09:27 2013-10-14

Identyfikacja mutacji DNA

PCR-RFLP

PCR-ASO

PC

Endonukleazy restrykcyjne

występują w prokariota

Chronią te organizmy przed bakteriofagami

Własny DNA chroniony jest przez system etylaz

Znanych jest kilka tysięcy, używanych kilkaset Endonukleazy

Metylacja ane3nin lub cytozyn

Metylacja Dam (SAM -> pozycja N6 adeniny w sekwencji GATC)

Metylazy Dcm (SAM -> pozycja C5 cytozyny w sekwencji CCAGG lub CCTGG)

Dam 0 w losowej sekwencji jedno miejsce metylacji co 256 nukleotydów

Dcm - w losowej sekwencji jedno miejsce metylacji co 512 nukleotydów

Podstawowe narzędzie badawcze w biologii molekularnej

Największe znaczenie mają restryktazy klasy II

Są to homodimery aktywowane jonami magnezu

Rozpoznają sekwencje palindromowe 4-8 nukleotydowe

Miejsce cięcia w obrębie sekwencji lub poza nią

Sposoby cięcia DNA

- Tępe końce

- Lepki końce

Lepkie końce można zastosować do techniki klonowania.

PCR-RFLP

Polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych

Zastosowanie metod reakcji łańcuchowej polimerazy

Identyfikacja mutacji

Identyfikacja osów

Identyfikacja patogenów

Synteza genów

RT-PCR (badanie mRNA)

badanie ekspresji genów

ocena splicingu

Real Time PCR

badanie ekspresji genów

ocena splicingu

wykrywanie mutacji

wykrywanie i ilościowa ocena

Wirusów DNA i RNA

baterii

Potrzebne do real time PCR

sonda

startery i matryca

polimeraza

specjalny termocykler

Kontrola ekspresji genu

Proces wieloetapowy

Ciągle słabo poznany

Struktura chromatyny

Kontrola epigenetyczna

Inicjacja transkrypcji

Obróbka i modyfikacja transkryptu

Transport RNA

Kontrola przez regulacyjna RNA

Stabilność transkryptu

Inicjacja translacji

Modyfikacja postranslacyjna

Transport białka

Kontrola stabilności białka

Struktura chromatyny - regulacja dostępu do genu przez zmianę upakowania DNA - modyfikacja histonów i zasad DNA

Kontrola epigenetyczna - regulacja nie będąca konsekwencją zmian sekwencji nukleotydowej genomu.

Inicjacja transkrypcji - jeden z najważniejszych etapów regulowanych przez oddziaływanie

Obróbka transkryptu - wycinanie intronów, czapeczka, poliadenylacja, edycja

Transport

Regulacja Stabilności 0 kontrola przez regiony nie podlegające translacji

Kontrola epigenetyczna ekspresji (wiemy że nic nie wiemy)

-Modyfikacja DNA (głównie metylacja wysp CpG) - modyfikacja cytozyn może występować w wyspach CTG (wielokrotne powtórzenia CG) szczególnie podatne na metylację. Podlegają metylacji także histony - modyfikacje są bardzo bogate - metylacja, acetylacja, przyłączenie reszt cukrowych i innych polinukleotydów etc. Jeżeli histon ulega metylacji wtedy zwiększa się jego powinowactwo do DNA. Gdy acetylacji, wtedy traci on swój + ładunek, odpada on od chromatyny, chromatyna ulega rozluźnieniu i ułatwia to dostęp dla enzymów.

-Modyfikacja histonów

-Wpływ na kondensację chromatyny

kontrola epigenetyczna

Modyfikacja DNA (Głównie metylacja wysp CpG)

Metylacja cytozyny i tworzenie 5-metylocytozyny

Mechanizmy filogenetycznie stary (znany już u procaryota)

Ochrona przed fagami bakteryjnymi

U Eucaryota

Regulacja ekspresji genów

...

Wyspy CpG

Około 3% cytozyny w genomie ulega metylacji.

Głównie należy do wysp CpG lub CpNpG

Sekwencje CpG tworzą "wyspy" składające się z kilkuset nukleotydów o 50% zawartości par GC

Wyspy te są markerami ekspresji genów - w [postaci hipermetylowanej powodują inaktywację regionu DNA

Metylacja umożliwia przekazywanie potomstwu profilu ekspresji genów

Dziedziczenie informacji nabytej!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!

Inaktywacja jednego chromosomu X

Imprinting genomowy

Regulacja ekspresji genów

Udział w karcinogenezie

Hipermetylacja promotorów genów surpresorowych wycisza ich ekspresję ( hipermetylacja dotyczy zwykle pojedynczych genów)

Hipometylacja promotorów protoonkogenów nasila ich ekspresję (hipometylacja dotyczy całego genomu)

Imprinting

profil ekspresji genów może być dziedziczony

Dziedziczenie jest niezależne od dziedziczenie mendlowskiego

Umożliwia ekspresję genu pochodzącego od jednego z rodziców (ekspresja monoalleliczna)

IGF-2 - od ojca

CDKN1C 0 od matki

Metylazy - enzymy przenoszczenia grup metylowych.

