TWÓJ BIOTECHNOLOG https://www.facebook.com/twoj.biotechnolog

Student chciał zamplifikować fragment DNA o długości 1873 par zasad. W tym celu zaprojektował i zamówił startery: Star1 i Star2, które dołączają do amplifikowanej sekwencji miejsca restrykcyjne: BamHI i HindIII (sekwencje starterów podano poniżej, małymi literami zaznaczono fragment hybrydyzujący z matrycą). Zostały one dostarczone w formie zliofilizowanej i rozpuszczone w takiej ilości buforu TE, że stężenie każdego z nich wynosiło 100 μM. Matrycą do amplifikacji był plazmid pQE-80L_Stm o stężeniu 3 μg/μl. Do amplifikacji student postanowił wykorzystać polimerazę Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England BioLabs). Po dokładnym zapoznaniu się z ulotką i zaleceniami producenta dobrał warunki reakcji i program PCR. Następnie przeprowadził reakcję i wykonał elektroforezę analityczną uzyskanych produktów (Rysunek 1):

Tabela 1 Sekwencje starterów

Nazwa	Sekwencja
Star1	GCG CGG GGA TCC aag act tgt atc aac atg aga ctt gg
Star2	GCG CGG AAG CTT atg ttt ata gcg caa cta tag gc

GGATCC – BamHI

AAGCTT – HindIII

Rysunek 1 Elektroforeza agarozowa produktów PCR.
M-marker wagowy, K- kontrola, PCR - mieszanina po rekcji PCR.

1. Zinterpretuj uzyskany przez studenta wynik doświadczenia? Czy jest on poprawny, a jeżeli nie, jakie mogą być prawdopodobne przyczyny takiego wyniku?

2. Pomóż studentowi i zaproponuj warunki reakcji (skład mieszanin reakcyjnych), odpowiednią kontrolę oraz program reakcji PCR dla przedstawionych powyżej danych. Pamiętaj, że wszystkie odczynniki możesz przed użyciem rozcieńczyć, tak, aby uzyskać wygodne do użytku stężenia (w takim przypadku proszę napisać sposób przygotowania rozcieńczeń). Jeżeli stężenie jakiegoś odczynnika nie jest podane można założyć dowolne, jednak proszę podać jakie.