METODY IZOLACJI IMMUNOGLOBULIN
!!! Wszystkie prace z surowica proszę BEZWZGLĘDNIE przeprowadzić w rękawiczkach !!!
Odczynniki, materiał biologiczny:
siarczan amonowy- dobrze rozpuszcza się w niskich temp., podobnie inne sole amonowe
nasycony roztwór siarczanu amonu- do oczyszczania białek
surowica
Opis metody:
1. Surowicę /0,5-1 ml/ rozcieńczyć 2-3 krotnie roztworem PBS lub 0,9 % roztworem NaCl
- aby zwiększyć odległości między cząsteczkami i stworzyć optymalne warunki do wysalania
2. Zważyć masę surowicy i obliczyć ile należy dodać siarczanu amonu, aby otrzymać pożądane stężenie
wzór: Cp %= x/ ms + x x- masa substancji, która należy dodać
ms- znana masa substancji (tu surowicy)
ms+x= mr (masa roztworu)
3. Do tak przygotowanego roztworu dodawać delikatnie mieszając sproszkowany siarczan amonu, doprowadzając do:
33% stężenia soli (głównie IgG)-> probówka A
50% stężenia soli (IgG i IgM)-> probówka B
4. otrzymane roztwory odstawić na 10 minut w temp. 4 stopni C /chłodziarka/
aby zoptymalizować proces wysalania
5. Powstałe osady odwirować przy 4000 RMP przez 20 minut, zalać supernatant (IgG)
w osadzie IgG, w pozostałej części inne białka
6. Przemyć osad nasyconym roztworem siarczanu amonowego i odwirować (4000 RMP 15 min.) dwukrotnie
żeby oczyścić białko
7. Otrzymany „mokry” osad immunoglobulin dializować lub zamrozić, zliofilizować i przechowywać w temp. - 20 stopni C/ może być wykorzystany do następnych ćwiczeń