Techniki fluorescencyjne w analizie związków biologicznie czynnych

• Większa selektywność i specyficzność analiz

• Bardzo niska granica oznaczalności ( ilość związku)

• Bardzo niska granica wykrywalności ppb ppt 10 ^-12g (pg)

• Czułość - reakcja danej metody na zmianę ilości związku (substancji) - generuje się duża zmiana w emisji- 3-6 razy większa niż w absorpcjometrii

Fluorofor jest częścią cząsteczki, która odpowiada za jej fluorescencję. Najczęściej jest to grupa funkcyjna, zdolna do absorpcji energii o określonej długości fali, a później do wyemitowania innej długości fali (ściśle określonej). Ilość energii oraz długość fali emitowanej zależy od właściwości fluoroforu, ale również od środowiska chemicznego w jakim on działa (np. pH, czy siła jonowa). Stosuje się zestawy fluoroforów.

Fluorofory jako znaczniki	Ex	Em
Hydroksykumaryna Izotiocyjanian fluoresceiny(FITC) Tetrametylorodamina (TRITC) Indokarbocyjanina (Cy5)	325 495 547 625-650	386 519 572 670

Fluorofory wiążące się z kwasami nukleinowymi	Ex	Em
Hoechst 33342 SYTOX Green Chromomycin A3 Arcidine Orange Dapi	343 504 445 503 345	483 523 573 530-640 465	AT-selektywny DNA CG-selektywny DNA i RNA AT-selektywny

Znaczniki fluorescencyjne- syntetyczne barwniki fluorescencyjne (fluorofory), charakteryzujące się dużą wydajnością kwantową fluorescencji, które wykazują reaktywność względem określonych grup (aminowej, tiolowej). Daje to możliwość znakowania niefluoryzujących związków (leków, białek, DNA) w celu ich detekcji i oznaczenia technikami fluorescencyjnymi.

Sondy fluorescencyjne:

• Jest fluoroforem, który lokalizuje się w specyficznym rejonie biologicznego obiektu (np. błony komórkowe, mitochondria, jądro) lub odpowiada na specyficzny czynnik stymulujący

• Sondy mogą lokalizować się w określonym regionie komórki (np. błony komórkowe, mitochondria, jądra) lub wiązać się do określonych sekwencji wyizolowanego DNA (np. podczas procesu sekwencjonowania lub hybrydyzacji DNA)

• Mogą odpowiadać na działanie specyficznych enzymów

Rolę sony mogą pełnić:

• znaczniki fluorescencyjne charakteryzujące się wysoką wydajnością kwantową fluorescencji np. ANS (anilino-naftaleno-sulfonian), TNS (tolueno-naftaleno-sulfonian) czy chlorek dansylu

• fluoryzujące barwniki związane z oligonukleotydami np. sondy hybrydyzacyjne do ilościowego PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym)

• fluoryzujące barwniki związane z przeciwciałami np. sondy immunofluorescencyjne, pozwalające wykrywać odpowiednie antygeny (np. na pow. nowotworów)

• słabo fluoryzujące barwniki, które stają się fluoroforami (FRET technika) o wysokiej wydajności kwantowej ф, dopiero wtedy gdy zwiąże się z określoną docelową molekułą.

• niefluoryzujące barwniki przekształcone w fluoryzujący produkt na drodze enzymatycznej (bardzo czuła metoda oznaczania aktywności enzymatycznej)

• związki wchodzące w skład żywych organizmów; tryptofan (wykorzystywany najczęściej, E_ex295nm, E_em305nm), tyrozyna, fenyloalanina, porfiny, FAD, NAD

Szczególny rodzaj sond luminescencyjnych - fluorescencyjne sondy molekularne:

Stanowią one fragment genomowego DNA rozpoznający sekwencje różniące się zaledwie kilkoma nukleotydami i tworzą trwałe wiązania z komplementarnymi fragmentami kwasów nukleinowych, zawierają dołączone fluorofory. Pozwalają na wykrywanie mutacji genowych, polimorfizmów.

