów zlokalizowanych w błonie komórkowej
Informacja wewnętrzna
Źródłem jest metabolizm komórek
Bardzo istotną rolę odgrywa tu współdziałanie organelli
Występuje oddziaływanie krzyżowe między jądrem, plastydami, a mitochondriami.
Zadania gospodarki zasobami roślinnymi
zwiększenie produktywności poprzez: wprowadzanie odmian o małych wymaganiach agrotechnicznych, odpornych na zmiany klimatu, zanieczyszczenia, warunki środowiska, oraz zmniejszenie negatywnych oddziaływań rolnictwa na środowisko nie tylko przez pryzmat agrosystemu, ale też poziomu produktywności z jednostki powierzchni.
Rośliny, a zmiany klimatu
Z powodu zmian klimatycznych rośliny będą uprawiane w coraz bardziej niekorzystnych warunkach środowiska
problemy: przesunięcie na północ upraw roślin dnia krótkiego, szybkie przystosowanie patogenów,
Najistotniejszy jest okres warunkujący powstawanie plonu z punktu widzenia przemysłu
mikroorganizmy dostosowują się szybciej niż rośliny – cykl życiowy jest znacznie krótszy, a więc selekcja korzystnych cech w danych warunkach zachodzi szybciej.
Efekt cieplarniany
wzrost stężenia CO₂ w atmosferze ma bezpośredni wpływ na wzrost roślin uprawnych i chwastów, oraz wytwarzanie zarodników przez patogeny
zmiany klimatu zmieniają rozkład temperatur i opadów, a przekłada się to na produktywność
wzrost poziomu wód w oceanach i morzach powoduje wzrost strat w areale gruntów rolnych
Przewidywany wpływ zmian na rolnictwo
Wzrost temperatury do 2030 roku (1-2,5°C)
Wzrost stężenia CO₂ (zmiany opadów, temperatury, usłonecznienia)
Wpływ zmian klimatu na rolnictwo
Zmiany w doborze uprawianych gatunków
Zmiany w plonowaniu roślin
Wpływ ekstremalnych warunków pogodowych
Chwasty, szkodniki i choroby roślin
Erozja gleb
Warunki naturalne
Rośliny narażone są na stres wieloczynnikowy
Stresory mają działanie pozytywne, negatywne lub obojętne, ale sporo korelacji nie zostało jeszcze zbadanych
Stresory są składowymi sumarycznego stresu i mogą oddziaływać ze sobą dając inny wymiar stresu
Tolerancja krzyżowa
rośliny pomidora zranione odpowiednio wcześniej wykazują większą tolerancję na zasolenie
Interferencja ścieżek sygnalizacyjnych
Arabidopsis zarażany był Rhizobacterium
Rośliny zakażone dobrze radziły sobie ze stresem suszy w przeciwieństwie do tych niezakażonych
Podobne wyniki zauważono w przypadku roślin ozonowanych i zarażonych Pseudomonas – nastąpił wzrost odpowiedzi.
Organizm modelowy
Posiada szereg cech, które czynią go bardziej użytecznym w badaniach, niż inne gatunki z grupy taksonomicznej, którą reprezentuje.
Cechy rośliny modelowej
mały genom jądrowy, mało powtarzalnego DNA, niewielka liczba chromosomów
pochodzenie ze strefy klimatu umiarkowanego
niewielki rozmiar
krótki cykl życiowy
samopylność
nieskomplikowane wymagania odżywcze
Arabidopsis thaliana
Jednoroczny chwast z rodziny krzyżowych (kapustowatych)
15-20cm wysokości, nasiona ok. 0,5mm długości
5000 nasion na roślinę
Diploid (2n), mały genom (125 Mbp)
Cykl życiowy krótki, 6 tygodni od nasiona do nasiona
Samopylny
podatny na mutageny i transformację
W laboratorium
Pracuje się na ekotypach
Ekotyp nie jest jednostka taksonomiczną, ale ma szeroki zasięg wykorzystywania, wydziela się go na podstawie zmienności, która zmienia się w zależności od warunków środowiska
Cechy Arabidopsis przydatne dla badacza
137,5° - fitotaksja skrętoległa (rozetowe ułożenie liści)
Hodowany w szklarniach i fitotronach, ale rośnie też na szalkach Petriego
Można prowadzić kultury „in vitro” – hodowla różni się w zależności od organizmu matczynego od którego został pobrany materiał do badań
w analizie bada się mutacje w postaci knockout’ów, oraz wpływ czynników transkrypcyjnych
Sekwencjonowanie Arabidopsis
2000r. – zakończenie projektu Arabidopsis Genome Initiative
Stworzono bazę genów dla tego gatunku
Proteom
Spora część białek (40%) ma nieznaną funkcję
Pozostałe białka zostały zaklasyfikowane do 12 grup w zależności od funkcji
Duży procent stanowią produkty odpowiedzialne za sygnalizację.
Analiza odpowiedzi na stres
Sprawdzana jest ekspresja genów w różnych warunkach, zarówno w ekotypach i mutantach
Każdy mutant ma unikalny profil transkrypcyjny, który może się różnić w zależności od warunków hodowli
Lista genów, która ulega ekspresji w środowisku jest znacznie mniejsza niż w przypadku laboratorium, czasami okazuje się, że badania laboratoryjne mają się nijak do badań polowych (np.: 2057 ulega ekspresji w laboratorium, a 62 w środowisku, przy czym pula wspólna to 43 geny)
Inne organizmy modelowe
Thellungella halophila – przy badaniach stresu NaCl
Przekazywanie sygnału
Cechą charakterystyczną organizmów żywych jest zdolność do zachowania homeostazy w zmieniającym się środowisku
Nawet najprostsza komórka zawiera mnóstwo systemów, których współdziałanie jest niezbędne do zachowania homeostazy
Tak więc systemy przekazywania sygnału są mechanizmami homeostazy
Rodzaje sygnałów w komórce
Anterogradowe
Krzyżowe
Retrogradowe
Koordynacja mechanizmów
poszczególnych komórek w tkankach
poszczególnych tkanek w organach
poszczególnych organów w organizmie
WYKŁAD 2
CZYNNIKI TRANSKRYPCJI – jakiekolwiek białko potrzebne do rozpoczęcia lub regulacji transkrypcji u eukariontów. Musi być aktywny (np.: ufosforylowany), aby działał prawidłowo. Oddziałuje z regionem promotorowym genu. Druga właściwość to zdolność do regulacji siły ekspresji genu.
Receptory
inaczej sensory, to specjalistyczne białka odpowiedzialne za rozpoznanie i selektywne wiązanie (pochłanianie) cząstek mających właściwości sygnałowe
inicjują reakcje wewnątrzkomórkowe, przekazanie sygnału do efektorów, a więc elementów wykonawczych
cząsteczki sygnałowe mogą łączyć się z receptorami zewnątrzkomórkowymi lub wewnątrzkomórkowymi
LIGAND – cząsteczka wiążąca się do specyficznego miejsca białka, zwłaszcza receptora. Nie jest cząsteczką sygnalizacyjną. Białko do którego się łączy nie musi być jednak receptorem, a więc nie musi warunkować kaskady sygnalizacyjnej
Wiązanie do receptorów
zewnętrzna część komórki łączy się z cząsteczkami hydrofilowymi w rozumieniu dużych cząsteczek, które nie przedostają się do plazmolemmy
cząsteczki, dla których plazmolemma nie jest barierą, mogą być odbierane za pomocą receptorów wewnątrzkomórkowych
Receptory
występują w plazmolemmie i błonach retikulum endoplazmatycznego
dla cząsteczek rozpuszczalnych w wodzie występują receptory jądrowe i cytoplazmatyczne
receptory rozpuszczalne u roślin – kryptochrom B (światło niebieskie), fitochrom (czerwień i daleka czerwień), oraz białka R (białka odporności na patogen)
Wiązanie ligandu z receptorem
specyficzne
wysoko spowinowacone
odwracalne
Już stężenia rzędu 10¯⁵ M mogą dać spektakularny efekt
TRANSDUKCJA SYGNAŁU – zamiana bodźca zewnętrznego, którym mogą być różne czynniki (zranienie, działanie szkodników, inne czynniki stresowe) na odpowiedź fizjologiczną komórki i organizmu
Zasady sygnalizacji
skomplikowana sieć zależności, którą ciężko oddać w sposób syntetyczny
szlaki przekazywania sygnału oddziałują na siebie tworząc złożoną sieć zależności
interakcje między elementami poszczególnych szlaków sygnalizacyjnych mogą zachodzić na wielu płaszczyznach i są antagonistyczne lub synergistyczne
dlatego też tzw. cross-talk ma znaczenie w warunkach środowiska naturalnego, gdzie działa szerokie spektrum czynników stresowych różnego pochodzenia
Realizacja odpowiedzi na poziomie
subkomórkowym (mitochondria, chloroplasty, jądro)
międzykomórkowym (tkanki i organy)
międzyorganowym (na trasie korzeń – pęd)
Interferencja sygnałów
Stres abiotyczny i biotyczny wywołują różne reakcje, jednak występują tak zwane ściezki konwergencji, w których występują tzw. węzły podobnych odpowiedzi na różne stresory
Wiąże się to z generowaniem RFT i zachodzeniem reakcji redoks, reakcji z udziałem ABA, SA, JA, ET, oraz udział kinaz MAP (mitogene activating phosphokinase)
Powoduje to oddziaływanie na pulę czynników transkrypcyjnych
Czynniki transkrypcyjne powodują zmianę profilu ekspresji, co warunkuje odpowiedź na stres
Czynniki transkrypcji
MYC, MYB, NAC, ZF, HSF
Odpowiedź
specyficzna – rdzeń odpowiedzi (RFT, redoks, hormony, kinazy)
wyzwalane specyficzne przez daną grupę stresorów, które interferują z innymi ścieżkami
o efekcie decyduje udział także innych czynników
Los komórki w zależności od konfiguracji sygnałów
przeżyj - A, B, C
podziel się - A, D, E
różnicuj się - B, C, E
umrzyj - E, D, A
Stres wieloczynnikowy – sposoby analizy
Wywołuje odpowiedź odmienną od indukowanej przez poszczególne stresory
Może być rozważana na poziomie fizjologicznym i różne procesy są upośledzone w zależności od natężenia i zróżnicowania, może oddziaływać na oddychanie, fotosyntezę, RWC
Może być rozważana przez pryzmat genetyki, gdzie istotna jest zmiana profilu ekspresji, zarówno pod postacią indukcji jak i inhibicji
Odpowiedź jest złożona z części rdzennej (ogólnej) i specyficznej (otoczki), która uzależniona jest od wielu czynników
Może być rozważana z poziomu proteomu, metabolomu, transkryptomu. Najbardziej zmienia się transkryptom, mniej pula białek, a najmniej rodzaj metabolitów wtórnych. Dane te są jednak bezwartościowe jeśli nie znamy funkcji białek i metabolitów, gdyż nie wiemy jaki mają udział w procesie dostosowania/adjustacji
METABOLOM – zbiór substancji drobnocząsteczkowych, które są elementami szlaków metabolicznych, o różnych właściwościach fizykochemicznych i różnych funkcjach w badanym systemie (komórka, tkanka, organizm). Do dzisiaj poznano ok. 200 tys. metabolitów. Poziom metabolomu, proteomu i transkryptomu i ich poznanie jest niezbędne do zrozumienia całości.
Analiza wpływu na fenotyp:
Geny Czynniki transkrypcji Białka Metabolity Fenotyp
Oddziaływanie czynników
Interakcje szlaków sygnałowych
A i B nie wpływają na siebie
A hamuje odpowiedź B lub B hamuje odpowiedź A
A indukuje odpowiedź B, lub B indukuje odpowiedź A
A i B odpowiadają za wyzwolenie tej samej reakcji (3A+3B = 1A+5B = 4A+2B = 6)
Regulacja szlaku przez ligand
Ligand może być antagonistą (-) lub agonistą (+) szlaku
Po połączeniu tworzy układ
Efektem może być przeniesienie sygnału (+) lub brak jego przekazywania (-)
W zależności od tego odpowiedź występuje, lub nie.
