I. Struktura i funkcja kwasów nukleinowych
Zasady purynowe i pirymidynowe- Purynowe-pochodne puryny, złożone z 2 sprzężonych pierścieni węglowo-azotowych: adenina i guanina różnią się bocznymi ugrupowaniami. Pirymidynowe- tymina i cytozyna, zawierają pojedynczy pierścień węglowo-azotowy, różnią się bocznymi gr.
Nukleozyd= zasada (A/G/T/C)+cukier (deoksyryboza/ryboza)[wiąz kowalencyjne]. W DNA zwane (deoksy)rybonukleozydami: (deoksy)-adenozyna/-guanozyna /-tymidyna/-cytydyna.
Nukleotyd=fosforanowy ester nukleozydu=zasada+cukier(deoksyryboza)+fosforan [wiąz. kowalencyjne]. Składa się z reszty fosforanowej poł.z gr.hydroksylową nukleozydu związ. z C5 (nukleozydo-5'-fosforany). Grupa fosforanowa może być pojedyncza, podwójna/ potrójna. W DNA są trifosforany nukleozydów. Atom C z cukru tworzy wiąz glikozydowi z zasadą
Wiązania nukleotydów: nukleotydy są poł. między sobą wiąz. kowalencyjnymi między fosforanami i cząst. cukru. Fosforan połączony z gr.5'-hydroksylową jednego łączy się z gr.3'-hydroksylową poprzedniego nukleotydu- wiąz. to nazywane jest 3',5'-fosfodiestrowym (estrowe). Każdy łańcuch DNA wykazuje polarnośc
DNA/RNA: cukier: deoksyryboza/ryboza, zas.azotowa: tymina/uracyl; cząsteczka: dwuniciowa helisa/jednoniciowa; wielkość cząst: b.duże/ mniejsze.
Komplementarność w DNA: tworzenie komplementarnych par zasad: większa zasada purynowa tworzy parę z mniejszą-pirymidynową. Pary te idealnie pasują do odległości pomiędzy łańcuchami cukrowo-fosforanowymi i decydują o utrzymaniu poprawnej odległości między nimi. Pomiędzy komplementarnymi zasadami tworzy się max. Liczba wiązań wodorowych (A=T 2 wiązania; G≡C 3 wiąz.).
Reguła Chargraffa: DNA zbudowane jest z dwóch łańcuchów polinukleotydowych, w których suma zasad purynowych równa się sumie ilości zasad pirymidynowych; ilości molowe adeniny są równe ilościom molowym tyminy a ilości molowe guaniny są równe ilości molowej cytozyny.
Wiąz. i oddziaływania: wodorowe, 3'5'-fosfodiestrowe, n-glikozydowe.
Polarność DNA: Fosforan połączony z gr.5'-hydroksylową jednego łączy się z gr.3'-hydroksylową poprzedniego nukleotydu-wiąz.to nazywane jest 3',5'-fosfodiestrowym (estrowe). Każdy łańcuch DNA wykazuje polarność- jego koniec 5' jest odmienny od końca 3'.
Lokalizacja DNA- w jądrze kom. liniowe cząst.DNA wyst. w formie kompleksów z białkami w chromosomach; w mitochondriach-koliste/ liniowe cząst.; u roślin i cz.protistów w chloroplastach.
Nukleosomy- sposób upakowania; DNA oplatające histonowy oktamer 2x(H2A, H2B, H3, H4). (silnie zasadowe białka, zaw.dużo argininy i lizyny). DNA znajdujący się pomiędzy sąsiednimi nukleosomami związ.jest z histonem H1, które umocowuje spiralę na rdzeniu białkowym. Solenoid-helikalna forma włókna nukleosomowego.
Chromatyna-jądrowy kompleks DNA i białek histonowych, występuje w okresie międzypodziałowym jądra (interfaza); rozluźniony chromosom. Włókno nukleosomoew (chromatynowe) skręcone w ścisłą spiralę, tworzy wielkie pętle urzymane razem przez zestaw białek niehistonowych (macierzy jądrowej).