Wiele typów metylaz ulegających ekspresji na różnych stadiach rozw2oju

Główne znaczenie w czasie rozwoju embrionalnego

Wyłączenie ekspresji grup genów

Hamowanie aktywności transpozonów

Metylazy/demetylazy

Regulacja ekspresji

Metylazy DNMT - DNA methyltrasnferase

DNMT3A - 3b - METYLACJA DE NOVO

dnmt1 - UTRZYMANIE SANU METYLACJI (EKSPRESJA W ZRÓŻNICOWANYCH KOMÓRKACH)

Demetylazy

TET 0 ten-eleven translocaton)

Przekształcają 5mC w 5hmC

Dalej działa AID i powstaje 5-metylouracyl

5mU jest wycinany i zastępowany przez C

Kluczowe znaczenie w różnicowaniu komórek progenitorowych i macierzystych

Demetylacja DNA w czasie rozwoju

Demetylacja genowa (genome-wide)

Męski materiałów genetyczny zaraz po zapłodnieniu, na etapie zygoty

Komórka embrionalna na wczesnym etapie rozwoju

Demetylacja specyficzna dla loci

Mutageneza

MC jest wrażliwa na spontaniczna demetylację

Tworzą się nierozpoznawana przez system naprawczy tymina

W efekcie wyspy CpG ewolucyjnie zamieniają się na sekwencje

.....

Kontrola epigenetyczna

Badanie metylacji DNA

Metylowanie DNA jest obiecującym biomarkerem nowotworów

Ilość metylowanego DNA u osób z nowotworem jest wielokrotnie wyższa

Badanie stanu metylacji promotorów genów w płynach biologicznych

Surowica, płyn otrzewnowy

Geny: NIP3, RECK, CYP1B1

Histony:

Mogą podlegać modyfikacją

Modyfikacje histonów wpływają na strukturę chromatyny i ekspresję genów

...

Histony

Acetylacja HAT

Deacetylacja

HDAC

Równowaga jest utrzymywana poprzez równowagę pomiędzy tymi dwoma enzymami.

HAT, HDAC - przykłady działania

Różnicowanie komórek hematopoetycznych

AML1 lub RARz wiąże się z HAT

HAT acetyluje lizyny w histonach H3 i H4 tworząc luźną chromatynę

Łatwiejszy dostęp dla czynników transkrypcyjnych i nasilenie transkrypcji genów wywołujących różnicowanie komórki.

Hiperaktywacja HDAC, hipoaktywacja HAT

Supresja antyonkogenów

p53

RB1

RUNX3

Znaczenie w unikaniu apoptozy przez komórki nowotworowe

Terapia - przywrócenie równowagi pomiędzy HDAC i HAT

Inhibitory HDAC (HDI)

Psychiatria: kwas walproinowy, kwas nikotynowy nowe leki na choroby neurodegeneracyjne i ch. Alzhaimera

Onkologia: vorinostat, romidepsyna (Białaczka T-komórkowa)

Kwas walproinowy (rak szyjki macicy i jajnika)

Balinostar 0 rak jajnika)

Mocetinostat

Regulacja ekspresji

Wzmacniacze (nasilanie ekspresji genów)

Wyciszacze (hamowanie ekspresji genów)

Izolatory

Promotory

Czynniki transkrypcyjne

Wzmacniacze - występują od kilkuset do kilkuset tysięcy bp od wzmacnianego gnu

Niespecyficznie regulują aktywność transkrypcyjną genów lub fragmentów chromosomów

Lokalizacja względem wzmacnianego genu jest dowolna (mogą nawet stanowić jego fragment)

Wiążą się z miejscami wiążącymi na czynnikach transkrypcyjnych)

Wyciszacze

Podobne do wzmacniaczy

Wiążą czynniki transkrypcyjne

Hamują ekspresję genów

Izolatory

Problem transaktywacji ekspresji genów przez wzmacniacze

Krótkie fragmenty DNA

Zapobiegają aktywacji/inaktywacji genu przez wzmacniacz/wyciszacz innego genu

Mogą znajdować się przed promotorem lub między genami

Z izolatorem wiążą się białka CTCF zawierające 11 motywów palców cynkowych

CTCF jest wrażliwy na metylację rozpoznawanego motywu.