Interakcje – genotyp x środowisko
Przykładem jest regulacja fotoperiodu, czyli rozpoznawania dnia i nocy
Odpowiedź roślin tego samego gatunku, ale fotoperiodycznie wrażliwych i niewrażliwych jest różna w zależności od dwóch czynników – temperatury i dobowych jej wahań
Odpowiedzi są różne, należy pamiętać o tym, że odbiór sygnału zależy od genotypu, a więc ilości i wrażliwości receptorów i cząsteczek warunkujących odpowiedź
Interakcja szlaków sygnalizacji uruchamianych stresem biotycznym i abiotycznym
Stres odbierany jest przez receptor
Może to powodować kaskadę MARK/CDPK lub zmianę stężenia jonów wapnia czy RFT i innych
RFT i jony wapnia mogą wpływać na kaskadę MARK/CDPK
Stężenie wapnia może powodować zmiany w ekspresji genów lub regulować poziom JA, ET, SA, ABA
Ww. rzeczy wpływają na odpowiedź
RFT w stresie abiotycznym i biotycznym
Konwergencja szlaku sygnalizacji
Stresor | Chłód | Susza |
---|---|---|
Czynnik transkrypcyjny | DREB 1 | DREB 2 |
Gen | DRE | |
Efekt | Ekspresja genów warunkujących akumulację Pro |
RFT i fitohormony jako mediatory stresu
Niski poziom ROS powoduje działanie fitohormonów, dzieje się tak za pomocą przekaźników
ABA - zamknięcie szparek
Auksyny - grawitropia korzeni
Kwas gibelerinowy - germinacja nasion
JA - synteza ligniny
SA
Gibereliny
Etapy transdukcji sygnału
percepcja sygnału
przetworzenie sygnału (wzmocnienie, wtórne przekaźniki informacji)
przekazanie sygnału
regulacja specyficznych genów
modyfikacja procesów metabolicznych i fizjologicznych
odpowiedź rośliny (zmiana funkcjonowania)
Kaskady sygnalizacyjne
przeniesienie do miejsca odpowiedzi
amplifikacja
rozdział do różnych efektorów
modulacja sygnału – „fine tune” – strojenie
wejście przetwornik wyjście
Klasy wzmacniaczy sygnałów
enzymatyczny – aktywacja enzymu, który produkuje wtórne przekaźniki
kanałowe – otwarcie kanałów Na⁺ i K⁺ z apoplastu i aparatu Golgiego do cytoplazmy
Wtórne przekaźniki informacji wzmacniające sygnał
cAMP
cGMP
cADPR
NO•
Ca²⁺
1,4,5 – trifosfoinozytol
1,2 – diacyloglicerol
Ogólne zasady sygnalizacji
I Rząd | Hormony |
---|---|
II Rząd | cAMP |
III Rząd | Kinazy |
IV Rząd | Białka ufosforylowane fosfatazy Białka nieufosforylowane |
Efekt | ODPOWIEDŹ BIOLOGICZNA |
WYKŁAD 4
Ogólne zasady sygnalizacji
u jednokomórkowców – rozpoznawanie bodźców zewnętrznych i wewnętrznych oraz powstanie odpowiedzi odbywa się w jednej komórce
u wielokomórkowców – bodźce odbierane są przez wszystkie komórki, lub te, które są do tego wyspecjalizowane
u wielokomórkowców odpowiedź na bodziec jest lokalna lub obejmuje cały układ (organizm), czyli może być to odpowiedź systemiczna
Regulatory ekspresji genów u eukariontów
bodźce zewnętrzne
czynniki wewnętrzne
Poziomy regulacji ekspresji genów
genom
transkrypcja
processing RNA i jego dystrybucja
translacja
obróbka posttranslacyjna
Inne czynniki regulujące ekspresje
rearanżacja genów
metylacja
zmiana aktywności polimeraz
tworzenie czapeczki i poliadenylacja
wycinanie intronów
transport cząsteczek RNA
czynność rybosomów
fałdowanie białek
cięcie enzymatyczne
reakcje katalizowane
glutationacja
Regulacja fizjologii
na różnych etapach ontogenezy rośliny wykazują inną percepcję tego samego bodźca w zależności od
fazy rozwojowej – zależna od wieku
aktywności metaboliczne – zależna od wieku
warunków środowiska – zależne od warunków zewnętrznych
Wygaszanie sygnału
proces ten jest równie ważny co wzbudzanie i warunkuje homeostazę
wyróżniamy 3 poziomy regulacji
na poziomie receptora
na poziomie wzmacniacza
na poziomie wtórnej cząsteczki sygnałowej
jeśli sygnał nie jest odpowiednio wygaszany, prowadzi to do zaburzeń metabolicznych
na poziomie receptora sygnał jest wygaszany poprzez oddysocjowanie liganda, przy małej ilości przekaźnika sygnał również ulega wygaszeniu, jednak nie w pełni
całkowite wygaszenie ma miejsce wtedy, gdy rozkładane lub usuwane są cząsteczki wtórnego przekaźnika (usuwanie jonów wapnia do retikulum endoplazmatycznego lub apoplastu; enzymatyczne trawienie cAMP)
Wygaszanie sygnału
NO (tlenek azotu) warunkuję sygnalizację cyklazy guanylanowej
Powoduje to reakcję chemicznej w której GTP zostaje przekształcony do GMP
w efekcie powoduje to reakcję fizjologiczną rośliny
fosfodiesteraza warunkuje reakcję odtworzenia GTP z GMP (tak samo działa Viagra)
Fotoreceptory roślin
percepcja bodźca świetlnego i jego przekazanie jest kluczowe dla roślin
odbiór sygnału zachodzi wewnątrz komórki
jest wiele receptorów dla różnego spektrum światła
część z tych receptorów związana jest z fotosyntezą (światło bodźcem do rozpoczęcia procesu, ale nie warunkuje kaskady sygnalizacyjnej), ale też uruchamiają kaskady sygnalizacji
Kontrola procesów wzrostu i rozwoju
występują różne poziomy kontroli
genetyczny
hormonalny
środowiskowy
wszystkie z nich regulują poziom ekspresji genów
światło jest czynnikiem, który może z nimi interferować
Procesy wzrostu i rozwoju, a światło
deetiolacja – ulistnienie w czasie – zależne od światła, oraz występowania roślin sąsiadujących (czyli de facto poziomu zacienienia badanej rośliny)
roślina jest wrażliwa na fotoperiodyzm i to warunkuje zakwitanie
wszystko w roślinie jest kontrolowane przez światło i to niekoniecznie światło dzienne
Fotoreceptory
fototropina – kilka rodzajów, 300-400nm
kryptochrom – kilka rodzajów, 300-400nm
fitochrom – światło czerwone (600nm), oraz daleka czerwień (730nm), współpracuje z receptorami światła niebieskiego
Światło słoneczne
spektrum światła słonecznego jest różne w zależności od pory dnia, zachmurzenia i warunków pogodowych
im bardziej bezchmurne niebo, tym nie tylko więcej samych promieni słonecznych, ale także więcej promieni w zakresie czerwieni i dalekiej czerwieni
ilość promieniowania czerwonego zależy od tego przez co przechodzi – np. przez liść (jest bardzo specyficznym sygnałem)
światło czerwone warunkuje rozwój poszycia lasu, rozwój upraw buraka cukrowego, gdzie część liści jest w absolutnej ciemności
Szlaki transdukcji światła
widoczne są zmiany morfologiczne i cytobiochemiczne
deetiolacja zachodzi w warunkach braku światła, klasycznym przykładem jest ziemniak
wystarczy tydzień ekspozycji, aby zmienić fizjologię rośliny
światło warunkuje ekspresję genów chlorofilu i jego składowych
deetiolacja jest przykładem transdukcji sygnału
Reakcja na zacienienie
w przypadku zacienienia dochodzi do wydłużenia międzywęźli, rośliny przez to dążą do pokonania konkurencji innych roślin
jest to jedna z najbardziej typowych reakcji – wzrost wydłużeniowy
„audyt energetyczny” – za pomocą kamery termowizyjnej można określić stan każdego liścia oddzielne, nie ma dwóch identycznych liści w roślinie, wiec każdy odbiera zupełnie różną informację o świetle i uruchamia inną reakcję dostosowawczą
najwięcej dzieje się w zakresie czerwieni i dalekiej czerwieni
R/FR = 1,19 – 0,10
1,19 – intensywne światło dzienne
0,10 – silne zacienienie
ważny jest stosunek R/FR, a nie same wartości bezwzględne R i FR
Fotomorfogeneza
wszystkie cechy, jakie mają rośliny, są różne w zależności od światła
okres morfogenezy indukowany światłem zachodzi w zakresie światła o długości fali większej niż światło widzialne (320-800)
rośliny przetrzymywane w ciemności pną się ku górze – badania wykonywane były na ziemniaku, ale zastosowanie znalazły w leśnictwie – zwarcie upraw drzew
rośliny etiolowane i normalne posiadają tyle samo pięter ulistnienia, ale występują różnice w ich wielkości, u rośli etiolowanych szczyt pędu jest haczykowato zagięty, ponadto obserwuje się brak chlorofilu, długie pędy, ograniczony przyrost na grubość, ograniczony wzrost korzeniowy, zahamowanie tworzenia korzeni bocznych
dobrym obiektem do badań jest ziemniak, fasola, groch, kukurydza oraz owies, ale u jednoliściennych jest nieco inaczej – wydłużeniu ulega pochewka liściowa – hypokotyl i mezokotyl
Różnice w rozwoju, a czas ontogenetyczny
nasiona w przypadku braku oświetlenia nie kiełkują (u roślin wrażliwych na światło)
po wykiełkowaniu brak światła sprawia, że siewki są dłuższe i mają krótsze liście
dorosła roślina przy braku światła wytwarza dłuższe ogonki liściowe
w czasie kwitnienia brak światła powoduje szybsze wydawanie nasion i szybsze kwitnienie
Receptory fotomorfogenezy
najważniejszy jest fitochrom – receptor światła fotomorfogenetycznie czynnego
od niego zależy typ rośliny, a więc jej morfologia
Fotokonwersja fitochromu
P(r) (synteza w ciemności) |
światło białe lub czerwone | P(fr) (powolny rozpad) |
---|---|---|
Daleka czerwień | ||
powolna przemiana w ciemności |
φ – P(fr)/P(fr) + P(r) – stan fotostacjonarny fitochromu
Stan fotostacjonarny fitochromu
formą aktywną biologicznie jest P(fr)
to ona warunkuje procesy morfogenezy
ciemność i daleka ciemność warunkuje unieczynnienie
białko P(fr) jest labilne i ulega rozkładowi w czasie
powolny rozpad i przemiana w ciemności to nie ten sam proces!
od φ zależy, czy mamy wzbudzenie kaskady reakcji
Różnice związane z fitochromem
u roślin etiolowanych jest 100x więcej fitochromu niż u roślin normalnie oświetlonych
udział fitochromu w tych procesach badano przy pomocy analizy widma i absorbancji charakterystycznego dla danego procesu (tak samo jak badano fotosyntezę). Tak wyznaczono optimum i ekstrema inhibicji danego procesu
Reakcje regulowane przez fitochrom
kiełkowanie nasion
formowanie haczyka hipokotylu
wydłużenie międzywęźli
inicjacja stożka wzrostu, korzenia i liścia
ruchy liści
potencjał elektryczny błon
przepuszczalność błon
regulacja fototropizmu i geotropizmu
synteza antocyjanów
indukcja kwitnienia
Widma absorpcji fitochromu (optima)
730nm
660nm
Fitochrom – budowa cząsteczki
jest chromoproteiną złożoną z dwóch podjednostek – homodimer
w każdej podjednostce zlokalizowany jest chromofor
każda podjednostka waży 120kDa
każda podjednostka składa się z dwóch domen
wrażliwej na światło(fotoreceptor – chromofor)
transdukującej sygnał (aktywność kinazy)
chromofor jest podobny do chlorofilu – otwarty tetrapirol (nie może łączyć się z jonem Mg²⁺)
NH₂ - fitochrom A/B z chromoforem – region regulacji – miejsce dimeryzacji – miejsce ubikwitynacji – COOH
Mechanizm działania
bodziec świetlny powoduje zmiany konformacyjne w strukturze fitochromu, co warunkuje wysyłanie sygnału
P(r) P(fr) ma się tak jak izomer cis izomer trans
Stężenie fitochromu w etiolowanej siewce
jest 100x większe niż w normalnej, ale nierównomiernie rozłożone
najwięcej jest go w części wierzchołkowej i podwierzchołkowej gdzie zachodzi najintensywniejszy wzrost wydłużeniowy
Reakcje z udziałem fitochromu
wykazuje dużą rozpiętość energetyczną, dlatego wyróżniamy grupy:
VLFR -bardzo nisko energetyczne – błysk błyskawicy, światło księżyca
LFR – nisko energetyczne – czerwień, daleka czerwień
HIR – wysoko energetyczne
fitochrom nie jest jedynym regulatorem, dlatego intensywność oświetlenia ma znaczenia
LFR jest reakcją odwracalną i przeciwstawną - zamiana formy czerwieni na dalekiej czerwieni
HIR pozornie nie spełnia kryteriów sygnalizacji, bo potrzeba dużego sygnału wejścia
Rozpiętość energetyczna
VLFR – pulsy czerwieni lub dalekiej czerwieni o natężeniu 0,001 do 1 μM światła/m²s
LFR – 1 – 1000 μM światła/m²s
HIR – powyżej 1000 μM światła/m²s
Przykład HIR
przykładem jest hamowanie wydłużania hipokotyli etiolowanej siewki grochu
jeśli hipokotyl przestaje się wydłużać, to wszystko wraca do normy
receptor UV-A, światła widzialnego i fitochrom biorą udział w tym procesie
Ścieżka sygnalizacyjna fitochromu
fitochrom ma aktywność kinazy serynowo/treoninowej
kwanty światła padające na chromofor zamienia izomer cis na trans i prowadzi do fosforylacji seryny i treoniny w swojej cząsteczce, a więc autofosforylacji i samo unieczynnienie, a więc uruchomienie fosforylacji białek sygnałowych
fosforylacja białek może prowadzić do inhibicji lub stymulacji procesu w zależności od rodzaju białka
receptor jest więc jednocześnie katalizatorem reakcji
najpierw zachodzi więc autofosforylacja, później fosforylacja
proces wymaga nakładu energetycznego w postaci ATP
WYKŁAD 5
Izomeryzacja chromoforu
zachodzi pod wpływem bodźca świetlnego
od tego zależy aktywność fizjologiczna i przekazanie sygnału
Fotoreceptory
zmiana oświetlenia
odbiór przez fotoreceptor
indukcja odpowiedzi
dekodowanie sygnału zapoczątkowuje izomeryzację chromoforu
660 lub 730 – sygnał dekodowania informacji
po fotoizomeryzacji zachodzi indukcja innych sygnałów, zmiana puli wapnia, aktywności kinaz, ekspresji genów
odpowiedź rośliny jest różna, najczęściej dąży do pokonania zacienienia powstałego z różnych względów
Fitochrom – właściwości
nie jest osadzony w błonie
zlokalizowany jest w cytoplazmie
P(fr) jest transportowany do jądra
powoduje nasilenie ekspresji genów na drodze oddziaływań z innymi białkami
forma nieaktywna zawsze pozostaje w cytoplazmie
ekspresja właściwego zestawu genów warunkuje fenotyp, który jest odpowiedzią
występują też inne reakcje – zachodzi rozwidlenie szlaków
potrzebne jest oddziaływanie z czynnikami transkrypcyjnymi
zachodzą też reakcje szybkie w cytoplazmie z udziałem innych kinaz (a więc po autofosforylacji fosforyluje inne kinazy – kaskada kinaz)
Typy fotoreceptorów
fitochrom
kryptochromy
fototropiny
Fotoreceptory – informacje ogólne
fitochromy i fototropiny absorbują światło UV-A i światło niebieskie
mogą działać osobno lub razem, modulując wtedy swoją aktywność
różnią się od siebie chromoforami
fitochrom – fitochromobilina
kryptochromy – FAD/FNM, MTHF, Trp
fototropiny - FAD/FNM, MTHF, Trp
fototropiny ZL – zeit luppe (zegar biologiczny)
MTHF – pteryna – metynylo-tetra-hydro-folian
najważniejszy jest fitochrom, oznaczenie zależne od genu, który go koduje, gdyż jest kodowany poligenowo, stwierdzono to u Arabidopsis (rodziny A-D). Rodziny różnią się właściwościami
Procesy rozwojowe indukowane przez światło
dojrzewanie nasion, kwitnienie, deetiolacja siewki, zmiany morfologiczne, fototropia, grawitropizm, unikanie cienia, przejście z fazy wegetatywnej do generatywnej
jeśli gatunek jest wrażliwy fotoperiodycznie to kwitnienie jest regulowane przez fitochrom, przykładem jest chryzantema (gibereliny też to regulują)
Fotokonwersja fitochromu
nie jest ważne bezwzględne stężenie P(r) lub P(fr), ale ich stosunek do siebie
zależy od tego stan fotostacjonarny
właściwym odbiorcą sygnału jest liść, a nie inne organy
Fitochrom, a bodźce
odpowiada za różne typy sygnalizacji – wewnątrzkomórkową, międzykomórkową i międzyorganową
wewnątrzkomórkowa – tworzy się P(fr), wędruje z cytoplazmy do jądra, tam oddziałuje na czynniki transkrypcyjne, zmienia profil ekspresji genów
międzykomórkowa – odkryto ten mechanizm na liścieniach Arabidopsis. Gen lucyferazy rozkładający lucyferynę indukuje powstanie niebieskiego światła, odpowiada za to gen reporterowy, którego aktywność jest pod kontrolą światła czerwonego. W zależności od natężenia światła sygnał jest przesyłany do innych komórek. Geny zależne od światła czerwonego są regulowane przez fitochrom
między organowe – na mutantach Arabidopsis (gen GFP) dochodziło do zmian morfologicznych niezależnie od miejsca działania bodźca. Mutant PhyB jest podobny do roślin etiolowanych, ale jeśli podziała się światłem czerwonym, to fenotyp zmienia się na wildtail.