Wyróżnia się dwie formy chromatyny: heterochromatyna (postać silnie barwiąca się barwnikami zasadowymi; silnie skondensowana, nieaktywna chemicznie) i euchromatyna (słabo barwiąca się, w formie zdekondensowanej-aktywna chem. i skondensowanej). Chromatyna barwi się selektywnie barwnikami zasadowymi, dzięki czemu możliwe jest śledzenie struktury chromosomów w poszczególnych stadiach podziału jądra komórkowego.
Funkcje DNA- przekazywanie inf.genet. organizmom potomnym; kieruje metabolizmem, steruje syntezą białka, warunkuje zjawisko dziedziczenia.
Rodzaje RNA: pre-mRNA, mRNA, tRNA, rRNA.
Pre-mRNA-mRNA przed usunięciem intronów (splicing) i połączeniem samych eksonów.
mRNA- informacyjny, 5-10% ogólnego RNA, zaw. przepisaną z genów, zakodowaną informację genetyczną o sekwencji poszczególnych białek. Syntetyzowane, gdy potrzebne do kierowania biosyntezą białek, potem rozkładany enzymatycznie. Przyłącza się do rybosomów- stanowi matrycę do zachodzenia translacji.
rRNA- rybosomowy, Funk strukturalna- 60-65% masy rybosomy. Biorą udział w procesie biosyntezy polipeptydów; powst. w procesie transkrypcji DNA. U eukariotów za jego transkrypcję odpowiada polimeraza RNA I. Występuje w rybosomach, u eukariontów także w jądrze kom. (w jąderku odbywa się jego synteza). Struktura przestrzenna b. rozbudowana, (100-4500 nukleotydów); stanowi ok. 80% całkowitego RNA komórki.
tRNA- transportujący - cząst.kw. rybonukleinowego, Funk:transport wolnych AA z cytoplazmy do rybosomów, gdzie podczas translacji zostają włączone do powst. łańcucha polipep. Wysoka specyficzność w stos. do AA. Cząst. tRNA występują w komórkach w stanie wolnym/ związane ze specyficznym AA. Kompleks tRNA-aminokwas nosi nazwę aminoacylo-tRNA.
mRNA prokariota-brak intronów; 1 promotor może poprzedzać kilka genów; policistronowe; sekwencja Sine-Dalgrano przed promotorem. u eukariota- egzony kodujące i niekodujące introny; 1 promotor przed 1 genem; monocistronowe; kasteta TATA (-25pz przed promotorem)
II. Replikacja- biosynteza DNA
1)rozdzielenie dwóch nici DNA i zabezpieczenie pojedynczej, która jest atakowana przez nukleazy
2)synteza DNA w kier.5'3'
3)zabezpieczenie przed błędami replikacji
Proces poprzedzony jest przez dekondensację chromatyny do luźnych fibryli chromatynowych.
Zachodzi w fazie S cyklu kom. Jądrowy DNA replikowany jest kompletnie i tylko raz.
ORI-miejsce inicjacji replikacji. Nowe łańcuchy syntetyzowane na obu niciach (matrycach). Dla każdego początku replikacji tworzą się 2 miejsca (widełki replikacyjne), w których tworzone są nici. Przesuwanie się widełek w dwóch przeciwnych kierunkach powoduje powst. „oczka” nowo syntetyzowanego DNA miedzy nimi. „Oczka” powiększają się, łączą i dają 2 kompletne, oddzielne, siostrzane cz.DNA.
Jedna z nowo tworzonych nici- wiodąca-tworzona nieprzerwanie od jej końca 5'3', na eksponowanej 3'5' matrycy. Opóźniona nić formowana jest we fragmentach (f. Okazaki), któch koniec 5' jest bliżej widełek niż 3', następnie, w całość łączy je ligaza DNA. Reakcję przyłączania nowych nukleotydów kat. polimeraza DNA. Proces wymaga obecności startera- krótkiej nici RNA (prymaza), której wydłużający się łańcuch jest przyłączony kowalencyjnie w początkowych etapach replikacji.
Semikonserwatywna replikacja DNA- samopowielenie DNA na matrycy- istniejącej cz.DNA, zachodzi przy udziale enzymu-polimerazy DNA, rozplatającej i rozrywającej podwójną helisę DNA; do każdej pojedynczej nici dobudowywana jest na zasadzie komplementarności zas.nukleinowych druga nić. Oznacza to, że jest semikonserwat.,bo połowa nici potomnej pochodzi od macierzystej. Zachodzi w interfazie.
