1.Przyczyny mikrobiologicznych zanieczyszczeń leków:

A. pierwotne skażenie surowców farmaceutycznych

B. proces produkcyjny

C. ogólny, niewłaściwy poziom higieny produkcji

D. personel

E. niewłaściwa konserwacja leków [czyli ochrona finalnego produktu przed wtórnym zakażeniem] - niewłaściwy środek konserwujący lub zbyt małe jego stężenie

F. brak kontroli produktu finalnego - jakość leku musi być zgodna z normami. W zakażeniach odlewowych biorą udział zarówno bakterie potencjalne jak i warunkowo chorobotwórcze oraz bakterie bytujące w środowisku. Komplikacje kliniczne stwierdzono przy obecności w lekach zwłaszcza drobnoustrojów z rodzaju: Staphylococcus i Pseudomonas (są one najbardziej niebezpieczne, występują również w lekach z antybiotykami i sterydami. Czyli w lekach osłabiających odporność makroorganizmu, mają bardzo duże zdolności adaptacyjne). Ponadto niebezpieczne są również drobnoustroje z rodzaju Klebesiella, Salmonella, Escherichia oraz grzyby wytwarzające mykotoksyny. (Mykoyoksyny nie rozkładają się pod wpływem temperatury, gromadzą się w organizmie nawet po kilku latach mogą ujawnić się w postaci nowotworu.)

2.Skutki obecności drobnoustrojów w lekach.

Dla Pacjentów

A. zakażenia odlewowe - powodowane przez żywe drobnoustroje (zarówno warunkowo jak i potencjalnie chorobotwórcze) oraz produkty ich rozpadu lub metabolity. Np. Pseudomodas aeruginosa występujący w lekach ocznych wytwarza enzym kolagenozę, który rozkłada kolagen, uszkadza rogówkę i organizm może potraktować oko jako ciało obce, co może doprowadzić do wypłynięcia oka i ślepoty. P. aeruginosa może występować w preparatach zawierających antybiotyki lub sulfonamidy, stosowanych na błonę śluzową ok.a i wtedy może spowodować tężec; Salmonella występując w lekach doustnych może wywołać dur brzuszny.

Zakażenia wywołane przez drobnoustroje występujące w lekach do użytku zewnętrznego i w lekach doustnych

Stosowane Leki	Drobnoustroje Występujące w lekach	Rodzaj zakażenia
Leki do użytku Zewnętrznego:
Zasypka z sulfonamidem	Clostridium tetani	Tężec
Krem sterydowy	Pseudomonas aeruginosa	Zakażenie skóry
Maść lidokainowa	Klebsiella pneumoniae	Zapalenie płuc
Aerozol	Serratia marcescens	Zapalenie płuc
Wlewy doodbytnicze BaSO4	Salmonella i Shigella	Dur brzuszny lub czerwonka
Krem ochronny do rąk	Pseudomonas aeruginosa	Zakażenie skóry
Roztwór fioletu krystalicznego	Mycobacterium chelonae	Zakażenie rany
Leki Doustne:
Tabletki ze sproszkowaną tarczycą	Salmonella muenchen	Dur brzuszny
Kapsułki z karminem	S. bareilly	Dur brzuszny
Sproszkowana trzustka	S. cubana	Dur brzuszny
Woda miętowa	S. agona P.aeruginosa	Dur brzuszny Zakażenie jelitowe

B. Toksykoinfekcja wskutek wytwarzania toksyn

Toksyczne oddziaływanie niektórych mykotoksyn na organizm:

Pleśnie	Mykotoksyny	Działanie szkodliwe
Aspergillus	Aflatoksyny B1 i G1	Nowotwory wątroby i nowotwory podskórne, działanie teratogenne i mutagenne
Aperillus	Sterygmatocystyna	Nowotwory wątroby, działanie mutagenne
Aperillus	Ochratoksyna A	Uszkodzenie wątroby, działanie mutagenne
Penicillum	Luteoskiryna	Nowotwory wątroby, działanie mutagenne
Penicillum	Rubratoksyna A	Uszkodzenie wątroby, krwawienia wewnętrzne, działanie teratogenne
Aperillus	Patulina	Nowotwory podskórne, działanie neurotoksyczne i teratogenne
Aperillus	Kwas kojowy	Działanie skurczowe, uszkodzenia białych krwinek