Ścieżka sygnalizacji – zmiana wzoru ekspresji
w momencie powstania P(fr) następuje transdukcja sygnału do jądra
Phy1 i FHL (białka) łączą się z P(fr) i ułatwiają jego transport przez błonę do jądra
inna grupa białek łączy się z DNA (białka regulatorowe) co uruchamia syntezę białek transportowych
akumulacja kompleksu P(fr)-nośnik w jądrze rozpoczyna inhibicję produkcji nośników. Jest to więc sprzężenie zwrotne ujemne
Jak widać występuje mechanizm włączania i wyłączania sygnału
Czynniki transkrypcyjne PiF
białka regulujące transkrypcję
PiF 1 – PiF 6 jest najbardziej znane, ale rodzin jest o wiele więcej
PiF – Phytochrome interacting Factor z rodziny BhLH (duża konserwatywność)
PiF = PiL, gdyż są do siebie bardzo podobne
oprócz białek PiF mamy też białka AFR
fitochrom A i fitochrom B mają różne powinowactwo do czynników transkrypcyjnych
Podział czynników transkrypcyjnych
homodimery
heterodimery
kompleks proteiny i DNA – rozpoznaje kasetę G
kompleks złożony z proteiny, DNA i fitochromu – kompleks aktywny
Działanie P(rf) i PiF
po fotokonwersji P(r) do P(fr) następuje transport do jądra
w kompleksie z PiF3 następuje inhibicja ekspresji genu fotomorfogenezy
skotomorfogeneza etiolacja, fotomorfogeneza deetiolaca
PiF3 jest negatywnym regulatorem procesu fotomorfogenezy
PiF3 jest jednak przykładem nietypowym, gdyż reguluje negatywnie
P(fr) połączone z PiF3 fitochrom jest kinazą, który poprzez fosforylację PiF3 naznacza je do degeneracji, a więc dochodzi do kontrolowanej proteolizy czynnika w proteasomach i jeśli tak się stanie, to geny fotomorfogenezy są czynne ponownie. Jest to tzw.: droga kontrolowanej proteolizy PiF3
Oddziaływanie światło – receptor
przykładem może być model ekspresji LHC B przez PHY B
PiF3 i CCA sa czynnikami transkrypcyjnymi, gen LHC B koduje LHC II, natomiast CCA 1 jest produktem genu, który reguluje ekspresję genu LHC B, natomiast PiF rozpoznawany jest przez kasetę G (CACGTG)
aby zaszła ekspresja LHC II potrzebny jest fitochrom i elementy towarzyszące, gdyż sam fitochrom nie uruchomi reakcji
jeśli dojdzie do odebrania bodźca to powstaje P(fr), transportowany jest do jądra, tworzy kompleks z PiF3 i kasetą G
uruchamiana jest transkrypcja genu CCA1, a więc białka będącego czynnikiem transkrypcyjnym, które następnie transportowane jest do jądra
białko CCA1 przyłącza się do genu warunkującego ekspresję LHC B
LHC B wchodzi w skład LHC II
tak więc P(fr) nie oddziałuje bezpośrednio na LHC B, ale warunkuje powstania czynnika transkrypcyjnego. Dlatego też jest kaskadą genetyczną przekazywania sygnału.
każdy element tego szlaku może być modyfikowany
posttranslacyjne
posttranskrypcyjne
Modelowy przykład roli P(fr) w etiolacji i deetiolacji
poznano mechanizm recepcji, transdukcji i odpowiedzi
etap I: zachodzi percepcja sygnału przez cytozolarny receptor rozpuszczalny (dzieje się tak gdyż światło przenika przez ścianę komórkową do wnętrzna komórki)
etap II: transdukcja – po powstaniu P(fr) następuje synteza dwóch wtórnych przekaźników informacji, czyli:
otwarcie kanałów Ca²⁺ i ich wpływ na komórki, to w efekcie uruchamia kaskadę kinaz zależnych od wapnia
synteza cyklicznych nukleotydów, które jako wtórny przekaźnik indukuje aktywność kinaz białkowych
etap III: odpowiedź
kinazy białkowe umożliwiają przyłączenie czynników transkrypcyjnych do DNA
czy kinazy mogą odłączać białka od DNA?
następuje transkrypcja, translacja i deetiolacja (zielenienie)
Deetiolacja
fitochrom odbiera sygnał
transdukcja
Ca²⁺ + cGMP
otwieranie kanałów wapniowych i aktywacja cyklazy cGMP
reakcja:
aktywność enzymów fotosyntezy
synteza prekursorów biosyntezy chlorofilu
zmiana stężenia fitohormonów
Receptor światła niebieskiego
fototropiny – fototropina 1 i 2
kryptochromy – kryptochrom 1 i 2
zeaksantyna – kojarzy się z ksantofilem
Typowe reakcje receptorów światła niebieskiego
fototropizm
wydłużenie hipokotyli
ruch aparatów szparkowych
akumulacja antocyjanów
ruch chloroplastów
WYKŁAD 6
Fototropiny
część N-końcowa
odpowiada za absorpcję światła
składa się z dwóch domen LOV
każda domena wiąże jedną cząsteczkę chromoforu – FMN
część C-końcowa
jest kinazą serynowo-treoninową
substratem jest fototropina, która na świetle ulega autofosforylacji
Fototropiny
białka cytoplazmatyczne zlokalizowane przy błonach komórkowych
funkcja związana jest z regulacją procesów ruchowych organów, komórek i chloroplastów zależnie od zmiany oświetlenia
PHOT1 – w świetle słabym
PHOT2 – w świetle silnym
przy fototropizmie aktywna jest PFOT1 i PHOT2
przy otwieraniu szparek i ruchach organelli tak samo
przy epistofii aktywne obie, ale przy parastofii tylko PHOT2 – wykazano to działaniem światłem czynnościowym (400-500nm)
Działanie fototropin
światło niebieskie hamuje wzrost wydłużeniowy etiolowanych siewek
reakcja wzrostowa jest poprzedzana depolaryzacją błony, jest więc zależność między depolaryzacją, a hamowaniem
aby doszło do zahamowania, błona generuje depolaryzację
Mechanizm działania aparatów szparkowych
zależnie od jabłczanu, K⁺, glukozy i innych
światło niebieskie wzmaga tempo procesu i jego odwracalność
fototropina warunkuje pęcznienie protoplastu komórek szparkowych, stymulacja światłem niebieskim H⁺-ATPazy warunkuje ten proces
stymulacja to napływ wody, co umożliwia otwarcie aparatu (napływpęcznienieotwarcie), wykazano to za pomocą oddziaływania wanadzianu na pompę protonową
Zeaksantyna
może współdziałać z fototropinami w regulacji ruchów szparkowych
u mutanta bez zeaksantyny otwieranie aparatów szparkowych pod wpływem światła jest ograniczone
Kryptochromy
receptory UV-A i światła niebieskiego
kontrolują procesy fotomorfogenetyczne w tym spektrum światła
gen kryptochromy CRY1 sklonowano w 1994 roku
warunkuje powstanie cry1, cry2, cry3 (1 i 2 tylko w jądrze, 3 w chloroplastach i mitochondrium)
regulują ekspresję genów
receptor wewnątrzkomórkowy
u Arabidopsis ekspresja na poziomie 5-25% genów zmienia się pod wpływem światła niebieskiego i UV-A
wcześniej uważano, że światło niebieskie wpływa tylko na wzrost grzybów
Kryptochrom – budowa
N-koniec jest receptorem światła, zbliżony budową do fotoliaz bakteryjnych, czyli bakteryjnego enzymu naprawczego DNA indukowanego przez UV, ale u roślin nie ma tej funkcji
wiąże dwa chromofory: FAD i pterynę (metynylotetrahydrofolian), nie jest kinazą
białko rozpuszczalne 75kDA
aktywność fizjologiczna kryptochromu wiąże się z fosforylacją (ale nie jest kinazą!)
Kryptochrom u zwierząt
odkryto je u zwierząt, stąd sądzi się, ze jest to receptor uniwersalny
u ssaków jest elementem zegara dobowego
u owadów, ptaków i roślin może być receptorem pola magnetycznego
u zwierząt pełni ponadto rolę fotoliazy
Współdziałanie kryptochromu i fitochromu
w deetiolacji roślin
reakcja jest więc wypadkową sygnału z dwóch receptorów
w ciemności zachodzi skotomorfogeneza, ale aby utrzymać ten stan potrzebne są białka DEP i COP, które utrzymują etiolację siewki
jeśli dostarczymy światło czerwone i niebieskie, to białka DEP i COP są dezaktywowane i zachodzi deetiolacja
tak więc usuwane są receptory fotomorfogenezy, wiemy to z analizy mutantów DEP/COP, które w ciemności mają fenotyp deetiolowany
Kryptochromy i fitochromy a pula antocyjanów
w siewkach sorga zbadano oddziaływanie światła czerwonego i niebieskiego
działanie światła niebieskiego, czerwonego i dalekiej czerwieni warunkuje syntezę antocyjanin
Procesy fizjologiczne a kryptochrom i fitochrom
wpływają na wydłużenie hipokotylu
działanie światła czynnościowego nieodwracalnie hamuje wzrost
Sygnały i bodźce zewnątrzkomórkowe
żywe organizmy rejestrują większość zmian fizykochemicznych zachodzących w środowisku
w regulacji procesów wzrostu i rozwoju rośliny może uczestniczyć prawie każdy związek czy bodziec
sygnałami egzogenicznymi dla rośliny może być światło, fotoperiod, CO₂ temperatura, wilgotność, sąsiedztwo innych roślin i inne.