Substraty dla syntezy DNA- deoksyrybonukleotydy: dTTP, dATP, dGTP, dCTP, jony Mg2+ i matrycowe DNA, energia z ATP.
Kierunek syntezy nici DNA- polimeraza DNA działa jedynie w kier. 5'3' na eksponowanej nici 3'5'. Tylko jedna nić umożliwia ciągłą syntezę-wiodącą (orientacja 3'5') na drugiej-opóźnionej, (orientacja 5'3') w kier: 3'5', skokowo tworzone są fragm. Okazaki, które następnie łączy ligaza.
Widełki replikacyjne- replikacja rozp.się w miejsu inicjacji-ori; dwuniciowa helisa ulega ew tym miejscu rozpleceniu i obydwie pojedyncze służą jako matryce, synteza zachodzi dwukierunkowo; rejon, w którym trwa replikacja to oczko replikacyjne, po jego przeciwnych str.wytwarzają się widełki replikacyjne.
ENZYMY: helikazy - rozrywają wiąz. wodorowe między nićmi matrycowego DNA, rozkręcając helisę i umożliwiając rozpoczęcie procesu; prymaza - syntetyzuje starter; polimerazy DNA - polimeryzuje zgodnie z zasadą komplementarności fosforany deoksyrybonukleotydów (I-naprawia błędy replikacji, II-polimeryzuje nowo zsyntetyzowane DNA); egzonukleaza - usuwa startery RNA z nici; ligaza DNA - uzupełnia brakujące wiązania fosfodiestrowe w szkielecie nowo-zsyntezowanej nici DNA; gyraza DNA-przemiana nowo powst. luźnej cz.DNA w superhelisę DNA.
Równocześnie trwa biosynteza histonów.
III. Transkrypcja DNA-biosynteza RNA
U eukariota: Starter nie potrzebny.Większość miejsc paromotorowych zawiera w odległości -25pz przed miejscem startu(+1) kasetę TATA, której zadaniem jest umieszczenie polimerazy RNA tak by mogła rozpocząś transkrypcję w ściśle określ. miejscu. W miejscu -5 kasety TATA są elementy kontrolujące transkrypcję. Do zainicjowania procesu polimeraza RNA II wymaga kompleksu białek-podst.czynników transkrypcyjnych TF II(pozwolą zawiązać enzym):
1-związanie z kastetą TATA kompleksu białowego TFIID ( podjednostka TBP wiąże się z TATA, później 8 czynników TAFIIS przyłącza się do TBP, tworząc TFIID),
2- do TFIID przyłącza się TFIIA stabilizując oddziaływanie „1” do którego następnie przyłącza się TFIIB (łącznik pomiędzy czynnikami transkrypcyjnymi a enzymem)
3-dopiero teraz przyłącza się polimeraza RNA II w formie kompleksu TF II F.
Po utworzeniu kompleksu inicjującego transkrypcję rozpoczyna się proces elongacji, który trwa do momentu erminacji (polimeraza II RNA kończy w miejscach przypadkowych). Wytworzona cząst to pierwotny transkrypt, który podlega dalszej obróbce.
Substraty-ATP, GTP, CTP, UTP, energia, matryca DNA, jony Mg2+.
Enzymy transkrypcji: polimeraza RNA I- (jąderko), transkrybuje geny 28S, 18S, 5,8S rRNA Polimeraza RNA II - (nukleoplazma) transkrybuje geny kodujące białka (synteza mRNA); polimeraza RNA III- transkrybuje geny tRNA, 5S rRNA.
Budowa kompleksu transkrypcyjnego- u prokariota: polimeraza RNA, matryca DNA i powst. RNA.
Nić matrycowa- transkrybowana 3'5'(powstaje antyrównoległa, kodująca 5'3').
Nić kodująca-fragment odpowiadający sekwencji mRNA, nie jest transkrybowany.
Lokalizacja-jądro.