Dla Leków:

A. Zmiana właściwości organoleptycznych leków

Zmiana właściwości organoleptycznych leków nieparenteralnych pod wpływem drobnoustrojów

Formy leków	Drobnoustroje	Zmiany organoleptyczne
Roztwory, krople, mieszanki, zawiesiny, emulsje, soki roślinne, odwary, napary, maceracje	Escherichia, Kkebsiella, Enterobacter, Serratia, Pseudomonas, Bacillus, Flavobacterium, Micrococcus	Opalizacja, zmętnienie, osad, czasami nieprzyjemny zapach i smak
Syropy miody lecznicze	Saccharomyces, Bacillus	Spienienie warstw powierzchniowych, wycieki z pojemników, charakterystyczny kwaśny zapach i smak
Maści, kremy, pudry płynne, emulsje, wyciągi gęste, żele, pasty	Staphylococcus, Bacillus, Geotrichum, Rhodotorula, Aspergillus, Penicilium, Cladosporium	Naloty o różowym zabarwieniu na powierzchni , zmiana konsystencji i zabarwienia, pękanie tubek, nieprzyjemny zapach i smak
Tabletki, drażetki	Aspergillus	Pękanie i rozpad

B. Obniżanie lub zmiana wartości terapeutycznej leków (przemiany lub rozkład substancji leczniczych.

- Bardzo szybko rozkładowi ulegają leki recepturowe, np. odwary, napary

- Surowce roślinne wchodzące w skład preparatów roślinnych ulegają całkowitemu rozkładowi, gdyż związki w nich zawarte stanowią źródło węgla dla bakterii, np. cukry, terpeny, kwasy aromatyczne, flawonoidy, alkaloidy. Ponadto niektóre substancje występujące w substancjach roślinnych wchodzą w przemiany metaboliczne, np. alkaloidy, saponiny, sterole.

- Drobnoustroje mogą także rozkładać antybiotyki w których są obecne, np. drobnoustroje wytwarzające β-laktamowe, drobnoustroje wytwarzające acetylotransferazy rozkładają, np. Chloramfenikol.

Dla samych Drobnoustrojów:

A. efekt namnażania

B. nabywanie oporności na drodze różnych mechanizmów lub zmiana wrażliwości (adaptacja)

C. selekcja szczepów opornych.

3. Jakimi wymaganiami czystości mikrobiologicznej objęte są różne grupy leków i dlaczego?

FP V reguluje czystość i jałowość preparatów farmaceutycznych. Pod względem czystości mikrobiologicznej FP V dzieli leki na 3 główne grupy.

Wymagania jałowości i czystości mikrobiologicznej dla różnych grup leków według FP V:

