ĆWICZENIE 1 – 09.10

1. Tytuł: Izolacja DNA z użyciem CTAB. Oznaczanie czystości.

cDNA jest bez intronów

hypokotyl to cz. podliścieniowa

sól chaotropowa hamuje RNazy

CTAB – bromek heksadecylotrimetyloamoniowy

Metoda z użyciem CTAB Murray’a i Thompsona z 1980

Bufor ekstrakcyjny:

• 2% CTAB – w dużym stężeniu soli! (dlatego dodawany 1,4M NaCl) tworzy trwałe, ciężkie kompleksy z polisacharydami, które zanieczyszczają próbki, pozostawiając czyste kw.nukl. Po wirowaniu b.ciężkie kompleksy opadają [ jak nie ma dużo soli to tworzy trwał kompleksy z kw. nukleinowymi]

• 1,4M NaCl – wysokie st. dla CTAB

• 100M Tris-HCl pH 8.0 – bufor zapewnia stałe, lekko zasadowe pH, co zmniejsza oddziaływania elektrostatyczne między DNA i zasadowymi białkami

• 20mM EDTA – wiąże jony metali: Cd, Mg, Mn, które mogłyby stworzyć sole z anionowymi grupami fosforanowymi oraz hamuje działanie deoksyrybonukleaz (DNaza, RNaza), które niszczą kw. nukl. i potrzebują jonów Cd, Mg, Mn do aktywności. Ogólnie chronią DNA przed uszkodzeniami

• chloroform – odbiałcza (powierzchniowa denaturacja białek)

• izopropanol – powoduje wytrącenie kw. nukleinowych z r-ru

• 70% etanol – odbiałcza; żeby doczyścić

• 0.5% beta-merkaptoetanol [tuż przed ucieraniem] – utrzymuje warunki redukcji (uniemożliwia oksydację białek)

Zasady absorbują promieniowanie niezależnie czy są całe czy poszarpane, więc nie można ocenić jakości DNA (tylko ilość)

260/280 to zanieczyszczenie białkami (ew. RNA, bo uracyl absorbuje więcej?) [norma: 1,8-2,0]

260/230 to zanieczyszczenie polifenolami, polisacharydami, solami chaotropowymi [norma: 1,8-2,2]

Nazwiska:

• Wilkins (N) – wykradł zdjęcie

• R. Franklin – pierwsze zdjęcie

• Gosling

• Watson (N) & Crick (N)

Publikacja w Nature w 1953r.

Nobel w 1962r.

ĆWICZENIE 2 – 16.10

1. Tytuł: Izolacja całkowitego RNA z użyciem odczynnika TRI-Reagent (Sigma). Oznaczanie czystości i jakości

Piotr Chomczyński opublikował odkrycie w 1987r.

Skład TRI-Reagent:

• izotiocyjanian guanidyny (sól chaotropowa)

• Fenol

DEPC (dietylopirokarbonian) – inhibitor RNAzy

Fazy!:

- górna, biała zawierająca RNA

- środkowa cienka z DNA?

- dolna, duża z białkami

ĆWICZENIE 3 – 23.10

1. Tytuł: Synteza cDNA (otrzymanego z liścieni 2) na matrycy mRNA (odwrotna transkrypcja)

to reakcja syntezy mRNA na cDNA.

mRNA koduje białko. Od innych różni się ‘czapeczką’ i ‘ogonkiem’ (chroniącymi przed RNAzami!)

5’ D AAAAA(200-300) 3’

czapeczka ma dodatkową resztę metylazę, której restryktaza nie rozpoznaje

Proces odwrotnej transkrypcji zachodzi w naturze, np. w cyklu życiowym wirusa HIV, czy w wydłużaniu telomerów.

W laboratorium wykorzystywane są enzymy rekombinowane, będące pochodnymi rewertazy (odwr. transkryptazy) wirusów białaczkowych:

• mysi (MLV – Murine Leukemia Virus)

• ptasi (AMV – Avian Myeoblastsis Virus)

• ludzki (HIV)

Odwrotna transkryptaza syntetyzuje nić DNA zgodnie z zasada kompl. wbudowując tymidylan (dTTP) zamiast obecnego w RNA urydulanu (UTP).