Produkty transkrypcji- eukariota: pre-mRNA, które dojrzewa by stać się mRNA (procesy: synteza blokady na końcu 5', poliadenylację końca 3' i splicing). Do końca 5' przyłącza się cap a do 3' poliA, które przy wyprowadzaniu RNA poza jądro chronią je przed enzymami hydrolitycznymi. Prokariota- gotowe mRNA.
Pre-mRNA-u procariota: brak intronów, nie zachodzi dojrzewanie, brak modyfikacji, czas półtrwania- kilka min. U eucariota-są introny, zachodzi dojrzewanie, dodanie cap i poliA, czas półtrwania: do kilkunastu dni.
Egzon- w komórkach eukariotycznych odcinek genu kodujący sekwencję aminokwasów w cząsteczce białka. Eksony są w genomie jądrowym oddzielone intronami. Pierwotny transkrypt zawiera na przemian ułożone odcinki intronowe i eksonowe. Po zsyntetyzowaniu czapeczki i poliadenylacji cząsteczki RNA, ale jeszcze przed jej eksportem z jądra do cytoplazmy następuje
Splicing- składanie genu, wycinanie intronów - usunięcie intronów (sekwencji niekodujących) i połączenie egzonów (sekwencji kodujących) z pre-mRNA u eukariota. Zachodzi podczas obróbki posttranskrypcyjnej po to, by dojrzały mRNA, przygotowany do translacji, kodował ciągły łańcuch polipeptydowy (od kodonu start do stop). Splicing katalizowany jest przez kompleks białek i RNA zwany spliceosomem. W niektórych przypadkach następuje samowycinanie się intronów, bez udziału spliceosomu, funkcję katalityczną pełni wówczas RNA (rybozym).
Wycinanie przez spliceosom-Intron, by podlegał poprawnemu wycięciu, musi posiadać sygnały: sekwencję GU na końcu 5' i sekwencję AG na końcu 3' oraz tzw. miejsce rozgałęzienia, w którym znajduje się nukleotyd adeninowy (A). Podczas reakcji splicingu sekwencje sygnałowe są rozpoznawane przez wchodzące w skład spliceosomu małe jądrowe RNA (snRNA), które tworzą komplementarne połączenia RNA-RNA z obszarami terminalnymi i miejscem rozgałęzienia intronu. Splicing dokonywany przez spliceosom oraz samowycinanie zaczynają się od ataku grupy 2'OH nukleotydu adeninowego z miejsca rozgałęzienia na pierwszy nukleotyd intronu (koniec 5'), co powoduje powstanie pętli. Następnie grupa 3'-OH uwolnionego egzonu atakuje ostatni nukleotyd intronu na końcu 3', dzięki czemu egzony się łączą i uwalniany jest intron w formie lassa.
Samowycinanie- intronów odbywa się bez udziału spliceosomu, kiedy sam intron pełni funkcję rybozymu. Istnieje kilka grup samowycinających się intronów. Reakcja autokatalitycznego splicingu z udziałem intronów grupy I rozpoczyna się od ataku guanozyny (pochodzącej z intronu lub z wolnego kofaktora) na miejsce splicingowe 5'. Dla intronów grupy II pierwszym etapem reakcji jest atak grupy 2'hydroksylowej adenozyny pochodzącej z intronu na miejsce splicingowe 5'. Następnie grupa 3'OH egzonu na końcu 5' atakuje miejsce splicingowe na końcu 3', i egzony się łączą[2]. In vivo do zajścia reakcji samowycinania się wielu intronów potrzebne są dodatkowe białka, np. kodowane przez introny maturazy. Niektóre introny grupy II mogą funkcjonować jak transpozony, integrując do pozbawionych intronów alleli swojego genu.
IV. Translacja- biosynteza białka
INICJACJA- u bakterii występuje 2-stopniowy proces inicjacji translacji: a) kodon START (AUG-Met/ GUG-Wal) określa miejsce przył.małej podjednostki i początek polipeptydu; b)sekwencja SHINE-DALGRANO-ejon bogaty w puryny.
Występują 3 czynniki inicjacji: IF 1, 2 i 3.
Do MP 30S przył się czynniki IF1, 2 i 3, oraz GTP, mRNA i fMet-tRNAf (formylometionylo-tRNA), następnie odłączaq się IF3, co pozwala przyłączyć się DP 50S, co powoduje odłączenie również IF1 i 2; następuje hydroliza GTPGDP+Pi. Podczas tworzenia kompleksu inicjującego 70S, fMet-tRNAf zajmuje w rybosomie miejsce P (peptydowe), miejsce A jest wolne.