Sonda typu „molecular bacon” - boja- latarnia molekularna

Sonda; cel sondy

Sonda z jednoniciowego DNA (ssDNA) ukształtowana w postać szpilki do włosów (oligonukleotyd zawierający grupę fluoroforu i grupę wygaszacza). Fluorescencja ma miejsce dopiero wtedy, gdy sonda przyłączy się do kwasu nukleinowego będącego jej celem.

Fluorescencyjny rezonansowy transfer FRET- fluorescencyjne rezonansowe przeniesienie energii (fluorescence resonance energy transfer)- metoda opiera się na istnieniu bezpromienistego (bez fotonu) transferu energii między wzbudzonym donorem a niewzbudzonym akceptorem, którymi są sondy fluorescencyjne.

D* + A D + A* D-donor

A* A + hυ A-akceptor

Warunek konieczny do transferu:

• widmo absorpcyjne musi pokrywać się z widmem emisji donora (opt.~30%)

• odpowiednie ułożenie dipoli pary donor-akceptor

• odległość między nimi rzędu 1-10nm

Jeśli selektywnie wzbudzony donor to obserwujemy spadek pochodzący od donora fluorescencji, wzrost dla akceptora.

Typowe pary donor-akceptor to np.:

• Fluoresceina-fluoresceina

• Tetrametylorodamina-fluoresceina

Przykłady użycia:

1. Badanie oddziaływań antygen-przeciwciało

2. Wiązanie substratu przez enzym

Zastosowanie:

• Badanie oddziaływań par enzym-substrat lub antygen-przeciwciało

• Badanie procesów fałdowania i rozwijania białek

• Śledzenie asocjacji podjednostek białka czy fragmentów DNA o komplementarnej sekwencji zasad

• Monitorowanie powstawania kompleksów białko-białko, białko-DNA

• Określanie wpływu białka na DNA

Przyrządy stosowane w technikach fluorescencyjnych:

• spektrofluorymetry

• czytniki mikropłytek- mierzy fluorescencję płytek

• cytometry przepływowe- określa fluorescencję znakowanych fluoroforem żywych komórek lub mikrocząsteczek np. limfocytów, neutrofili, monocytów.

• mikroskopy fluorescencyjne - do obserwacji w skali mikro, identyfikacja fluoroforów obecnych na powierzchni lub wnętrzu żywych komórek.

• aparaty do elektroforezy kapilarnej (białka, DNA - do ich rozdziału)

• sekwenatory DNA

• skanery fluorescencyjne - do badania fluorescencji obiektów makroskopowych w płytkach DNA/proteina (tzw. chip), żelach do elektroforezy, chromatografach w chromatografii cienkowarstwowej. Stosowany w oznaczeniach ilościowych protein i kwasów nukleinowych (porównanie z paskami o znanym stężeniu)

Zastosowanie sond fluorescencyjnych:

• analiza ekspresji genów mRNA (mikromacierz)

• detekcja i oznaczanie białek, DNA, RNA

• analiza przeżywalności komórek

• badanie proliferacji

• detekcja stresu oksydacyjnego (zaburzenia cyklu tlenu - tlenek azotu)

• analiza aktywności enzymów

• analiza struktury błon komórkowych (ich integralność)

• jako indykatory pH (np. w kompartmentach komórkowych)

Subkomórkowa struktura komórek śródbłonka widoczna przy użyciu 3 sond fluorescencyjnych

• Fluorescencja niebieska- jądrowa

• Fluorescencja czerwona - mitochondrium

• Fluoresceina zielona- aktyna filamentów

• Stadia mitozy- mikrotubule-zielone, chromosomy-niebieskie

• Nieuszkodzone żywe komórki - zielona

• Uszkodzone żywe komórki - czerwona

• Przechodzący przez błony barwnik znakuje kwasy nukleinowe nieuszkodzonych komórek (zielona fluorescencja)

Detekcja stresu oksydacyjnego

• Pochodna fluoresceiny fluoryzuje na zielono utlenieniu przez ROS (rodniki) po utlenieniu przez reaktywne formy tlenu. Komórki nie poddane stresowi - brak fluorescencji, znikoma fluorescencja.