Receptory
odebranie odpowiedniego sygnału wymaga obecności receptora
obecność receptora sprawia, że komórka jest kompetentna, brak świadczy o jej niekompetencji
pula receptorów jest zmienna, mogą być wycofywane, degradowane poddawane recyklingowi
sensory są wyspecjalizowane i odpowiedzialne za rozpoznanie i selektywne wiązanie (pochłanianie) cząstek sygnałowych
receptory inicjują reakcje wewnątrzkomórkowe, czyli przekazywanie sygnałów odpowiedzialnych za efekt
jeden ligand może warunkować wiele odpowiedzi
Odpowiedź
odpowiedź końcowa jest wypadkową wszystkich odpowiedzi indukowanych po przyłączeniu liganda do receptora
cząsteczki sygnałowe mogą łączyć się z receptorem:
zewnątrzkomórkowo – etylen i brassinosterole
wewnątrzkomórkowo – najczęściej w jądrze
Receptory zewnątrzkomórkowe
błonowe, na powierzchni lub wewnątrz błony komórkowej, rzadziej innych błon
ich aktywacja nie wymaga wnikania cząsteczki informacyjnej do komórki, np.: etylen, brassinosterole
po związaniu liganda receptor zmienia strukturę III i IV rzędową
receptory mają bardzo silne powinowactwo do liganda
mają część transporterową i zewnątrz/wewnątrz komórkową
są białkami integralnymi błony
ich struktura i mechanizm działania zależy od struktury liganda
większość z nich to białka mozaikowe posiadające domeny, czyli specjalne aa o okreslonej strukturze i funkcji (domeny i moduły)
Receptory wewnątrzkomórkowe
w cytoplazmie, jądrze komórkowym
ligandem są czynniki hydrofobowe i światło
odpowiedź następuje dopiero po wniknięciu liganda do komórki
mają charakter czynników transkrypcyjnych i zlokalizowane są głównie w jądrze
wiążą ligandy lipofilne
przekazują sygnał zewnątrzkomórkowy bezpośrednio do jądra
Ligand – receptor
ligandem u zwierząt jest białko
ligandem w komórce roślinnej są białka, oligosacharydy, związki niskocząsteczkowe (toksyny), czynniki fizyczne (światło)
w wyniku związania liganda z receptorem następuje zablokowanie lub pobudzenie receptora (ligandy są więc agonistami lub antagonistami)
Oddziaływania
agonista – pobudza receptor, charakteryzuje się dużym powinowactwem do receptora i 100% aktywnością wewnętrzną
antagonista – hamuje receptor, ma duże powinowactwo do receptora, ale jego aktywność wewnętrzna wynosi 0%
agonista częściowy – duże powinowactwo i średnia aktywność
Antagonizmy
kompetencyjny – antagonista i agonista rywalizują o miejsce wiązania tego samego miejsca aktywnego, reakcja jest odwracalna
niekompetycyjny – allosteryczny, antagonista i agonista wiążą się w innym miejscu, ich oddziaływania regulują modulatory
Odpowiedzi szybkie i wolne
czas potrzebny na odpowiedź (latencja) nazywany jest też czasem uśpienia
czas potrzebny na przetworzenie jednego bodźca na inny powoduje procesy trwające od milisekund do godzin
Wewnątrzkomórkowa kaskada sygnału
zmiany cytoszkieletu
zmiany metabolizmu
zmiany ekspresji
Klasy receptorów błonowych
receptor jonotropowy kanał jonowy
receptor metabotropowy współdziała z białkiem G
receptor katalityczny aktywność enzymatyczna (np.: kinaza serynowo-treoninowa
WYKŁAD 7
Klasy receptorów
jonotropowe – współdziałają z kanałem jonowym, po związaniu liganda (agonisty) dochodzi do zmian konformacyjnych co prowadzi do jego otwarcia/zamknięcia
metabotropowe – współdziałają z białkiem G, które jest białkiem sprzęgającym (trimer), w tym przypadku białko G lokalizuje się po wewnętrznej stronie błony, a kontakt z ligandem powoduje jego aktywację, oddziaływanie z efektorem, którym może być enzym lub kanał jonowy, albo wzrost stężenia wtórnych przekaźników informacji (Ca²⁺, cAMP, trifosfonukleotydy), typ charakterystyczny raczej dla zwierząt
Katalityczne – jedna część receptora jest sensorem, druga część jest enzymem (aktywność katalityczna) – kinazą, ale może to być kinaza zwierzęca (tyrozynowa), bakteryjna (histydynowa). Kinaza ma czasem preferencje substratowe i fosforyluje tylko resztę aminokwasową, którą ma w nazwie. Ligand jest tu dimerem, następuje dimeryzacja receptora, jego autofosforylacja krzyżowa wskazanej reszty aa
Receptor jonotropowy
otwiera lub zamyka kanał jonowy
wysoka wydajność, transport rzędu milionów cząsteczek na sekundę
generuje bardzo silny sygnał, ale przez długi czas nie było wiadomo, czy występuje u roślin. U Arabidopsis występuje 30 genów kodujących białka o strukturze podobnej do zwierzęcych receptorów jonów wapnia, a ich funkcja polega na wyładunku jonów Ca²⁺ z wiązek przewodzących i ich transport w roślinie
są podobne do receptora glutaminowego
innym przykładem jest receptor IP₃, którego ligandem jest 1,4,5-trifosfoinozytol, powoduje transport jonów wapnia z apoplastu do cytozolu lub z wakuoli do cytozolu
System odbioru i transdukcji sygnału
system jednoskładnikowy – występuje kinaza serynowo-treoninowa, która warunkuje ekspresję genów, a więc bezpośrednio fosforyluje czynnik transkrypcyjny, ale może to też mieć miejsce na zasadzie kaskady reakcji
system dwuskładnikowy – oparty na układzie kinazy histydynowej, poza receptorem, którym jest kinaza mamy jeszcze białko regulatorowe, które ulega fosforylacji, może bezpośrednio lub pośrednio wpływać na ekspresję genów. Tak więc reszta fosforanowa z His przenosi się na Arg białka regulatorowego
system trójskładnikowy – receptor, sprzęgające białko G i wtórny przekaźnik aktywacji, który powstaje w wyniku aktywacji białka G i jest ich wiele. Mogą powodować napływa jonów wapnia do komórki, syntezę cAMP i cGMP na drodze enzymatycznej, oraz mogą być tworzone IP₃ i DAG (diacyloglicerol), a więc dwa wtórne przekaźniki. Liczba wtórnych przekaźników pokazuje jak wiele ścieżek sygnalizacyjnych może być uruchamianych, dzięki temu dochodzi do ekspresji genów
Receptory katalityczne
mogą mieć układ jedno lub dwuskładnikowy
wiązanie liganda powoduje dimeryzację receptora, fosforylację krzyżową, gdzie reszta fosforanowa może być przenoszona na receptory lub białka modulujące ekspresję genów
jednoskładnikowy system transdukcji – pojedyncze białka błonowe, lub kompleksowe, które:
mają część wiążącą cząsteczkę sygnałową
mają część kotwiczącą
mają część efektorową, którą jest kinaza, lub element wiążący się z enzymem
System jednoskładnikowy
zawiera część katalityczną, czyli efektorową, najczęściej kinazę
występują 3 typy kinazy (RTK – tyrozynowej/RLK – serynowo treoninowej)
receptor bogaty w reszty cysteinowe
receptor o budowie suwaka leucynowego
receptor z regionami charakterystycznymi dla przeciwciał
ligand ma charakter peptydu
przeniesienie sygnału odbywa się w obrębie tego samego białka, z części błonowej do cytoplazmatycznej, cytoplazmatyczny fragment układu ma u roślin właściwości kinazy serynowo-treoninowej (rzadziej histydynowej), a u zwierząt jest to kinaza tyrozynowa
domena sygnalizacyjna jest rozbudowana, fragment ten reguluje aktywność, katalizę, wiązanie ATP itd.
Podział RLK u roślin
kinazy receptorowe bogate w powtórzenia reszt leucyny (LPR) – receptor brassinosteroidów
struktura domen zewnątrzkomórkowych są zatem bardzo ważne
Funkcje RLK
proces samoregulacji sporofitowej
proliferacja merystemu wierzchołkowego pędu
proliferacja komórki
odpowiedź na działanie patogenów
w detekcji brassinosteroidów
odpowiedź na stres
elongacja komórek
rozwój aparatów szparkowych
dyferencjacja szkieletu
Aktywacja receptora – kinaza tyrozynowa
wiązanie liganda
dimeryzacja receptora
krzyżowa autofosforylacja
wiązanie substratów o aktywności enzymatycznej, np.: białko GAP
System dwuskładnikowy pierwszy
np.: kinaza histydynowa + białko regulatorowe
po związaniu liganda następuje autofofrorylacja krzyżowa histydyny na C-końcu, po połączeniu białko regulatorowe jest fosforylowane, ale nie musi to być His
białko regulatorowe może oddziaływać z DNA lub innym elementem, a dopiero to z DNA
System dwuskładnikowy drugi (hybrydowy)
różnicą jest to, że tutaj Asp jest stale połączona z układem kinazy histydynowej
przykładem jest ERT – receptor etylenu
System dwuskładnikowy
łączenie +autofosforylacja
fosforylacja regulatora
defosforylację regulatora odpowiedzi warunkuje fosfataza
Receptory metabotropowe
system trimeryczny, a więc składa się z domen alfa, beta i gamma
wiązanie liganda powoduje aktywację białek
te z kolei wiążą GTP lub GDP
dochodzi do dysocjacji jednostki gamma, a jednostka alfa łączy się GTP, może więc działać na enzym lub kanał jonowy, powstają wtórne przekaźniki, a dimer beta-gamma może z kolei warunkować inne reakcje
szlak ulega zatem rozgałęzieniu
receptor serpentynowy – sprzężony z białkiem G, 7TM (7 razy domena przechodzi przez błonę), poza tym domena N-końcowa i C-końcowa
Białka G
cechą charakterystyczną jest zdolność wiązania GTP lub GDP
mają aktywność GDP-azy
podział:
duże – heterocykliczne białka G zlokalizowane na wewnętrznej powierzchni błony komórkowej – heterotrimery
małe – monomeryczne białka G, o różnej lokalizacji wewnątrzkomórkowej, zawierają tylko podjednostkę alfa, wykazują charakter GTP/GDP-aza
w stanie nieaktywnym przyłączone jest do nich GDP, w momencie aktywacji przyłączane jest GTP. W konsekwencji podjednostka alfa ulega oddysocjowaniu, która może warunkować różne ścieżki sygnalizacyjne i dążyć do różnych białek docelowych
aktywność GTP-azowa jest bardzo mała, a cały układ jest regulowany przez pulę białek, które wzmacniają sygnał – tempo rozkładu GDP, rozdział i dysocjacja podjednostek, możliwość przypadkowego połączenia z agonistą
małe białko G lub duże białko G jest połączone z GDP (forma nieaktywna) lub z GTP (forma aktywna), zmiana konformacji wymaga zatem przyłączenia GTP, wyłączenie wymaga dysocjacji GTP do GDP, są to zatem przełączniki molekularne
u zwierząt jest więcej dużych białek G, u roślin więcej małych białek G
Białka regulatorowe
są to białka GEF, które katalizują szybką wymianę GDP to GTP
oprócz tego aktywność GTP-azowa podjednostek alfa jest bardzo mała. Modulują ją czynniki GAP, przyspieszając rozkład GTP do GDP
są też czynniki, które umożliwiają dezaktywację w wyniku odłączenia białek G
Wygaszanie sygnału
zmiany konformacyjne po związaniu białka przenoszone są na podjednostkę G-alfa-GDP i wymuszają zastąpienie GDP przez GTP
wymiana GDP na GTP i zmiany konformacyjne umożliwiają niezależne oddziaływanie G-alfa-GTP i G-beta-gamma
oddziaływanie beta-alfa-GTP z białkiem efektorowym może być stymulowane przez białko efektorowe i dodatkowo przez RGS (czynniki GAP)
hydroliza GTP i zależne od tego zmiany konformacyjne umożliwiają reasocjację G-alfa-GDP i związanie z receptorem GPCR
w kompleksie G-beta-gamma działa jak inhibitor dysocjacji GDP, czyli GDI
GPCR (receptor serpentynowy) ulega regulacji, czyli desensytyzacji, czyli znieczuleniu samoistnemu (fosforylacja reszt Ser i Tre)
Heterodimer G
oprócz genu G-alfa u roślin występuje też nietypowe białko XLG (extra large G protein), ale gen ten ma nieznane funkcje
poziom identyczności sekwencji białek G roślin i ssaków jest niski
G-alfa = 30%
G-beta = 42%
G-gamma = 25-35%
WYKŁAD 8
Monomeryczne białka G u roślin
są małymi GTP-azami
nadrodziny białek klasy G są klasyfikowane do czterech rodzin: Art/Sar; Rab; Rop/Rac i Ran
wszystkie białka G funkcjonują jako przełączniki molekularne aktywowane przez GTP i inaktywowane na skutek hydrolizy GTP do GDP i ortofosforanu
cykliczne przemiany GTP/GDP regulowane są przez 3 klasy białek
białka wymieniające nukleotyd guanylanowy – GEF
białka aktywujące GTP-azę – GAP
białka hamujące dysocjację nukleotydu guanylowego – GDI
Rola Rop/Rac w sygnalizacji (najlepiej poznane)
jest pośrednia pomiędzy błonowymi receptorowymi kinazami serynowo-treoninowymi odbierającymi sygnał ze środowiska zewnątrzkomórkowego, a wewnątrzkomórkowymi białkami efektorowymi
niektóre enzymy
białka adaptacyjne regulujące organizację cytoszkieletu
białka biorące udział w cumowaniu pęcherzyków egzocytarnych do błony
Mechanizm regulacji małych białek G
GDP – wyłączone, GTP – włączone
uruchamiana jest aktywność GTP-azowa
sekwestracja w cytozolu podczas gdy przyłączone jest GDP, co oznacza, że część nie bierze udziału w aktywnej sygnalizacji
białko regulatorowe GDI utrzymuje białko w stanie nieaktywnym, tak więc nie jest połączone z GDP, tylko GDI. Mówimy wtedy o sekwestracji
Aktywacja małych białek G z podrodziny Rho
u człowieka występuje ok. 70 białek GEF i GAP, czyli bardzo mało
sygnał zewnątrzkomórkowy oddziałuje na pulę GEF i GAP
GEF i GAP oddziałują na Rho/Rac
Ścieżka małych białek G
sygnał oddziałuje na kompleks –GDI-Rop-GDP
GEF warunkuje powstanie kompleksu Rop-GTP (odłączenie GDI i podstawienie GTP za GDP)
GAP warunkuje reakcję odwrotną do GEF
przekazany sygnał może warunkować reorganizację cytoszkieletu, wydzielanie, egzocytozę)
Mechanizm działania monomerycznych białek G z podrodziny Rop
kaskada sygnalizacyjna
reorganizacja cytoszkieletu, odpowiedź na hormony roślinne, produkcja H₂O₂, sygnalizacja Ca²⁺ i jego zwiększone stężenie w cytozolu
Podsumowanie
receptory – dzielimy ze względu na mechanizm działania i rozmieszczenie
wewnątrzkomórkowe białka sygnalizujące działają jak przełączniki molekularne
GDP/GTP – aktywne z GTP, nieaktywne z GDP
fosforylacja/defosforylacja – aktywne ufosforylowane, nieaktywe nieufosforylowane
Białka G
ich białkami docelowymi są kanały jonowe, enzymy (cyklaza adenylowa, fosfolipaza C)
cyklaza adenylowa zwiększa wewnątrzkomórkowe stężenie cAMP
fosfolipaza C wytwarza wtórne przekaźniki informacji:
trifosforan inozytolu (IP₃)
diacyloglicerol (DAG)
prowadzi to do aktywacji kinaz białkowych A i C, każde białko ma swoje białko docelowe (IP₃ - A; DAG – C)
Heterodimeryzacja białka G
przyłączanie produktów hormonalnych i zmiany konformacyjne receptora
receptor łączy się z białkiem G
GDP łączy się z białkiem G, następuje zastępowanie GDP przez GTP, dysocjacja podjednostek białka G
podjednostka alfa przyłączana jest do syntazy adenylowej, następuje aktywacja syntezy cAMP
hydroliza GTP do GDP powoduje odłączenie podjednostki alfa od cyklazy, podjednostka alfa przyłącza się do układu G-beta-gamma, następuje regeneracja konformacyjna bialka G, która może być aktywowana przez kompleks receptor – hormon
Białka G
w genomie Arabidopsis odkryto tylko 4 geny kodujące poszczególne podjednostki heterodimerów białka G. Najwięcej jest ich u soi.