Odczynniki do reakcji RT

1. Enzym RT

2. Bufor z odpowiednimi jonami

3. Startery:

- typu random/ mieszanina heksametrów - 6-cio nukleotydowe odcinki jednoniciowego DNA o każdej możliwej sekwencji (4096 różnych oligomerów), którym można „przepisać” całe RNA w kom.: RRNA, tRNA oraz mRNA

- oligo(dT) – oligomery tymidylanu (wybiórcze „przepisanie” tylko mRNA); jest skompresowany z samych tymin [18-25], które przyłączają się do ogonka poli(A) bo są komplementarne

- lub starter specyficzny dla genu (jak przepisujemy jeden duzy gen

1. Mieszanina deoksynukleotydów (dNTPs)

2. Ultra czysta woda (wolna od RNaz)

Nazwiska:

• Baltimore

• Dulbecco

• Temin

Wszyscy trzej Nobel za odkrycie odwrotnej transkryptazy w 1975r. Byli onkologami; badania w dziedzinie wirusów onkogennych

RNA często tworzy struktury II-rzędowe, dlatego przed rozpoczęciem reakcji wykonujemy denaturację w 65°C

1. Tytuł: Elektroforeza DNA i RNA w żelu agarozowym

1.5-1.8% żel agarozowy = 0.8g agarozy + 100ml buforu TBE

500ng DNA mieszamy z równoważną obj. buforu SB (obciążnik złożony z bromofelonu blue i glicerolu) i do kieszonek → 20-30 min. → żel do bromku etydyny (interkaluje między pary zasad powodując intensywna fluorescencję w świetle UV)

Bufory do elektroforezy:

• TBE (Tris pH 8.3, kw. octowy, EDTA)

• TAE (Tris, kw. borowy, EDTA)

• MOPS (MOPS – kwas 3-(n-morfolino)propanosulfonowy i EDTA)

Kw. nukleinowe mają ładunek ujemny przez reszty fosforanowe.

Barwnik z brązowego robi się niebieski po włożeniu do kieszonki bo bufor do elektroforezy ma pH zasadowe

W RNA: na samej górze podjednostki 28S, niżej 18S

PCR

Nazwiska:

• 1971r. Khoran i Kleppe opisali enzymatyczna metodę replikacji krótkich fragmentów DNA z użyciem starterów w Journal of Molecular Biology

• 1976r. odkryto termostabilną polimerazę Taq (syntetyzowanej na bakteriach Thermus aquaticus) (jest w stanie przetrwać tylko cykle wysokiej temp.)

• Kary Mullins w 1983r. wynalazł PCR (dostał Nobla w 1993r. razem z Michaelem Smithem, który też nad tym pracował)

Dla PCR 2 startery: przedni i tylny

Składniki reakcji PCR:

• polimeraza DNA

• dNTP (deoksyrybonukleotydy: A, T, C, G)

• bufor (odpowiednie pH: 7,0-9,0 z jonami Mg²⁺- bo magnez tworzy kompleksy z rybosomami, a polimeraza je rozpoznaje)

• starter forward

• starter reverse

• matryca DNA (coś co ma być powielone)

• woda Miliq

Etapy reakcji PCR:

1. Denaturacja (94-98°C) 30s. – rozdzielenie nici 5’ 3’ st. reverse

polimeraza syntetyzuje nową nić od 5’ do 3’ st. forward 3’ 5’

1. ANN, annealing, (temp. 50-60°C specyficzna dla startera) 30s.– przyłączenie starterów

Wzór na temp. startera: 4 (G+C) + 2(A+T)

1. Elongacja (72-74°C, optymalna dla polimerazy) – zależy od dł. fragmentu i od enzymu

1 minuta na 1000 nukleotydów, żeby spokojnie wydłużyć te miliony matryc

Powtarzamy to 20-40 razy.

Można tez zrobić wstępną denaturację (2-5 min.) i końcową elongację (10-15 min.)

