Mikrobiologia Ćw.9

Oznaczanie wrażliwości bakterii na chemioterapeutyki, barwniki i fitoncydy.

Oznaczanie liczby bakterii metodą Kocha i McFarlanda.

Ogólne badanie biologiczne wody.

Badanie wrażliwości bakterii na chemioterapeutyki - antybiogram:

Antybiogram - opis danego zarazka na działanie określonych chemioterapeutyków.

Podstawa racjonalnej chemioterapii - określanie wrażliwości badanego zarazka na dostępne leki i użycie takiego z nich, który w najmniejszej dawce, daje najlepszy efekt oraz wykazuje możliwie wąskie spektrum działania.

Metody - określanie wrażliwości drobnoustrojów na chemioterapeutyki:

- rozcieńczeń probówkowych

- dodawanie leku do pożywki

- dyfuzyjno-krążkowa

Metoda dyfuzyjno-krążkowa:

- określenie na podłożu stałym wielkości strefy zahamowania wzrostu badanego zarazka dookoła ułożonych na
podłożu krążków bibułowych nasyconych znaną ilością danego chemioterapeutyku

- strefy zahamowania są z reguły proporcjonalne do wrażliwości danego mikroorganizmu na określony
chemioterapeutyk - im bardziej wrażliwy zarazek, tym większa strefa hamowania

- badanie przeprowadzamy na podłożu Mueller-Hintona

- krążki bibułowe zawierające odpowiednie antybiotyki, odpowiednio oznaczone i jałowe, nabywane są u
producenta.

Wykonanie próby:

- na płytkę Petriego (10 cm średnicy) wylewamy 30 cm³ podłoża

- przed posiewem płytki podduszamy przez 30 min. w cieplarce (37°C)

- na środek podłoża nanosimy kroplę odpowiednio rozcieńczonej zawiesiny badanego drobnoustroju (4 skala
McFarlanda) i jałową bagietką szklaną rozprowadzamy po całej powierzchni podłoża

- wyjałowionymi szczypczykami układamy na podłożu krążki bibułowe

- odległość między krążkami powinna wynosić nie mniej niż 2 cm

- płytki wstawiamy do cieplarki - chemioterapeutyki dyfundują do podłoża i hamują w większym lub mniejszym
stopniu wzrost posianego zarazka - powstają wokół krążków strefy zahamowania wzrostu bakterii.

- czas inkubacji - 12-18h (za długa inkubacja - inaktywowanie się leku - wtórne wzrosty, zbyt krótka inkubacja -
niedostateczna dyfuzja)

- odczytanie wyniku polega na zmierzeniu średnicy stref zahamowania wzrostu

- wielkość stref zahamowania wzrostu, będąca podstawą do określenia stopnia wrażliwości zarazka (wrażliwy, słabo
wrażliwy, oporny), jest różna dla poszczególnych chemioterapeutyków i określona przez producenta krążków

- konieczne jest wykonanie badania kontrolnego z odpowiednim szczepem wzorcowym bakterii (brak stref
zahamowania wzrostu - świadczy o inaktywowaniu się chemioterapeutyku w krążku i jego nieprzydatności).

Wrażliwość bakterii na barwniki:

- niektóre barwniki - fiolet krystaliczny, błękit metylenowy, zieleń brylantowa, fuksyna zasadowa mogą wywierać
hamujący wpływ na wzrost drobnoustrojów

- działają bakteriostatycznie (hamują namnażanie), a w większych stężeniach bakteriobójczo (śmierć bakterii)

- wykorzystanie praktyczne barwników :

• Do sporządzania podłoży wybiórczych (fiolet krystaliczny hamuje wzrost bakterii G+ i stwarza warunki do namnożenia bakterii G-)

• Roztwory niektórych barwników znajdują zastosowanie jako leki przeciwbakteryjne do stosowania miejscowego (pioktanina, błękit metylenowy, zieleń brylantowa)

• Najsilniej antyseptycznie działają pochodne akrydynowe, np. rywanol, proflawina

Wrażliwość bakterii na fitoncydy:

- fitoncydy - lotne związki o charakterze olejków eterycznych, różnorodne pod względem chemicznym, antybiotyki wyższych roślin o działaniu bakterio-, grzybo- i pierwotniakobójczym

- fitoncydy występują w takich roślinach jak: czosnek, cebula i chrzan. Związki zawarte w czosnku mają największe
znaczenie i najsilniej działają: są zabójcze dla drobnoustrojów G+ i G-, a także dla antybiotykoodpornych
drobnoustrojów występujących w jelitach podczas biegunki u dzieci

Badanie ilościowe:

Nie stanowi elementu toku rozpoznawczego!!!!

Cel oznaczania liczby bakterii:

- ocena stopnia zanieczyszczenia bakteryjnego badanej próby (np. produktu spożywczego)

- oznaczanie gęstości zawiesiny bakterii w trakcie produkcji szczepionek, antygenów diagnostycznych itp.