możliwe białka G mogą kontrolować następujące procesy
rozwój i kiełkowanie nasion
wczesne etapy rozwoju siewek
determinuje kształt organów
z udziałem białek G przekazywane są sygnały hormonalne i fitochromu
Gibereliny – indukcja syntezy alfa-amylazy
w kiełkach nasion zbóż
gibereliny są syntetyzowane w zarodku i dyfundują do endospermy przez scutellum
następuje transport do warstwy aleuronowej
synteza de-novo alfa-amylazy
rozkład skrobi do maltozy
dzieje się tak na skutek sygnalizacji dwuetapowej
gibereliny łączą się z receptorem, oddziaływanie z białkiem G, kaskada
zaangażowane w to są 2 różne ścieżki sygnalizacyjne
zależne od jonów wapnia – kanał jonowy
niezależne od wapnia – zależne od cGMP – syntaza cGMP
tak więc efektorem jest kanał jonowy i białko syntetyzujące cGMP
cząsteczka sygnałowa w drodze niezależnej od wapnia łączy się z białkiem DELLA, które jest represorem genu kodującego MYB
białko DELLA zostaje odłączone od DNA i jego rozkład następuje w proteasomach
produkcja alfa-amylazy, następnie jego segregacja i transport
Heterodimeryczne białko G
może też następować zdarzenie od przekaźników lipidowych
podjednostka alfa ma fosfolipazę C i działa difosforan fosfatydyloinozytolu i uwalnia z niego wtórne przekaźniki informacji
trifosfoinozytol jest ligandem dla kanałów wapniowych e ER
IP₃ łączy się z kanałem wapniowym, następuje transport jonów wapnia z ER do cytozolu, czyli jest to kanał bramkowany ligandem
diacyloglicerol jako białko docelowe ma kinazę białkową C, może zatem fosforylować, ale musi mieć zapewnione przyłączenie jonów wapnia dla uzyskania pełnej aktywności
jony wapnia mogą pochodzić z różnego źródła
Wtórne przekaźniki u Eucaryota
cAMP
cGMP
cADPR
diacyloglicerol
1,4,5- trifosforan inozytolu
H₂O₂
NO
Ca²⁺
Cechy wtórnych przekaźników
cząsteczki małe i bardzo małe
tworzone szybko w dużych ilościach
aktywne przez krótki czas
inaktywowane bardzo specyficzną reakcją
wzmacnianie sygnału inicjowanego przez aktywację receptora
Szlaki z udziałem przekaźników II rzędu
trifosfoinozytol powoduje uwolnienie jonów wapnia
kalmodulina wiąże jony wapnia
powstaje aktywny związek, który działa na białka docelowe i wyzwala efekt
Cykliczne nukleotydy
badania na Dictyo stellium i jednokomórkowym glonie Chlamydomonas rheinkardii
xTP przekształcany jest w 3’5’-cxMP i PPi – włączenie
cxMP pod wpływem fosfodiesterazy przekształca się do 5’xMP – wyłączanie
ATP cAMP AMP
GTP cGMP GMP
cyklazy esterazy
WYKŁAD 9
Synteza i inaktywacja cAMP i cGMP
warunkowane przez cyklazy
cyklazy adenylanowa i guanylanowa
Cyklaza adenylanowa
zawiera dwie domeny
12 motywów transmembranowych podzielonych na grupy M1 i M2
domeny zewnętrzne mogą być glikozylowane
domeny wewnątrzkomórkowe to C1a oraz C1b
występuje wysoka homologia sekwencji aminokwasowej części domen
Ogólnie o cyklazach
zawierają domeny katalityczne, regulatorowe, transmembranowe, kinazowe, oraz sekwencje bogate w Leu i o nieznanej funkcji
zawsze i w każdej cyklazie występuje domena katalityczna, pozostałe mogą, ale nie muszą występować
Sygnalizacja z udziałem cAMP
włączony - cAMP
wyłączony - 5’-AMP
Kinazy zależne od cAMP
posiadają związki z którymi oddziaływują
elementem z którym oddziałuje cAMP jest kinaza, którą jest kinaza białek A (kinaza A) i katalizuje fosforylację
w postaci nieaktywnej katalaza składa się z dwóch jednostek katalitycznych, dwóch regulatorowych, które są ze sobą połączone, a połączenie to hamuje aktywność katalityczną
jednostki regulatorowe posiadają miejsca wiązania cAMP, po 2 na każdej jednostce. Przyłączenie cAMP powoduje, ze jednostki odłączają się od siebie
jednostki katalityczne odłączają się i uzyskują aktywność katalityczną
Mechanizm działania kinaz A (PKA)
połączenie cAMP z jednostkami kinazy zmienia jej aktywność katalityczną
umożliwia to odłączenie jednostek katalitycznych
Aktywacja genu przez cAMP
szlak rozpoczyna się połączeniem metabotropowym z substancją sygnalizacyjną
białko G (podjednostka alfa) i cyklaza adenylanowa przyczyniają się do syntezy cAMP
kinaza A jest aktywowana przez cAMP i wędruje do jądra
jednostka katalityczna fosforyluje białko i reguluje ekspresję genów. Ufosforylowane białko regulatorowe łączy się zatem z regionem promotorowym, następuje ekspresja
Cyklaza guanylanowa
budowa zbliżona do adenylanowej, są jednak różnice
zawsze istnieje jednostka katalityczna, której „wielkość” może być różna
cyklaza sGC – rozpuszczalna wersja cyklazy guanylanowej, która zawiera domenę w postaci hemu, który może wiązać tlenek azotu, zatem jest ona regulowana przez NO
inne podobne do sGC: rGC, ALGC1, ALWAKL10, LPR ARK GC
rGC występuje w ER, związany z błoną
istnieje zatem zróżnicowanie struktury i funkcji w zależności od kompartmentu komórkowego
Sygnalizacja z udziałem cGMP
przy stresie biotycznym w ataku patogena
ligandem jest PAMP, czyli Wzorce Molekularne Związane z Patogenem, który łącząc się z receptorem uruchamia cyklazę guanylanową (PAMP może być białkiem, cukrem, chityną, chitozanem – wszystkim)
domena katalityczna generuje cGMP, który może
bramkować kanał Ca²⁺ - transport wapnia z apoplastu do cytozolu
wyzwalać reakcję nadwrażliwości
oddziaływać z kinazami G, które fosforyluja białka, co możemy udowodnić analizą proteomu – przy cGMP mamy białka ufosforylowane, przy wodzie w kontroli nie będzie efektu
działać na poziomie transkryptomu zmieniając jego profil
regulować transkrypcję
oddziaływać z fosfodiesterazami, które rozkładają cGMP
Szlaki zależne od cGMP
światło ABA NO NOGC GTP do cGMP 8-nitro-cGMP SLAC1 zamknięcie szparek
tak więc cGMP pod wpływem ABA i światła zamyka aparaty szparkowe
GC = cyklaza guanylanowa po polaczeniu z NO tworzy aktywną cyklazę (NOGC)
powstaje cGMP
cGMP pod wpływem NO i ROS przekształca się do 8-nitro-cGMP
dopiero 8-nitro-cGMP działa na kanały anionowe aparatów szparkowych, prowadzi to odpływu jonów z wodą
wypływ wody powoduje zamknięcie aparatów szparkowych
NO – cząsteczka sygnalizacyjna
jest wolnym rodnikiem
ma kilko milisekundowy okres półtrwania
dobrze rozpuszcza się w wodze
łatwo dyfunduje przez błony
uniwersalny przenośnik informacji u Eucaryota
Synteza tlenku azotu
u zwierząt NO jest syntetyzowany przez syntazę tlenku azotu (NOS)
O₂ + L-Arg NO + L-cytrulina
NOS wymaga kofaktorów – NAD(P)H, FMN, FAD, tetrahydro-L-biopteryny i innych
dioksygenaza – charakter NOS, bo wbudowuje cząsteczkę tlenu do argininy
konstytutywna NOS (CNOS) występuje w śródbłonku naczyń i układzie nerwowym ssaków o generuje pikomolowe stężenia tlenku azotu, który z tego źródła i w tym stężeniu pełni funkcję regulatora
indukowana NOS (iNOS) generuje nanomolowe stężenie NO do aktywacji układu obronnego
NO u roślin
wiele z tych biochemicznych wskazuje istnienie roślinnych NOS (NOS-like), ale nie wyizolowano aktywnego enzymu
u roślin występują alternatywne źródła NO
reduktaza azotanowa
nieenzymatyczne przekształcanie NO₂ i NO₂¯ do NO na świetle przy udziale karotenoidów
Źródła NO u roślin
lokalizacje źródeł są różne – apoplast, cytozol, chloroplasty
funkcje także są różne – odpowiedź na patogeny, sygnalizacja ABA, wzrost
źródłem jest Arg lub azotyny
wymagane są różne kofaktory, np.: cytochrom C, fenole, kalmodulina
Biosynteza NO u roślin
NO₃ | NO₂ | Arg |
---|---|---|
Cykloplazmina (Reduktaza azotanowa) |
Chloroplasty, mitochondria, błona komórkowa (NiNOR) |
Chloroplasty, mitochondria, cytoplazma, peroksysomy, (ATNOS1/ATNOA1) |
są więc szlaki zależne od azotanów, azotynów i argininy
ATNOS – Arabodopsis-thaliana-NOS
to, że syntaza występuje w cytozolu nie oznacza, że nie może być różnych mechanizmów, gdzie NO powstaje z różnych substratów
Kompartmenty a NO
w każdym kompartmencie są mechanizmy syntezy tlenku azotu i jego rozkładu
apoplast, cytozol, mitochondria, chloroplast, peroksysomy – różne mechanizmy
nie ma mechanizmów w jądrze komórkowym
w apoplaście oksydaza poliaminowa może syntetyzować NO z poliamin
w peroksysomach mamy oksyreduktazę ksantynową – zupełnie inny mechanizm
mitochondrium – NO powstaje w wyniku funkcjonowania łańcucha transportu elektronów między kompleksem III, a oksydazą cytochromu C
w błonie komórkowej reduktaza azotanowa współdziała z NiNOR (reduktaza azotynowa)
Schematy syntezy
Szlak | Substrat | Mechanizm | Efekt |
---|---|---|---|
Oksydacyjny | Poliaminy | Oksydazy | NO |
Salicylohydroksamat (SHAM) | ? | ||
L-Arg | NOS-like | ||
Redukcyjny | NO₂¯ | NR, NiNOR | |
NO₃¯ | XO | ||
NO₂¯ | Nieenzymatycznie |
Rozkład NO u roślin
NO (niesymbiotyczne hemoglobiny) NH₃
NO (O₂) NO₂¯, NO₃¯ (zahamowanie sygnału)
NO (anionorodnik O₂¯) nadtlenkoazotyn ONOO¯ (super toksyczny)