Grupa leków	Wymagania^*)**)
I Leki do stosowania pozajelitowego Leki do oczu Leki stosowane na rany i rozległe oparzenia	Jałowość [nie może być nawet ciał pirogennych!]
IIa ^***^) Leki stosowane zewnętrznie [nie należące do grupy IIb] Leki na skórę i błony śluzowe Leki do nosa, uszu i gardła Leki inhalacyjne	Nie więcej niż 10^2 bakterii i 10^2 grzybów w 1g lub 1ml. Nieobecność w 1g lub 1ml Staphylococcus ureus i Pseudomonas aeruginosa Nie więcej niż 10 drobnoustrojów z rodziny Enterobacteriaceae i innych pałeczek Gram (-) w 1g lub 1ml
IIb Leki stosowane zewnętrznie zawierające surowce pochodzenia naturalnego	Nie więcej niż 5*10^2 bakterii i 10^2 grzybów w 1g na 1ml Nieobecność w 1g lub 1ml staphylococcus ureus, Pseudomonas aeruginosa i rodzaju Clostridium Nie więcej niż 10 drobnoustrojów z rodziny Enterobakteriaceae i innych pałeczek Gram (-) w 1g lub 1ml
IIIa Leki stosowane doustnie [nie należące do grupy IIIc i IIId] Leki doodbytnicze	Nie więcej niż 10^3 bakterii i 10^2 grzybów w 1g lub 1ml. Nieobecność w 1g lub 1 ml Staphylococcus aureus. Nie więcej niż 10^2 innych drobnoustrojów z rodziny Enterobacteriaceae i innych pałeczek Gram (-) w 1g lub 1ml
IIIb Systemy przezskórne [transdemalne] Leki dopochwowe	Nie więcej niż 10^3 bakterii i 10^2 grzybów w 1g lub 1ml. Nieobecność w 1g lub 1ml Staphylococcus ureus, Pseudomonas aeruginsa i Escherichia coli. Nie więcej niż 10^2 innych drobnoustrojów z rodziny Enterobacteriaceae i innych pałeczek Gram (-) w 1g lub 1ml
IIIc Leki doustne zawierające surowce pochodzenia naturalnego	Nie więcej niż 10^4 bakterii i 10^2 grzybów w 1g lub 1ml. Nieobecność w 1g lub 1ml Staphylococcus ureus, Pseudomonas aeruginsa i Escherichia coli. Nie więcej niż 10^2 innych drobnoustrojów z rodziny Enterobacteriaceae i innych pałeczek Gram (-) w 1g lub 1ml
IIId Leki doustne pochodzenia naturalnego, poddawane działaniu wrzącej wody	Nie więcej niż 10^7 bakterii i 10^5 grzybów w 1g lub 1ml. Nie więcej niż 10^2 Escherichia coli w 1g lub 1 ml.

*)wymagania dotyczą odpowiednio grup preparatów opisanych w monografiach ogólnych postaci leku lub w monografiach szczegółowych

**) wymagania dotyczące bakterii odnoszą się do bakterii tlenowych

***)o ile nie mają wymagań jałowości (do IIa)

4. Zasady prawidłowego wytwarzania leków [GMP] w aspekcie mikrobiologicznym.

W związku z dużą liczbą zakażeń odlekowych na świecie opracowano szereg metod ochrony przed nimi. Przede wszystkim opracowano:

A. normy, zasady prawidłowego wytwarzania leków [good manufacture in practise, GMP]

B. walidację procesu produkcji czyli kontrolę zgodności przebiegu procesu produkcyjnego z zasadami GMP

C. wymogi dobrej pracy laboratoryjnej [good laboratory practise GLP]

Zasady prawidłowego wytwarzania leków obejmują cały proces wytwarzania leku. Dotyczą: materiału, przestrzeni pracy, aparatury, powierzchni i personelu.

Problem czystości leku związany jest z zasadami prawidłowego wytwarzania leków GMP, które mówią na temat kontroli prawidłowości przebiegu procesu wytwarzania leków. Zasady te obejmują:

A. zalecenia mikrobiologiczne

B. problemy chemiczne

C. procedury zabezpieczające przed błędami produkcyjnymi

D. zagadnienia odpowiedzialności i kompetencji

E. zagadnienia jakości

F. sposoby prowadzenia dokumentacji

Zalecenia te są ogólnymi dyrektywami, natomiast producenci leków opracowują szczegółowy program prawidłowego wytwarzania leków. Zalecenia te dotyczą całego procesu: materiałów, przestrzeni pracy, aparatury, powierzchni, personelu (instrukcje bardziej ogólne i szczegółowe dla poszczególnych stanowisk pracy). Bardzo ważne jest prowadzenie dokumentacji, która umożliwia odtworzenie wszystkich etapów i w razie konieczności odtworzenie procesu wytwarzania leku.