Oznaczamy:

- całkowitą liczbę bakterii żywych i martwych

• Metody bezpośrednie

• Metody pośrednie

- całkowitą liczbę bakterii żywych

Metody bezpośrednie:

- liczenie w badanym preparacie mikroskopowym znanej objętości zawiesiny bakteryjnej

- liczenie bakterii w specjalnych komorach, np. do liczenia krwinek

Metody pośrednie:

- metoda Wrighta - po zmieszaniu równych objętości zawiesiny bakteryjnej i krwinek, np. psa, sporządzamy preparat
i oznaczamy ich stosunek ilościowy (jeśli w polu widzenia mikroskopu przypadły średnio na jeden erytrocyt 3
bakterie, to liczba bakterii wynosi ok. 18 mln/ml [3x6 - średnia liczba erytrocytów w 1 ml krwi psa])

- metoda McFarlanda (Nefelometria) - porównywanie zmętnienia zawiesiny bakteryjnej ze zmętnieniem
odpowiedniego standardu - skalą McFarlanda, odpowiadającym widocznej liczbie bakterii. Skala składa się z
szeregu 10 probówek o różnym zmętnieniu siarczanu baru odpowiadającemu określonej liczbie komórek bakterii
Serratia marcescens.

Metoda płytkowa Kocha:

Metoda oznaczania całkowitej liczby bakterii żywych.

Założenie: każda żywa bakteria wytwarza na podłożu stałym jedną kolonię!!!

Oznaczanie rozpoczynamy od sporządzenia rozcieńczeń - do szeregu probówek rozlewamy po 8 ml NaCl i do pierwszej wprowadzamy pipetą 1 ml badanej zawiesiny. Następnie świeżą pipetą mieszamy zawartość tej probówki przez 3-krotnie zassanie i wydmuchanie. Otrzymujemy rozcieńczenie 1:10, którego 1 ml przenosimy do następnej probówki. Zmieniamy pipetę, mieszamy i otrzymujemy rozcieńczenie 1:100. Postępując analogicznie z dalszymi probówkami uzyskujemy rozcieńczenie 1:1000, 1:10 000.

Metoda płytkowa Kocha:

Z przygotowanych 10-krotnie wzrastających rozcieńczeń badanego materiału wysiewamy zaczynając od najwyższego po 0,1 ml na dwie płytki i rozprowadzamy po powierzchni agaru wyjałowioną bagietką szklaną. Po inkubacji liczymy wyrosłe na pożywce kolonie. Do liczenia nadają się najlepiej płytki zawierające najmniej 30 kolonii.

Przykład: przy wysiewie 0,1 ml zawiesiny rozcieńczonej 1:10 000 uzyskano na jednej płytce wzrost 50, na drugiej 54, czyli średnio 52 kolonie. Jeden mililitr nierozcieńczonej zawiesiny 10 000 razy więcej, czyli 5200 000 bakterii (10^6,7 - 6 to cecha [ilość cyfr w danej liczbie minus 1], 7 to mantysa wskazuje liczbę).

Oznaczanie miana drobnoustrojów:

- miano - najmniejsza ilość lub największe rozcieńczenie badanej próby, w której stwierdza się jeszcze obecność
określonych bakterii (np. pałeczek okrężnicy - tzw. miano coli)

- metoda polega na sporządzeniu 10-krotnie wzrastających rozcieńczeń próby i wysianiu ich łącznie z
nierozcieńczoną próbą, na podłoża płynne, wybiórczo-różnicujące, zawierające substraty, których rozkład wyraża się
zmianą zabarwienia podłoża. Najwyższe rozcieńczenie, w którym nastąpił wzrost badanego drobnoustroju -
ostatnia probówka w rzędzie ze zmianą barwy, określa miano próby

- metoda często stosowania w mikrobiologii żywności do oceny mikrobiologicznej niektórych artykułów
spożywczych. Jeśli w badanym produkcie (np. wodzie pitnej, napojach) liczba określonych bakterii przekroczy
dopuszczalną normę - nieprzydatny do spożycia.

Badanie bakteriologiczne wody:

- źródłem zanieczyszczeń bakteryjnych wody są przeważnie ścieki zawierające odchody ludzkie i zwierząt. Ze względu
na to, że E.coli jest stałym składnikiem mikroflory jelitowej, przyjęto jej obecność w wodzie za wskaźnik
zanieczyszczeń

- rutynowo stosowane są dwie podstawowe metody:

• Metoda filtrów membranowych (FM):

Odpowiednią objętość wody (100, 10, 1 lub 0,1) sączymy przez filtry membranowe zatrzymujące bakterie i nakładamy je, bakteriami do góry, na płytkę Endo, a po inkubacji (22 h) w temperaturze 37°C liczymy kolonie grupy E. coli (ciemnoczerwone zabarwienie i metaliczny połysk). Obliczamy WSKAŹNIK COLI - liczba bakterii grupy coli w 100 ml badanej wody:

Liczba typowych kolonii x 100 / ilość ml filtrowanej wody

• Metoda fermentacyjno-probówkowa (FP):

Polega na powiewie odpowiedniej objętości wody (50, 10, 1 lub 0,1 ml) do płynnego podłoża zawierającego laktozę. Wynik dodatni świadczący o obecności E.coli w badanej objętości uwidacznia się po 24-48 h inkubacji w temperaturze 37°C silnym zakwaszeniem podłoża i powstaniem gazu w rurce fermentacyjnej. Końcowy wynik badania przedstawiamy w postaci miana i odpowiadającej mu Najbardziej Prawdopodobnej Liczby (NPL) bakterii w 100 ml.

Normy dla obu wskaźników odczytuje się ze specjalnych tablic.

1

---