NO (glutation) GSNO nitrozoglutation (reduktaza GSNO)
GSSG + NH₃
możliwe są zatem 4 mechanizmy obniżające ilość NO w roślinie
niesymbiotyczna hemoglobina - u roślin innych niż symbiotyczna
symbiotyczna hemoglobina – u roślin, które żyją w symbiozie z bakteriami wiążącymi tlen
Tlenek azotu u roślin
uczestniczy w procesach fizjologicznych – rozwój liści, wzrost korzeni, fotosynteza, deetiolacja siewek, stymulacja kiełkowania
reakcje obronne: synteza fitoaleksyn, reakcja nadwrażliwości, stymulacja enzymatycznej syntezy fenoli i flawonoidu (CSH, PAL)
udział w syntezie chlorofilu i chlorofosforylacji, regulacja łańcucha oddechowego, regulacja działalności akonitazy (cykl Krebsa)
bierze udział w szlaku sygnalizacji ET i ABA
przy zranieniu, stresie solnym i braku wody
podsumowując bierze udział w procesach wzrostu i rozwoju, metabolizmie kompartmentów, sygnalizacji, immunoodpowiedzi
PCD – programowana śmierć komórki
jest mechanizmem zabezpieczenia przed patogenem
NO + O₂ ONOO¯
wpływ ONOO¯
hamowanie oksydazy cytochromowej i białek łańcucha oddechowego
hamowanie akonitazy
hamowanie cyklazy rybonukleotydów
niszczenie białek, lipidów, DNA
WYKŁAD 10
Modyfikacje strukturalne białek wywołane przez NO
nitrowanie – nitracja – działanie jonu nitroniowego NO₂⁺
nitrozowanie – nitryfikazja dodanie jonu nitrozoniowego NO⁺ do grupy aminowej, tiolowej lub hydroksylowej pierścienia aromatycznego
ONOO¯ powoduje nitrację reszt tyrozynowych białek, co może upośledzić ich fosforylację przez kinazę lub zwiększać powinowactwo do degradacji w proteasomach
S-nitryfikacja zmienia strukturę przestrzenną białek (np.: kanałów jonowych) wpływając na ich funkcję – modyfikacje posttranslacyjne
grupy tiolowe w cysteinie są reaktywne, bo wystają poza białko
tak czy inaczej dołączenie azotu zmienia funkcję i przeznaczenie białek
S-nitrozylacja jest modyfikacją posttranslacyjną, a więc istotnie wpływa na zachowanie przekaźnika
Nitrozylacja
NO + O₂ NO⁺ jon nitrozoniowy
NO⁺ + -SH -SNO grupa nitrozotiolowa kaskada sygnałów reakcja
niegdyś reakcja ta była niedoceniana
wtórny przekaźnik informacji (NO) działa nie bezpośrednio, ale pośrednio (na grupy tiolowe)
Posttranslacyjne modyfikacje białek zależne od NO
S-nitrozylacja Cys P-CH₂-S- + NO P-CH₂-SNO
nitryfikacja pierścienia Tyr NO + O₂ ONOO¯; ONOO¯+ Tyr meta,para-dihydroksyTyr
nitrozylacja metali P-M + NO P-M-NO
Szlak z udziałem cGMP
NO wpływa na stymulacją cyklazy guanylanowej
z GTP powstaje cGMP
cGMP warunkuje reakcje fizjologiczne
cGMP odtwarza GTP w wyniku działania fosfodiesterazy
Szlak z udziałem NO u roślin
NO aktywuje kinazy MAP, które warunkują zmianę wzorca ekspresji genów
NO aktywuje cyklazę guanylanową, rośnie stężenie cGMP, w wyniku tego rośnie stężenie cADPR, to z kolei warunkuje wzrost stężenia jonów wapnia, prowadzi to do zmiany ekspresji genów
NO warunkuje S-nitrozylację, powoduje to zmiany aktywności enzymów, co warunkuje zmianę ekspresji genów
NO warunkuje nitrację Tyr, powoduje to zmianę aktywności enzymów i zmianę ekspresji genów
NO jest usuwany przez GSH i hemoglobiny, tworzy się układ GSNO/GSNO-reduktaza, a następnie przekształca się do GSSG i amoniaku
Wpływ NO na szlaki – objaśnienie
białka nie muszą być enzymami, ale mogą być cząsteczkami przekaźnikowymi lub czynnikiem transkrypcyjnym
ścieżki zależne od NO są złożone z kilku elementów
degradacja NO jest równie ważna co jego tworzenie
nitrozoglutation jest ważnym metabolitem wtórnym i to głównie on usuwa NO
Jony wapnia jako wtórny przekaźnik
wapń jest uniwersalnym przekaźnikiem wtórnym biorącym udział w
regulacji wzrostu i rozwoju
strukturalnie występuje w postaci kryształów szczawiany wapnia w ścianie komórkowej i stabilizuje pektyny
reguluje odpowiedź na stres abiotyczny i biotyczny
działa w połączeniu z innymi białkami tzw. sensorami wapniowymi, zmieniając ich aktywność
samo Ca²⁺ bardzo rzadko wywołuje jakiś efekt
receptory wapnia odbierają stężenie wapnia i dekodują to do zrozumiałego sygnału
Wapń – wtórny przekaźnik
w cytoplazmie stężenie wapnia wolnego jest utrzymywane w sposób aktywny na bardzo niskim poziomie – [Ca²⁺]cyt
stężenie [Ca²⁺]cyt utrzymywane jest przez pompy wapniowe
nadmiar jonów wapnia jest usuwany do apoplastu lub wakuoli
efektem aktywacji komórki jest gwałtowny wzrost [Ca²⁺]cyt z 100-200 nM do ok. 1μM
proces ten zachodzi bardzo szybko, bo w ciągu kilku milisekund
transport jonów wapnia do cytoplazmy zależy od aktywności kanałów wapniowych
sygnatura wapniowa jest to czasowo-przestrzenna charakterystyka sygnału [Ca²⁺]cyt - d[Ca²⁺]cyt/dt
termin sygnatury wapniowej podkreśla złożoność procesu i jego wagę w życiu komórki
[Ca²⁺]cyt jest istotną informacją
Ca²⁺ w kompartmentach
w każdym mamy wolny Ca²⁺ i związany
najwięcej wolnego wapnia jest w wakuoli, a następnie w ER i apoplaście
w stanie podstawowym w cytozolu i chloroplaście oraz mitochondrium jest bardzo niewiele jonów wapnia
Sygnatura wapniowa
w jądrze - 5 m. - cykliczne, wysokie piki od niskiego stałego poziomu
cytozol - 10 m. - stały niestabilny poziom, następnie słabnące piki
chloroplast - 30 m. - nagły wzrost i nagły spadek do wyższego poziomu
mitochondria - 20 s. - nagły wzrost i stały niestabilny spadek
Pompa wapniowa
wymaga powstania warunków jak dla pompy H⁺-ATPazy
jest to pompa typu symport-antyport
tak więc pierwotna pompa protonowa generuje energię w postaci symportu protonów
antyport – jony wapnia trafiają do wakuoli, jest to skojarzone z transportem H⁺
Kontrola stężenia wapnia
kontrola wzrostu [Ca²⁺]cyt odbywa się poprzez
kanały wapniowe w tonoplaście podobne do stymulowanych przez IP₃
kanały wapniowe niezależne od IP₃ bramkowane są potencjałem elektrycznym
kanały bramkowane przez cykliczne nukleotydy (CNGC)
kanały podobne do receptora glutaminianu (GLR)
kanały dwuporowe (TPC) w tonoplaście
CNGC i GLR występują w błonie komórkowej i mają zdolność wiązania kalmoduliny
Kontrola [Ca²⁺]cyt
pompy wapniowe (Ca²⁺-ATPaza) w błonie komórkowej i ER
wymienniki wapniowo-protonowe (H⁺/Ca²⁺) w tonoplaście
Czemu służy utrzymanie odpowiedniego stężenia wapnia?
adekwatność względem specyficznego sygnału
utrzymanie homeostazy
najwięcej wapnia wolnego i całkowitego musi się znajdować w wakuoli
wymaga to nakładów energii
Kanały inozytolowe
Ca²⁺ jest transportowany do wakuoli przy wykorzystaniu hydrolizy ATP do ADP i Pi przez pompy wapniowe
Uwalnianie następuje przez kanały wapniowe bramkowane 1,4,5-trifosforanem inozytolu
wapń łączy się kalmoduliną
powstaje kompleks wapń-kalmodulina
Struktura kanałów wapniowych
kanał dwuporowy
receptor jonotropowy
inne
Sygnatura wapniowa
wapń jest transportowany ze ściany komórkowej do cytoplazmy
największe stężenie Ca²⁺ jest w obrębie kanału i spada w głąb miąższości cytozolu
wygląda to jak krzywa Gaussa
im więcej kanałów w jednej lokalizacji tym większa amplituda krzywej Gaussa
wydajność: 1mln jonów/kanał/sekundę
Szybkość zmian stężenia
szybkość może być bardzo zróżnicowana
zmiana stężenia wapnia u pszenicy w protoplaście jest zależne od swiatła czerwonego
pik światła czerwonego w czasie t=0s, ekstrema w czasie t=24 i 108 sekund, szczyt w 48s
Mechanizmy działania wapnia
odbiór sygnału przez receptor
połączenie sygnał-receptor zmienia aktywność Ca²⁺-ATPazy i pomp Ca²⁺
następuje zmiana stężenia [Ca²⁺]cyt
odbiór sygnału może powodować uwolnienie wapnia z ER i wakuoli pod wpływem wtórnych przekaźników, np.: IP₃
większe [Ca²⁺]cyt zmienia aktywność białek wiążących wapń
białka te po związaniu wapnia aktywują enzymy warunkujące odpowiedź komórki
Ścieżka sygnalizacji z udziałem wapnia
białek wiążących wapń jest ok. 80
dzielą się na dwie grupy:
kalmoduliny (CAM)
podobne do kalmoduliny (CML)
w ten sposób może być regulowane nawet 25 tys. genów
Sensory wapniowe aktywowane przez Ca²⁺
kalmodulina i białkka kalmodulino podobne (CAM + CML)
wapiono-zależne kanały białkowe (CDPKs)
białka podobne do kalconeuryny B (CBL)
Kalmodulina
białko konserwatywne, u wielu grup organizmów
zawiera „motyw dłoni EF”
dwie części globularne połączone alfa-helisą
każdy płat zawiera dwa motywy dłoni EF, a każdy motyw przyłącza 2 jony wapnia (łącznie 4)
kompleks Ca²⁺-CAM stymuluje inne białka
Motyw dłoni EF
układ helisa-pętla-helisa
charakterystyczna sekwencja aa
wiąże wapń
kalmodulinopodobne białka mają trochę inną strukturę
Białka docelowe dla CAM i CML
CAM
białka błonowe
enzymy metabolizmu sygnalizacji (kinazy i fosfatazy)
czynniki transkrypcyjne
antyportery tonoplastu
białka wiążące się z RNA
CML
czynniki transkrypcyjne
antyportery
Regulacja zależna od wapnia na poziomie transkrypcji
istnieje wiele możliwości (aż 6!)
