Temat 9 :
Transformacja genów do komórek bakterii metodą trójrodzicielskiej koniugacji.
1. Cel ćwiczenia.
Zapoznanie studentów z metodami wprowadzania genów do mikroorganizmów.
2. Zakres ćwiczenia.
Wprowadzenie genu gfp (ang. green fluorescent protein) do wybranych bakterii metodą trójrodzicielskiej koniugacji.
3. Cześć teoretyczna.
Transformacja jest procesem, w którym informacja genetyczna jest przekazywana do biorcy bez kontaktu komórek lub bez pośrednictwa faga. DNA wyizolowany z komórek dawcy jest aktywnie pobierany przez komórki biorcy . Wejście DNA do komórki biorcy zachodzi prawdopodobnie w odpowiednich miejscach.
Wysoką aktywność transformująca wykazuje DNA natywny dwuniciowy. Jednoniciowy albo zdenaturowany DNA jest mało aktywny w transformacji.
Wymiana odcinków DNA i replikacja prowadzi do powstania komórek transformantów o nowych właściwościach . Wydajność transformancji zależy od stężenia DNA i od kompetencji komórek biorcy. Stan kompetencji polega prawdopodobnie na wytwarzaniu białkowego czynnika kompetencji .
DNA w preparatach używanych do transformacji występuje zwykle we fragmentach około 1/200 długości chromosomu.
Wydajność transformacji jest to liczba powstałych kolonii bakterii opornych na antybiotyk uzyskana podczas transformacji bakterii 1 mikrogramem plazmidu.
Bakterie które przyjęły plazmid są selekcjonowane na pożywce zawierającej antybiotyk. Jest to możliwe , ponieważ w wektorze znajduje się gen nadający bakteriom oporność na zastosowany antybiotyk.
4. Wykonanie doświadczenia
Zadanie nr 1: Przygotowanie podłoża LB.
Odważamy na wadze analitycznej do kolby miarowej odpowiednio :
NaCl - 1g
Wyciąg drożdżowy - 0,5g
Tripton - 1g
Agar - 3g.
Uzupełniamy do 100 ml wodą destylowana , mieszamy i jałowymi podłoże przez 20 minut w szybkowarze. O wyjałowieniu rozlewamy po 20 ml jałowego podłoża na płytki Petriego, czekamy około 20 minut do zestalenia podłoża po czym podłoże suszymy w cieplarce w temp. 55°C przez ok. . 30 minut.
Zadanie 2 : Wykonanie koniugacji.
Mikropipetą pobieramy po 200 μl z całonocnych bulionowych hodowli dawcy , biorcy oraz szczepu E. coli RK600 z plazmidem pomocniczym , przenosimy do jałowych probówek typu Eppendorf i dodajemy 1 ml 0,9 % NaCl następnie wirujemy przez około 5 minut przy obrotach 134 tyś. Na minutę . Po odwirowaniu zlewamy supernatant i ponownie dodajemy 1 ml 0,9% NaCl, wirujemy i zlewamy supernatant, znów dodajemy 0,9 ml NaCl i przepipetowujemy. Następnie za pomocą pipety automatycznej pobieramy o 30 μl dawcy, biorcy oraz szczepu E. coli RK600 z plazmidem pomocniczym i mieszamy w jałowej probówce typu Eppendorf. Z mieszaniny tej pobieramy 50 μl zawiesiny i jako kropla przenosimy na płytkę Petriego z podłożem LB, pozostawiamy do wyschnięcia kropli. Podłoże inkubujemy przez 24 godziny w temp. 37°C.
Temat 10 :
Analiza transformantów Escherichia coli MM294 z genem gfp.
Cel ćwiczenia.
Zapoznanie studentów z zastosowaniem konwencjonalnych i nowoczesnych technik analizy bakteryjnych transformantów.
2. Zakres ćwiczenia.
Wykonanie analizy stabilności i wydajności transformancji szczepu E. coli MM294 genem gfp.
3. Wykonanie doświadczenia.
Zadanie nr 1: Przygotowanie podłoża selekcyjnego
Kolejno odważamy na 1000 ml podłoża :
1,44 g Na2HPO4
0,24 g KH2PO4
0,2 g KCl
10 g laktozy
10 g agaru
dopełniamy do 1000 ml woda destylowaną i jałowimy 15 min w szybkowarze.
Każda z grup musi przygotować 100 ml podłoża przeliczając odpowiednio.
Każda z grup przygotowuje 5 płytek Petriego dodając 19 ml podłoża selekcyjnego i 1 ml roztworu namycyny ciągle mieszając , czekamy do zestalenia podłoża następnie podłoże suszymy przez 15 min. w cieplarce.
Zadanie 2 :Przygotowanie hodowli bakteryjnej .
wyrosłą na podłożu LB hodowle zbieramy opalona ezą mikrobiologiczna i przenosimy do probówki nr 1 z jałowym 0,85% NaCl
próbówkę intensywnie mieszamy i 1 ml mieszaniny przenosimy do probówki nr 2 , intensywnie mieszamy
z probówki nr 2 przenosimy 1 ml mieszaniny przenosimy do probówki nr 3 , intensywnie mieszamy
z probówki nr 3 pobieramy 0,1 ml i nanosimy na wcześniej przygotowane podłoże selekcyjne w stężeniu 50 μg/ml i wcieramy w podłoże jałową bagietką
wstawiamy do inkubacji w temp 37°C na 7 dni , po czym wyrosłe kolonie wykazujące w świetle UV zielona fluorescencje przesiewamy na podłoże LB z antybiotykiem , którego gen oporności jest zakodowany na transformowanym plazmidzie.
WYNIKI I WNIOSKI.