1. Tytuł: Amplifikacja genu MTP12 na matrycy DNA

MTP – metal tolerance protein

Używamy polimetazy Marathon, która jest mieszaniną polimerazy Pwo i Taq oraz termostabilnej dUTP-azy.

- Pwo – oczyszczona z E.coli, niosącego plazmid z wklonowanym genem archeona Pyrococcus woesei; ma aktywność egzonukleazy (korekcyjna); katalizuje dołączenie od końca 3’; produkty polimeryzacji Pwo posiadają tępe końce

- Taq – termostabilna w temp. 37-94°C; ma aktywność egzonukleazy 5’-3’, ale nie ma 3’-5’, czyli tej naprawczej (popełnia dużo błędów); wymaga 1-niciowej matrycy i startera

Warunki reakcji w termocyklerze:

1. Wstępna denaturacja - 94°C - 5 min

2. Krótka denaturacja - 94°C - 30s

3. Przyłączenie starterów (annealing) - 50-60°C - 30s

4. Elongacja - 68°C - 1min/1kB

5. Końcowa elongacja/ wydłużanie - 68°C - 10 min

6. 4-12°C HOLD (temp. przechowywania próbek po zakończonej reakcji)

Kroki 2-4 są powtarzane/ amplifikowane 20-40 razy, zależnie od ilości matrycy użytej do reakcji PCR

1. Tytuł: Amplifikacja genu MTP7 na matrycy cDNA (otrzymanego z liścieni 2)

Używamy polimetazy Phusion (najszybsza i najwierniejsza dla cDNA)

- szybka i dokładna nawet w trudnych matrycach, tj. wysyconymi parami GC lub tworzącymi struktury II-rzędowe

- wprowadzona dodatkowa domena wiążąca dwuniciowe DNA, skutkuje ↑ tworzenia kompleksów enzym-dsDNA, a w konsekwencji ↑ szybkości wstawiania nukleotydów

- najniższy współczynnik błędu

Warunki reakcji w termocyklerze:

1) Wstępna denaturacja - 98°C - 2 min

2) Krótka denaturacja - 98°C - 15s

3) Przyłączenie starterów (annealing) - 50-60°C - 30s

4) Elongacja - 72°C - 1min/1kB

5) Końcowa elongacja/ wydłużanie - 72°C - 10 min

6) 4-12°C HOLD (temp. przechowywania próbek po zakończonej reakcji)

Kroki 2-4 są powtarzane/ amplifikowane 40 razy.

ĆWICZENIE 4 – 06.11

1. Tytuł: Elektroforeza produktów PCR otrzymanych na matrycach DNA i cDNA w żelu agarozowym

2. Tytuł: Tranformacja bakterii kompetentnych

Transformacja – zmiana genetyczna w kom., poprzez bezpośrednie pobranie przez błonę kom., zewnętrznego DNA i wbudowania go we własny genom. Komórki musza być w stanie kompetencji.

Nazwiska:

• F.Griffith w 1982r. odkrył, że niewirulentny szczep Streptococcus pneumoniae może stać się wirulentny, jeśli wejdzie w kontakt z nieżywymi (zabitymi przez wysoką temp.) kom. szczepu wirulentnego.

• Oswald Avery, Colin MacLeod, Maclyn McCarthy w 1944r. zidentyfikowali “czynnik transformujący”, czyli DNA.

2 metody:

1. Elektroporacja (traktowanie prądem)

2. Termiczna (heat-shock)

ori – miejsca replikacji bakterii; miejsca cięcia przez enzymy restrykcyjne

MET25-P – promotor, który jest nieaktywny jak jest metionina

yEGFP3 – gen kodujący białko fluorescencji

CYC1-T – terminator transkrypcji, kończy przepisywanie

1. Tytuł: Transformacja drożdży kompetentnych

URA3 – gen umożliwiający syntezę uracylu

AmpR – gen warunkujący odporność na ampicylinę

CEN6/ARSH4 – fragment centromeru drożdżowego umożliwia replikacje plazmidu

DNA łososia ułatwia wiązanie plazmidu do drożdży