wapń łączy się z czynnikiem transkrypcyjnym i stymuluje ekspresję genów
wapń łączy się z CAM, a następnie ta łączy się z DNA i zachodzi ekspresja
wapń łączy się z CAM, a następnie zachodzi oddziaływanie na czynniki transkrypcyjne, które warunkują ekspresję genów
wapń łączy się z CAM, a następnie zachodzi aktywacja czynnika transkrypcyjnego, który łączy się z kinazą i zachodzi fosforylacja
wapń łączy się z CAM, a następnie zachodzi aktywacja czynnika transkrypcyjnego, który łączy się z fosfatazą i zachodzi defosforylacja
wapń łączy się z CBE i CIPK (kalconeuryna), co prowadzi do fosforylacji czynników transkrypcyjnych
Ekspresja i aktywacja za pomocą wapnia
Ca²⁺+CAM
indukcja lub inhibicja czynników transkrypcyjnych
czynniki transkrypcyjne powodują indukcję lub inhibicję genów docelowych
geny docelowe indukują lub inhibują aktywność/wyciszenie komórki
Kalmodulina aktywuje kinazy białkowe
CAM+4xCa²⁺ + kinaza aktywna kinaza
Kinazy zależne od wapnia
warunkują odpowiedź na stres abiotyczny i biotyczny
odpowiadają za prawidłową symbiozę z Rhyzobium
warunkują zawiązanie prawidłowej mikoryzy
umożliwiają prawidłowe kiełkowanie nasion
odpowiadają za prawidłowy wzrost kiełków
warunkują prawidłowość podziałów mitotycznych
Sygnatura reakcji, a specyfikacja reakcji fizjologicznej
oscylacje
niskie - sygnatura niewywołana - szparki otwarte
średnie - słabo wywołana - szparki w połowie otwarte
wysokie- sygnatura wywołana - szparki zamknięte
tego typu mechanizm warunkuje specyficzność reakcji na bodziec
komórki aparatów szparkowych integrują informacje zakodowane w oscylacjach wapnia indukowanych przez różne bodźce komórkowe, w ten sposób powstaje ostateczna odpowiedź
Odpowiedź na bodziec (I + II ≠ III)
Pseudomonas syringae - I
Mączniak - II
Pseudomonas + Mączniak - III
sygnały wapniowe generowane przez czynniki NOD bakterii symbiotycznych i grzybów mikoryzowych mają zróżnicowaną charakterystykę czasową i przestrzenną, co warunkuje specyficzną reakcję
każdy czynnik powoduje inną sygnaturę i inną odpowiedź
mufki (mikoryza)
brodawki (symbioza)
WYKŁAD 11
Fosfatydyloinozytole błonowe
fosfatydyloinozytol - PI
fosfatydyloinozytolo-4-fosforan - PIP
fosfatydyloinozytolo-4,5-bisfosforan - PIP₂
PIP₂ - rozkład
powstają dwa wtórne przekaźniki informacji
inozytolo-1,4,5-trifosforan – ruchomy przekaźnik bramkujący kanały jonowe
1,2 – diacyloglicerol – zakotwiczony w błonie komórkowej
każdy ten przekaźnik ma inne białko docelowe
miejsce ataku fosfolipazy warunkuje powstanie tych przekaźników
fosfolipaza A – odcinanie wolnego kwasu tłuszczowego
A₁ - węgiel 1
A₂ - węgiel 2
fosfolipaza C – uwalnia diacyloglicerol i inozytolotrifosforan
Szlak zależny od IP₃
z udziałem jednostki alfa białka G
najpierw fosfatydyloinozytol ulega fosforylacji
powstaje fosfatydyloinozytolo-4,5-bifosforan
działa lipaza C, która jest podjednostką docelową białka G
uwalnia się diacyloglicerol (niemobilny) i trifosfoinozytol (mobilny)
trifosfoinozytol ma białka docelowe w postaci kanałów bramkowanych IP₃, czyli kanały dla wapnia Ca²⁺
aby wyłączyć sygnał działa fosfataza – powstaje inozytol
Fosfolipaza C i drugi szlak związany z diacyloglicerolem (DAG)
ma swoje białka docelowe – kinaza białkowa C
kinaza białkowa C potrzebuje DAG i wapnia, aby była aktywna
może wtedy fosforylować swoje białka docelowe
doświadczalnie aktywność fosfolipazy C zbadano przez dodanie do układu estrów forbolu
Fosfolipaza A₂ w sygnalizacji komórkowej
z wolnych kwasów tłuszczowych w szlaku oktadekanowym powstaje JA
JA uruchamia wiele szlaków sygnalizacyjnych, co warunkuje ekspresję genów
wpływa to na pozostałe kinazy i białka docelowe
Fosforylacja
reguluje aktywność enzymów, kanałów jonowych i białek docelowych
fosforylacja na koszt hydrolizy ATP, katalizowana przez kinazy białkowe to najbardziej rozpowszechniony rodzaj modyfikacji kowalencyjnej
w zależności od klasy enzymu grupa fosforanowa jest przenoszona na resztę seryny i treoniny lub lizyny – aminokwasy preferencyjne (Ser – zwierzęta, Tre i Tyr – rośliny)
fosforylacja warunkuje włączenie sygnału, defosforylacja jego wyłączenie
grupa fosforanowa daje dwa ładunki ujemne do zmodyfikowanego białka, co wywołuje w nim zmiany strukturalne
w efekcie zmienia się powinowactwo białka do substratu lub aktywność enzymatyczna
Fosforylacja/defosforylacja
fosfatazy białkowe usuwają hydrolitycznie grupy fosforanowe połączone z białkiem i likwidują skutki działania kinaz
fosforylacja i defosforylacja są w warunkach fizjologicznych nieodwracalne, gdyż przy braku enzymu zachodzą z nieistotną szybkością
dzięki fosforylacji/defosforylacji regulowany układ znajduje się w stanie równowagi chwiejnej (dynamicznej)
fosforylacja i defosforylacja może przebiegać w ciągu sekund lub godzin, a kinetyka dostosowana jest do procesu fizjologicznego
skutkiem fosforylacji jest wzmocnienie sygnału (tryb – włącz), jedna kinaza może fosforylować setki białek docelowych
kinazy wykorzystują ATP jako donor grup fosforanowych, pozwala to powiązać stan energetyczny komórki z regulacją metabolizmu
Kinazy aktywowane mitogenem (MAPK)
stymulowane mitogenem (mitogene activated protein kinase)
MAP-kinazy to wspólny dla Eucaryota mechanizm łączący odbiór informacji przez receptory błonowe z biologiczną odpowiedzią komórki
mitogen – zewnątrzkomórkowa cząsteczka sygnałowa stymulująca podziały komórkowe
Kaskada kinaz MAP
aktywator MAPKKK MAPKK MAPK substraty
Kinazy a geny
pierwsza została odkryta w 1986r.
1993 – u lucerny odkryto pierwszą kinazę w świecie roślin
geny kinaz MAP u Arabidopsis
MAPKKK - 60 genów
MAPKK - 10 genów
MAPK - 20 genów
Kinazy MAP
serynowo-treoninowa ukierunkowana proliną
preferują sekwencje aminokwasowe –Pro-(Ser/Tre)-Pro-, czyli tzw.: sekwencje ukierunkowane proliną
kinazy MAP u roślin biorą udział w
szlakach przekazywania sygnału zależnego od ET, JA, SA, ABA, auksyn
kontroli cytokinezy
różnicowania się komórek
odpowiedzi na czynniki stresowe
Kaskada kinaz białkowych – typy
MAPKKK (MAP3K) – kinaza kinazy kinazy MAP
MAPKK (MAP2K) – kinaza kinazy MAP
MAPK (MAP) – kinaza MAP
różne sygnały odbierane przez receptory sprawiają, że sygnał może koncentrować się na jednej kinazie lub na kilku, docelowo kiedy sygnał przekazany jest na MAPK to każda kinaza MAPK może wywoływać jeden lub kilka efektów
fosforylacja powoduje zmianę aktywności, stabilności lub lokalizacji
przekłada się to na uruchomienie właściwych odpowiedzi, polegają one na regulacji ekspresji genów, uruchomieniu podziału, czy apoptozy
sygnał przekazywany przez MAPK przekłada się na odpowiedź komórki w wyniku zmieniających się warunków środowiska, ale nie same kinazy odgrywają tu kluczową rolę
Kinazy MAP – wieloczynnikowy system regulacji Eucaryota
sygnał na MAPKKK jest przekazywany z receptora za pomocą białka Ras
następuje kaskada kinaz, czynniki transkrypcyjne warunkują ekspresję
Nadrodziny kinaz – od czego zależą?
kinaza białkowa A i G - cAMP/cGMP
białkowa kinaza Ca²⁺-zależna - Ca²⁺
kinazy zależne od kalmoduliny - Ca²⁺-kalmodulina
kinazy receptoropodobne - fitochrom B
Szlaki transdukcji
zależne od aktywacji kinaz białkowych
zależne od [Ca²⁺]
Białka 14-3-3
konserwatywne białka regulatorowe
występują tylko u Eucaryota
monomery białek 14-3-3 mogą tworzyć homo- i heterodimery
wiążą się z białkami docelowymi, które maja ufosforylowane reszty Ser lub Tre
białka docelowe dla białek 14-3-3 s a ufosforylowane przy Ser lub Tre i wtedy dopiero są rozpoznawane
Mechanizm działania białek 14-3-3
Białko X | fosfataza białkowa | Białko X-P-14-3-3 |
---|---|---|
Kinaza białkowa |
Efekt
zmiana aktywności
zmiana stabilności
zmiana lokalizacji
kompleksowanie innych białek
Białka 14-3-3 u roślin - udział
gibereliny, ABA, brassinosteroidy
fototropiny
fitochrom
reakcje HR z udziałem SA
Cykliczna ADP-ryboza (cADPR)
u zwierząt
w transdukcji sygnału wapniowego
uwalnianie wapnia z rezerwuarów komórkowych niezależnych od IP₃
stymulowanie kanałów białkowych dla wapnia
u roślin
stymulowanie ABA w sygnalizacji wapniowej, a więc zamykanie aparatów szparkowych
WYKŁAD 12
Fitohormony w odporności roślin na stres
ujawniają się, gdy działa więcej niż jeden czynnik stresowy
nakładanie się stresów może dać inną, niesumaryczną odpowiedź
pewna ilość elementów jest wspólna tworząc jądro odpowiedzi, ale część się różni
aktywne geny
obecne metabolity wtórne
Hormony roślinne
meritum jest konwergencja szlaków sygnalizacji
ROS, kinazy i hormony to elementy kanoniczne, zawsze biorą udział w odpowiedzi na stres
odpowiedzi wolne zawsze zależą od wzorca ekspresji genów (MYC, MYB)
Czynniki biotyczne
patogenne
zgryzanie liści
patogeny liści
podgryzanie korzeni
patogeny korzeni
niepatogenne
zapylacze
mrówki
współzawodnictwo o nisze
symbionty
Odporność na stres biotyczny
układ jest układem militarnym: atak warunkuje obronę
mechanizmy
wydzielanie związków lotnych (VOC)
sygnalizacja chemiczna między roślinami (cross-talk)
unikanie wroga/szkodnika (decoy)
Mutacje receptorów hormonów, a fenotyp
skutki fenotypowe
brassinosteroidy
etylen
cytokiny
ABA
mutacje mogą dotyczyć produkcji hormonów lub detekcji
warunkuje to zmiany wrażliwości np.: na etylen, następnie zmianę budowę wiązki przewodzącej, brak przyrostu na grubość i opóźnione kwitnienie
Fitochormony
SA - mniej popularny stresowy
ET - typowy stresowy
IAA - nietypowy stresowy
ABA - typowy stresowy
JA - mniej popularny stresowy
brassinolid - mniej popularny stresowy
gibereliny
zeaksantyna
SAR oraz ISR
analizując poziom lokalny i systemiczny możemy się dowiedzieć, czy hormon działa w miejscu patogenezy, czy ogólnie w organizmie
na poziomie lokalnym jak i systemicznym zwiększa się stężenie hormonów – zależy t głównie od SA i JA, które mogą indukować odpowiedź systemiczną na patogeny i szkodniki
SA warunkuje SAR, a kształtowanie jej zależy od białek PR i jej indukcji przez patogeny liści, które określamy jako biotrofy grzybowe i bakteryjne, PR jest markerem SAR
JA sam lub z ET jest odpowiedzialny za ISR – indukowaną odpowiedź systemiczną, która nie wymaga obecności białek PR i wywoływana jest przez organizmy systemu korzeniowego, opisywane jako ryzobakterie promujące wzrost roślin (PGPR), np.: Bacillus
Brassinosteroidy
odkryte w latach 60 XXw. w pyłku rzepaku
występują u nago i okrytozalążkowych
pochodne triterpenów
steroidowe regulatory endogenne
pochodne cholestanu
występują popularnie, mają plan budowy jak hormony steroidowe
zawierają 3 pierścienie 6-węglowe i 1 pierścień 5-węglowy
C-23 – przy tym węglu znajduje się grupa OH wprowadzana przez specyficzną hydroskylazę
Cechy brassinosteroidów (BRs)
aktywne biologicznie w bardzo niskim stężeniu (nM i pM)
wywoływane efekty
silny wzrost wydłużeniowy łodygi
zwiększenie aktywności enzymów antyoksydacyjnych
wzrost odpowiedzi na chłód i suszę (białka szoku termicznego)
ograniczenie akumulacji metali ciężkich (polepszenie kondycji rośliny)
wzrost efektywności fotosyntezy (akumulacja fitochelatorów)
najlepiej poznane to brassinolid i kastasteron, oba oparte o plan budowy cholestanu
brassinolid wyekstrahowano z frakcji lipidowej ziaren pyłku rzepaku (250kg)
Mutanty związane z BRs
mutanty niezdolne do syntezy to karłowate mutanty cpd
nie posiadają kluczowego enzymu hydroksylazy C-23 cholestanu
nie zachodzi więc synteza brassinosteroidów