Izolatory przykłady

Allelospecyficzna ekspresja genu

IGF-2 i H19

W zależności od profilu metylacji ICR tworzą się pętle DNA o różnej strukturze

W efekcie dochodzi do wyłączenia genów

mRNA

mRNA - obróbka

Czapeczka - zwiększa stabilność RNA

HARPER OPISANE!!!!!!

mRNA - poliadenylacja - ogonki poli-A

mRNA - struktura

Region kodujący

Regiony niekodujące - 3'UTR i 5'UTR

5'UTR - występuje czapeczka, reguluje proces translacji

3'UTR - regulacja stabilności transkryptu

Lokalizacja subkomórkowa

Introny/egzony - po co

Introny występują wyłącznie u eukariontów

Poszczególne egzony kodują zazwyczaj odrębne domeny białkowe

Białka zbudowane z powtarzających się domen powstały w wyniku duplikacji/multiplikacji egzonów.

Egzony danego genu często są rekombinacją egzonów innych genów.

Splicing RNA

Geny eukariotyczne zawierają introny

Przed translacją muszą być one usunięte

Splicing- usuwanie ,,,,,

W wycinaniu intronów wykorzystywane jest kilka mechanizmów

Charakterystyczne sekwencje na granicy intron-egzon

Kompleksy małych jądrowych RNA (snRNA) i białek (snRNP)

U1RNP, U2RNP, U4/U6RNP, U5RNP

Ponad 100 różnych białek nie będących RNP

Introny:

Introny zwierają sekwencje konsensusowe umożliwiające identyfikację ich początków i końców

Rozpoczynają się od pary GU, po której następuje....

Introny mogą być wycinane same

Zwijanie się i przyjmowanie odpowiedniej konformacji

Autokataliza

Introny grup I i II

W wyniku autokatalizy uwalniają się raczej liniowe introny a nie lariaty (lassa)

Grupa I sef-splicing

Wewnętrzne sekwencje 5' naprowadzające gRNA określające miejsce ataku nukleofilowego

Sekwencje .........

Alternatywny splicing

Jeden gen może być matrycą dla wielu białek izoformy

Alternatywne wycinanie genów/intronów zależne od tkanki (tkankowo specyficzny)

Regulacja:

Aktywatory 0 ukierunkowanie splicingu w kierunku konkretnych egzonów i aktywują splicing

Represory odwrotnie

Aktywatory - ukierunkowują spliceosom w kierunku konkretnych egzonów aktywują splicing

Represory blokują miejsce splicingu

Istotne w niektórych chorobach gdyż powodują powstanie nowych epitopów, które biorą udział w chorobach autoimmunologicznych.

Aktywator

Białko SR

domena RRM wica si y RNA

hnRNPhnRNP I wiąże się z wyciszeniem w egzonie

hnRNPA aktywuje wiązanie kooperacyjne innych białek ukrywających miejsce wzmacniacza

Białko SC35SR nie może aktywować splicingu

Edycja RNA

Proces wymiany sekwencji RNA inny niż splicing prowadzący do powstania RNA o innej sekwencji ni matryca DNA

Odkryta w mitochondrialnych Trypanosoma

Występuje także w przypadku kilku genów u człowieka )np. APOB)

Proces zmiany inny niż splicing prowadzący do powstania RNA o innej sekwencji niż matryca DNA

odkryty w mitochondriach u trypanosoma

Edycja RNA

Umożliwia powstanie różnych produktów białkowych z tego samego genu

Umożliwia syntezę funkcjonalnego mRNA z pseudogenów

Czasami prowadzi do dużych zmian w mRNA

Dotyczy regionów kodujących, intronów (pre-mRNA) i regionów UTR

Może przywracać konserwatywne aminokwasy w białkach (kontrola nad mutacjami?)

Ochrona przed wirusami

Oksydaza cytochromowa C (CoxIII z trypanosoma brucei

Edycja RNA - mechanizm

Obróbka posttranslacyjna

Sterowana przez klasę guide RNA (gRNA

gRNA to małe cząsteczki RNA komplementarne do edytowanego mRNA

Niedokładne parowanie między gRNA a mRNA tworzy regiony rozpoznawane przez enzymy edytujące

w ich skład wchodzą:

Endonuklezay

terminalna transferaza urydylowa TUTaza

ligaza RNA

Edycja RNA

Świetnie poznana u bakterii i roślin

dotyczy co najmniej kilku genów u ssaków

Apoliproteina B (C->U) - deaminacja cytozyny

Receptory dla glutaminy B (A -> I (inozyna)

KUUUUUUUUUUUURRRWAAAAAAAAAA JAAAK ON ZAPIERDALA!!!!!!!

Wirus D zapalenia wątroby (A->I)

Paramyxovirusy (wstawienie G)

Edycja genu APOB

Edycja podlega C-U w egzonie mRNA

Powstaje kodon STOP

Zupełnie inna forma

Mechanizm edycji A na I

Udział deaminazy adenozyny zależnej od dsRNA

konwersja A->I w 2 egzonach genu receptora glutaminiowego B

Rozpoznawana jest struktura drugorzędowa dookoła miejsca edycji

...