ELONGACJA
Czynnki elongacyjnyTu umieszcza aminoacylo-tRNA w miejscu A rybosomy; w momencie przył. AA-tRNA GTP hydrolizuje do GDP; DO rybosomy przył.się czynnik elongacyjny tS, który pozbywa się GDP. Wydłużający się łańcuch polipep.jest przenoszony na miejsce P, a puste tRNA z miejsca A, a tRNA z miejsca P do E (exit), z kutego jest uwalniany.
TERMINACJA
W miejscu A pojawia się na mRNA kodon stop (UAA/UAG/UGA), do którego przył, się (zamiast tRNA) czynnik RF1 i 2,które zmieniają aktywność rybosomu. Peptydylo-tRNA. jest przenoszony na cząst. H2O i wraz z nią uwalniany jako jon obojnaczy, w miejscu P zostaje zdeacylowany tRNA. Następnie odłącz. się RF1, 2 i tRNA. Rybosom dysocjuje na 2 podjednostki, a do MP przył.się IF1, by zapobiec przedwczesnej asocjacji rybosomu.
Kod genetyczny- zestaw reguł, określających sposób w jaki sekwencja nukleotydów w mRNA zostaje przetłumaczona na sekwencję AA w polipep. Sekwencja jest czytana trójkami- kodony- UAG, UGA, UAA- kodony stop; AUG-metionina-kodon inicjujący, start. Cechy: zdegenerowany- większość AA jest kodowana przez więcej niż jeden kodon; uniwersalny-taki sam dla wszystkich żywych org; trójkowy- 1AA kodowany przez 3nukleotydy; bezprzecinkowy, niezachodzący, jednoznaczny.
Istota translacji-utworzenie nowego łańcucha polipep.na matrycy mRNA.
Lokalizacja- rybosomy.
Budowa rybosomu- zbud.jest z 2 dopasowanych podjednostek: małej i dużej; zbud. z białek i rRNA; połączone tylko przy translacji. U prokariotów występują rybosomy 70S. Duża podjednostka (50S) zaw. 34 białka i 2 cz. rRNA (5S rRNA i 23S rRNA), a mała- (30S) zawiera 21 białek i 1 cz. rRNA. U eukariotów- rybosomy 80S (duża podjednostka 60S, mała- 40S), oraz mniejsze rybosomy mitochondrialne i chloroplastowe. Miejsce wiązania aminioacylo-tRNA- A-w czasie elongacji zostaje związ. aac-tRNA; m.wiązania oeotydylo-tRNA- P- wiąz.tRNA z rosnącym łańcuchem polipep; m.wyjście- E- rejon wiąz.tRNA po wykonaniu zadania, który zostanie uwolniony.
Aktywacja AA- AA+ATP+tRNAaminoacylo-tRNA+AMP+PP. AA w obecności ATP przył się do tRNA i powst aminoalylo tRNA. AA jest przenoszony na wyższy poziom energetyczny Reakcja katalizowana przez enzym syntetazę aminoacylo-tRNA, inna dla każdego AA, posiada 2 centra aktywne: dla AA i tRNA.
Polisomy- zespół rybosomów związanych z jedną cząsteczką mRNA i prowadzących jej translację.
CZYNNIKI TRANSLACJI U PROKARIOTA:
Inicjacyjne- initiation factor
IF1-wiąże się z MP i IF3
IF2- przył fMet-tRNa do MP i hydrolizuje GTP
IF3-uwalnia się dopuszczając DP do MP, stymuluje wiązanie mRNA
Elongacyjne-elongation f.
EF-Tu- przyłącz. AA-tRNA i GTP
EF-Ts- oddysocjowuje GDP I przył. się do EF Tu
EF-G- tworzy kompleks translokacyjny przez wiąz GTP z rybosomem
Terminacyjne-release factor
RF1- rozpoznaje kodony stop na mRNA (UAA i UAG)
RF2- j.w. (UAA, UGA)
RF3- wiąże GTP, stymuluje przył.RF1 I RF2