na matrycy geny cpd powstaje białko CPD
brassinolid ogranicza TMV w liściu tytoniu
wystarczy jednodniowe traktowanie za pomocą BR przed infekcją aby wytworzona została odporność
odpowiedź na TMV nie zależy od SA i SAR
infekcja Pseudomonas syringae i mączniaka: badano BRs z dodatkiem związków indukujących SAR (BTH)
mechanizm jest inny, bo niezależny od SA
skuteczność BR i ścieżki zależnej od SA jest bardzo podobna
rośliny jednoliścienne mogą być chronione przed Xanthomonas (bakteria) i Magnaporte (grzyb) za pomocą brassinolidu
BRs – podsumowanie
indukują odporność na wirusy, bakterie, grzyby
mechanizm nie jest zależny od SA, a więc nie jest elementem SAR
skuteczne i dwuliściennych i jednoliściennych
moc działania BRs jest taka sama jak mechanizmów SAR
Ekdysteroidy
hormony linienia owadów
duża homologia w stosunku do BRs
Fitoekdysony
u paproci i nagozalążkowych stanowią mechanizm ochrony przed owadami
bogate źródło tego typu związków to Asteraceae i Chenopodiaceae
szkodliwy wpływ na owady polega na tym, że związki tej grupy są trudno rozkładalne, łatwo się akumulują i zaburzają linienie, owad nie zrzuca pancerza (np.: jedwabnik morwowy), larwa wytwarza dwie głowy i nie linieje
skuteczne narzędzie zwalczania szkodników
najbardziej znany to 20-hydroksyekdyson, ale występuje w postaci mieszaniny izomerów, a jego zawartość zależy od wieku rośliny i maleje z wiekiem
ABA – wpływ na rośliny
związany ze stresem biotycznym i abiotycznym
indukuje stan spoczynku nasion
hamuje wzrost objętościowy komórek i wydłużanie pędu
indukuje zamykanie aparatów szparkowych
przyspiesza starzenie i abscysję (opadanie pędów)
ABA – funkcje
regulacja wzrostu i rozwoju - akumulacja białek zapasowych, indukcja spoczynku nasion
odpowiedź na stres – reakcja na suszę, zasolenie, temperaturę
Odpowiedź z udziałem ABA
szybka – zmiana aktywności kanałów jonowych
długoterminowa – zmiana ekspresji genów
ABA – dwie strategie syntezy
kondensacja kwasu mewalonowego
z karotenoidów (ksantofilu)
Znaczenie ABA w odpowiedzi na stres osmotyczny – drabinka
stres - susza, zasolenie, chłód, zranienie
bodziec - obniżony potencjał wody
efekt - wzrost stężenia ABA w cytozolu i apoplaście
odpowiedź - wzrost stężenia osmoregulatorów i białek łagodzących skutki stresu
(dehydryny, osmotyny, białka LEA)
ABA, a ekspresja genów
ABA odgrywa ważna rolę w sygnalizacji stresu suszy (zamykanie aparatów szparkowych) i regulacji ekspresji genów indukowanych przez stres z odwodnieniem tkanek
powoduje to wzrost stężenia ABA
następuje aktywacja czynników transkrypcyjnych
czynniki łączą się poprzez konserwatywne sekwencje ABRE (miejsce odpowiedzi na ABA) w regionie promotorowym, następuje ekspresja genów i stymulacja syntezy mRNA
ABA – odporność na patogeny
zależy od patogenu i gatunku rośliny, nie ma uniwersalnego stwierdzenia
etapy
faza preinwazyjna - faza I
faza pierwotnych reakcji obronnych - faza II
faza późnej obrony - faza III
wpływ na to ostatnie ma otwarcie aparatów szparkowych – są to wrota infekcji, dotyczy to głównie bakterii
zamykanie aparatów szparkowych likwiduje wrota infekcji, ale gdy bakterie wnikną do szparki, to najważniejszym procesem jest odkładanie kalozy (beta-1,3-glukanu), co sprawia, że zwiększona zostaje odporność pierwszej fazy
tworzy się papilla, zgrubienie ściany bocznej z dużą zawartością polifenoli – faza II
w fazie III może dojść do produkcji RFT, śmierci komórki roślinnej i reakcji nadwrażliwości
po fazie III dochodzi do wytworzenia odpowiedzi systemowej
ABA – klasyka gatunku
materiałem badań była interakcja pomidor – Botrytis cirenea
mutant nie syntetyzujący ABA jest odporny
dzieje się tak ponieważ wytwarzane jest więcej nadtlenku wodoru
prowadzi to do gromadzenia nadtlenku w epidermie
WYKŁAD 13
Kwas jasmonowy (JA)
synteza w chloroplastach i peroksysomach
syntetyzowany z wielonienasyconych kwasów tłuszczowych – kwas linolenowy (18C-3)
powstaje w wyniku działania lipooksygenazy
u roślin występuje w wielu formach
JA-Me - w wyniku działania JMT - lotny
JA-ACC - w wyniku działania nieznanego mechanizmu - lotny
JA-Ile - w wyniku działania JAR1 -aminokwasowy
koronatyna - nie jest pochodną JA - toksyna P. syringae
JA
lipooksygenza (dioksygenaza) wprowadza tlen w wielonienasyconych kwasach tłuszczowych i ich estrach w układzie cis,cis-1,4-pentadienu
pierwsze produkty powstałe w wyniku działania LOX mogą ulegać cyklizacji w wyniku działania cyklooksygenazy allenylowej (AOC) co prowadzi do powstania JA
Rola JA w roślinie
odpowiedź na stres
stres biotyczny: patogeny i szkodniki
stres abiotyczny: deficyt wody (susza, stres solny)
odpowiada za mikoryzę
odpowiedź na atak nekrotrofów
procesy rozwojowe
rozwój pyłku
rozwój zalążka
tworzenie włosków wydzielniczych
promuje starzenie się liści
udział w kiełkowaniu nasion z wysoką zawartością tłuszczu
warunkuje tuberyzację (tworzenie bulw ziemniaka)
przyspiesza wzrost korzeni
Reakcje fizjologiczne z udziałem JA
hamuje wzrost wydłużeniowy nadziemnych części roślin, kiełkowanie ziaren pyłku i nasion bogatych w tłuszcze – jest inhibitorem wymienionych procesów
stymuluje tuberyzację ziemniaka
przyspiesza starzenie się liści, stymuluje powstawanie warstwy odcinającej i opadanie liści
stymuluje tworzenie owoców i zamykanie aparatów szparkowych
JA, a odpowiedź na stres
w wyniku uszkodzenia mechanicznego tkanek roślin przez owady zachodzi wzmożona synteza jasmonianów i następuje aktywacja/indukcja biosyntezy enzymów odpowiedzialnych za gromadzenie się fitoaleksyn i inhibitorów proteaz
indukuje syntezę wtórnych metabolitów roślinnych (alkaloidów)
aktywuje ekspresję genów kodujących białka obronne, np.: osmotyny, oaz enzymy szlaku fenylopropanoidowego biorącego udział w biosyntezie fitoaleksyn
Interakcja Arabidopsis – Phythium mastosporum
mutanty fad niezdolne do akumulacji JA są wrażliwe na ten patogen
mutant coi1 jest niezdolny do detekcji sygnału JA i też jest wrażliwy
egzogenny JA chronił mutanty fad przed patogenem, nie chronił jednak coi1
okazuje się, że niezdolność odebrania sygnału jest tu kluczowa
gromadzenie się JA ma istotny wpływ na zwalczanie infekcji Phythium mastophorum
u wt zrobiono rozdział elektroforetyczny białek enzymatycznych kluczowych w odpowiedzi
produkcja fitoaleksyn i ich gromadzenie odpowiada za proces zwalczania
LOX2, CHS, PDF1,2 – geny lipooksygenazy, syntazy kallusowej oraz defensyny
Insekty i patogeny a udział JA w odpowiedzi
Me-Ja pełni podobną funkcję co ester metylowy SA, ma to związek z VOC, indukowane po ataku patogenu, infekcji lub uszkodzeniu przez owady
tworzy się wtedy pula GLVs (lotnych sygnalizatorów) przenoszonych do innej, niezaatakowanej rośliny, np.: Me-JA i Me-SA
powoduje to uczulenie = sensytyzację – priming
następuje indukcja związków nielotnych tworzących indukowaną odporność (JA) lub nabytą (SA)
odporność pojawia się po dniach lub tygodniach w wyniku działania VOC (VOC = terpenoidy + GLVs)
Ubikwitynacja białek
ubikwityna jest polipeptydem (76aa) o wysoce konserwatywnej sekwencji, kieruje cząstki do degradacji w proteasomach 26s
w procesie tym uczestniczy kompleks 3 enzymów
E1 – aktywuje cząsteczki ubikwityny kosztem ATP
E2 – przenosi ubikwitynę
E3 – ligaza ubikwitynowa przenosi ubikwitynę z E2 na Lys białka docelowego, odpowiada za swoistość substratową
uniwersalny mechanizm znakowania do degradacji
proceder:
mono-ubikwitynacja – modyfikacja jednej reszty ubikwityny
poli-ubikwitynacja – więcej reszt ubikwityny, łańcuch prosty lub rozgałęziony
Szlak sygnałowy zależny od JA
kluczowa jest ubikwitynacja, zależy ona od białka JAZ – białko z domeną „zin”, jest to represor białkowy dla genów zależnych od JA
akumulacja JA stymuluje ubikwitynację białkowego represora JAZ, co prowadzi do ekspresji genów
ponadto ligaza ubikwityna-białko SCFcoi1, którego białkiem docelowym jest JAZ
u roślin poddanych stresowi JAZ łączy się z SCFcoi1 po czym następuje ubikwitynacja i wędrówka do proteasomu 26s i rozkład, JA-Ile warunkuje tworzenie kompleksu JAZ-SCFcoi1
u niestresowanej rośliny JA-Ile jest mało, więc JAZ nie łączy z SCFcoi1
Metabolity sygnałowe owadów – pochodne lipidów
szkodniki buraków cukrowych wytwarzają wolicytynę, która warunkuje związków lotnych będących atraktantami dla parazytoidów szkodników
sygnał chemiczny wydzielany przez chrząszcze żerujące na grochu dają podobny efekt
Systemina
peptyd sygnałowy w reakcjach obronnych przeciw zranieniom
powstaje z nieaktywnego propeptydu (prosystemina) , jest długa, ma 260aa, systemina stanowi jedynie 18aa
receptory w błonie wykrywają systeminę, może to powodować uwalnianie jonów wapnia z wakuoli co aktywuje kinazy MAP. Powoduje to uwolnienie kwasu linolenowego z błony komórkowej i tworzenia JA. Dalej powstają inhibitory proteaz
jest to zatem jeden z elementów sygnalizacji zależnych od JA
Biosynteza etylenu (ET)
przyspiesza dojrzewanie owoców
wyjściowym elementem jest Met (cykl Younga)
SAM – S-adenozylometionina
ACC – kwas aminocyklopropanowy
MTA – S-metyloadenozyna
Met SAMACC ET Met – SAM = SAM3
SAM – ACC = ACS
ACC – ET = ACO
Szlak sygnalizacyjny z udziałem ET
brak etylenu – receptor – CTR - brak odpowiedzi
obecny etylen - receptor x CTR - odpowiedź
kinaza CTR1 jest negatywnym regulatorem odpowiedzi na etylen
co powoduje?
zahamowany wzrost elongacyjny
haczykowato zagięty wierzchołek
znikoma grubość pędu
szlak JA zależny od SA, ale szlak JA+ET jest niezależny od SA
Kwas salicylowy (SA)
kluczowa odpowiedź na patogeny i stres abiotyczny (solny)
syntetyzowany z Phe kwas cynamonowykwas benzoesowySA (szlak fenylopropanoidowy), lub z kwasu izochoryzmowego (w chloroplastach)
tworzy wiele połączeń, estry metylowe i cukrowe glikozydy
NPR1 – regulator odporności SAR i IPR
mutanty z wyciszeniem npr1
nie gromadzą białek PR
są podatne na infekcję grzybowe i bakteryjne
podatność na infekcje utrzymuje się u mutantów traktowanych induktorami SAR
NPR = NIM (non-immunity) = SAI (salicylic acid intensive)
mutanty z nadekspresją npr1
gromadzą 2-3x więcej PR
rośliny niezakażane mają normalny poziom PR
po infekcji wzrost odporności roślin transgenicznych cechuje właśnie 2-3x większy poziom białek PR – geny: PR1, PR2 i PR5
ważne w ścieżce zależnej od SA
NPR u Arabidopsis thaliana
npr i jego nadekspresja zwiększa odpowiedź na Perenospora parasitica
wielkość porażenia zależy od ekspresji npr1
tam gdzie duża ekspresja npr1 nie ma objawów zakażenia
Sygnały redoks regulują SAR
w środowisku utleniającym RFT powoduje wzmocnienie ściany komórkowej i odpowiedź lokalną
w środowisku redukującym oligomery (koniugaty S=S reszt cysteiny) NPR1 dysocjują do monomerów, które łącząc się z TGA1 powodują ekspresję białek PR i odpowiedź systemiczną
przejście z środowiska utleniające do redukującego warunkowane jest przez antyoksydanty, np. glutation
zmiana delta-redoks jest zależna od SA
Indukcja sygnału z udziałem NPR i SA
Arr-R SA TGA2-NPR1 PR1, PR2, PR3 SAR
pozytywny regulator SAR
mutanty npr1 są wrażliwe na patogeny
nadekspresja NPR1 prowadzi do odpowiedzi
Charakterystyka szlaku sygnalizacji zależnego od fitohormonów
Hormon | SA | JA | ET |
---|---|---|---|
Mechanizm | Delta redoks SA geny |
SCFcoi1 + JAZ JA geny |
EIN1 + CTR ET geny |
Regulator | Sygnały redoks | Ubikwitynacja | Ubikwitynacja + kinaza |