Zagadnienia te dotyczą klas czystości surowca farmaceutycznego. Wyróżnia się 4 klasy czystości surowca:

I - praktycznie wolny od zanieczyszczeń, jałowy - badania są zbędne

II - niski stopień zanieczyszczenia - badania dotyczą próby losowej

III - duże zanieczyszczenie - badana jest każda seria leków

IV - bardzo zanieczyszczony - badana jest każda seria leków

5. Mikrobiologiczna walidacja procesu wytwarzania leków.

Okresowo przeprowadzana jest kontrola oceniająca prawidłowość przebiegu procesu produkcyjnego mająca potwierdzić zgodność z zasadami GMP. Są to tzw. Badania walidacyjne.

Walidacja obejmuje ocenę:

- powietrzną

- powierzchni [stoły, podłogi, ściany] - przestrzeń pracy

- aparatury

- personelu

- surowców do produkcji leku

- produktu końcowego

- konserwacji

Pod kątem mikrobiologicznym:

- kontrola czystości powietrza, powierzchni

- kontrola jałowości wody

- kontrola sprawności aparatury sterylizującej, boksów laminarnych

- ocena skuteczności działania środków dezynfekcyjnych i antyseptycznych

- ocena skuteczności działania konserwantów

Kontrola powierzchni - badania metodą sedymentacyjną lub kontaktową, płytkową (płytki z wypukłą powierzchnią podłoża).

Kontrola sprzętu - np. loże, suszarki, autoklawy - metodami biologicznymi.

Kontrola personelu - prześwietlenia klatki piersiowej, badania na nosicielstwo w górnych drogach oddechowych.

Kontrola wyposażenia personelu - rękawice, fartuchy, ubrania.

Kontrola wody - objęte normami (inne dla wody do płukania, inne dla wody wykorzystywanej do produkcji leków).

Kontrola środka konserwującego, test konserwacji zgodnie z FP V.

GLP [good laboratory practise] - wymogi dobrej pracy laboratoryjnej] - m.in. mówią o tym jak pracować i z jakimi odczynnikami, surowcami by prawidłowo przeprowadzić proces walidacji.

6. Konserwacja preparatów farmaceutycznych - cel, rodzaje. Kryterium doboru środków konserwujących, znaczenie praktyczne.

Produkt końcowy musi mieć odpowiednią jakość i czystość mikrobiologiczną. Czas przechowywania i czas zużycia od momentu otwarcia pojemnika jest określony i podany do wiadomości. Bardzo często w preparacie farmaceutycznym obecny jest środek konserwujący. Hamuje on rozwój drobnoustrojów lub ewentualnie zabija je. Dla danego preparatu dobiera się go pod względem parametrów, np. skuteczność przeciwdrobnoustrojowa. Musi mieć szerokie spektrum działania, musi utrzymywać poziom drobnoustrojów na bezpiecznym poziomie i działanie to musi być długie, by przez podany okres ważności preparatu zachował on swoje właściwości. Podsumowując konserwacja preparatów farmaceutycznych ma na celu zapewnienie odpowiedniej czystości mikrobiologicznej, jakości i trwałości preparatu przez przewidziany okres ważności tego preparatu.

Środek konserwujący - jest to substancja chemiczna o działaniu przeciwdrobnoustrojowym, której obecność zabezpiecza lek przed rozwojem drobnoustrojów mogących się w nim znaleźć w wyniku wtórnego zakażenia, np. z powietrza, z dłoni i rąk.

Kryterium doboru środka konserwującego. Przy wyborze środka konserwującego odpowiedniego dla danego preparatu bierze się pod uwagę następujące cechy:

- skuteczność przeciwdrobnoustrojowa - powinien to być środek o szerokim spektrum działania przeciwdrobnoustrojowego i jednocześnie o długotrwałym działaniu. W celu sprawdzenia jego działania wykonuje się test konserwacji

- zgodność środka konserwującego ze składnikami leku

- nieszkodliwość dla chorego

- nietoksyczność

- nie powinien wywierać działania drażniącego i alergizującego.

Do najczęściej stosowanych rodzajów środków konserwujących w preparatach farmaceutycznych należą:

- fenole i ich pochodne

- alkohole i ich pochodne

- kwasy organiczne

- organiczne związki rtęci

- chlorkoheksydyna

- IV - rzędowe zasady amoniowe.

7. Metody badania czystości mikrobiologicznej i jałowości leków.

Stosuje się dwie zasadnicze metody badania czystości mikrobiologicznej leków:

- metoda posiewu

- metoda z wykorzystaniem sączków membranowych.

Wybór metody zależy od obecności lub nieobecności składnika przeciwdrobnoustrojowego w leku. Jeśli w preparacie są substancje przeciwdrobnoustrojowe, których nie można inaktywować lub usunąć - metodą z wyboru jest filtracja. Po oddzieleniu przesączu sączki na których są drobnoustroje przenosi się na odpowiednie podłoża i inkubuje się sprawdzając potem czy wystąpił wzrost. Jeśli w preparacie nie ma substancji przeciwdrobnoustrojowej to można go przenosić bezpośrednio na podłoże.

Klasyczne metody identyfikacji

Komisje Farmakopei USA, Japońskiej i Europejskiej orzekły, że metody farmakopealne są jedynymi metodami stosowanymi do oceny czystości i jałowości preparatów farmaceutycznych. Są one metodami referencyjnymi i nowe metody mogą być stosowane pod warunkiem, że zostały zwalidowane w odniesieniu do metod farmakopealnych i nowa metoda okazała się równoważna lup lepsza od metody farmakopealnej. Podstawą do zmiany metody jest powtarzalność i odtwarzalność oraz precyzja i dokładność testu, a nie szybkość uzyskania wyników końcowych!!!.

Wprowadza się ostatnio automatyzację procesu, automatyczną identyfikację na podstawie cech biochemicznych i systemy automatycznego liczenia drobnoustrojów.

Wykrywanie drobnoustrojów powinno opierać się na ich metabolizmie, czyli na np. pomiarze ciśnienia CO₂ wytwarzanego w pojemniku z podłożem hodowlanym, na pomiarze kolorymetrycznym tegoż związku, na pomiarze tzw. Bioluminescencji adenozynotrójfosforanu (ATP), na pomiarze zmian oporności (impedancji) w podłożu hodowlanym pod wpływem enzymów drobnoustrojowych.

Bioluminescencja ATP

ATP występuje w każdej żywej komórce. Bioluminescencja polega na uwalnianiu energii w formie fotonów (emisji światła) na skutek reakcji enzymatycznych żywych organizmów. Do oznaczeń stosuje się zestaw Lucyferyna + Lucyferaza, wykorzystując fakt, że ilość ATP jest proporcjonalna do emisji światła powstającego w wyniku aktywacji tego systemu w obecności tlenu i jonów Mg²⁺. Warunki optymalne pomiaru to pH=7,8 i temp. 20-25 C.

Epiflurescencja

Polega na bezpośrednim zliczaniu drobnoustrojów po ich oznakowaniu związkami fluorescencyjnymi, które wzbudzone wiązką światła o określonej długości emitują światło o większej fali i niższej energii, np.

Poronina Y - wiąże się z RNA

Sulforodamina - wiąże się z białkami

Cytometria

Jest metodą także opartą na fluorescencji, w której można wykryć nawet pojedynczą komórkę. Może to być tzw. Cytometria przepływowa (komórkę wykrywamy w roztworze) lub cytometria stacjonarna (komórkę wykrywa się na sączkach membranowych).

Impedymetria

Wzrost drobnoustrojów w podłożach hodowlanych powodują rozkład substancji odżywczych, tj. białek i cukrów obecnych w podłożu do zjonizowanych, mniejszych cząsteczek. Ten proces zmienia właściwości elektryczne mierzone przez elektrody umieszczone w podłożu.

---