• Detekcja anionu ponadtlenowego w mitochondriach- indykator fluoryzuje na czerwono po utlenieniu przez anion ponadtlenkowy. Jądra wybarwiono barwnikiem Hoechst 3342 fluoryzującym na niebiesko po związaniu do kwasów nukleinowych.

Immunocytochemia - wykorzystująca reakcje antygenu wyznakowane fluoresceiną- przeciwciała, umożliwia identyfikacje całej gamy patologicznych mikroorganizmów- wirus HIV, Herpes, ospy, grzyby.

Komórki nowotworowe osteosarcoma- ludzkiego

A - linia komórkowa prawidłowa ( szereg „dziki”)

B- linia komórkowa 60 (pozbawiona mitochondrialnego DNA)

Widoczne różnice w strukturze sieci mitochondrialnej.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ FISH

• Pozwala na wykrywanie specyficznych sekwencji DNA i RNA w chromosomach i na identyfikację aberracji chromosomowych.

• Fluorofor (fluoresceina, adenina, czerwień toskańska) wbudowuje się w nić DNA i uwidacznia w określonym miejscu chromosomu. (Hybrydyzacja: wzajemne oddziaływanie między badanym fragmentem kwasu nukleinowego a sondą molekularną -prowadzi to do powstania hybrydy (dupleksu))

• Badanie ekspresji genów na poziomie fragmentacji (mRNA) umożliwia ocenę ekspresji setek genów (nawet tysięcy). Pozwala na porównanie ekspresji w stanach fizjologicznych i patologicznych (mikromacierz cDNA)

• Makromacierz cDNA- umożliwia ocenę ekspresji setek genów, pozwala na porównanie ekspresji w stanach fizjologicznych i patologicznych

• FITC- znakuje przeciwciała monoklonalne związane ze ścianą

Zielone białko fluoryzujące GFP (ang. green fluorescent protein):

• Białko wykazuje naturalną fluorescencję w obszarze widzialnym(ၬwz = 385 nm, ၬem = 508 nm), pochodzące z meduzy Aequorea Victoria

• Gen GFP ulega ekspresji w komórkach bakterii, drożdży, roślin i ssaków co powoduje, że jest użytecznym narzędziem biologii molekularnej, doczepione do innych białek(seryna, tyrozyna, glicyna) zachowuje swoje fluoryzujące właściwości,

• Białko GFP odkryto w latach 60-tych natomiast gen poznano w 1992 roku.

• W 2008 roku odkrywcom i badaczom GFP, Martinowi Chalfiemu, Osamu Shimomurze i Rogerowi Tsienowi została przyznana Nagroda Nobla z chemii .

• Struktura przestrzenna GFP- Na chromofor składają się 3 aminokwasy (seryna, tyrozyna, glicyna), które w otaczającym je środowisku ulegają cyklizacji i dehydratacji, co prowadzi do powstania fluoryzującego układu sprzężonych wiązań podwójnych.

Zastosowanie GFP:

• do oceny skuteczności transfekacji

• jako gen reporterowy w badaniach aktywności promotorów i poziomu ekspresji genów znajdujących się pod ich kontrolą.

• do śledzenia interakcji pomiędzy białkami praz lokalizacji badanego białka w komórce (białka fuzyjne złożone z GFP interesującego nas białka)

Mutanty GFP- wprowadzenie mutacji do GFP pozwoliło otrzymać białka, które wykazują zwiększoną fluorescencję (EGFP; ang. enhanced GFP) i zmianę długości emitowanego światła.

Powstały białka świecące na:

• niebiesko (BFP ; ang. blue fluorescent protein)

• czerwono, wiśniowo (RFP; ang. red fluorescent protein)

• żółto (YFP; ang. yellow fluorescent protein)

Przykłady: komórka Hela (komórki raka szyjki macicy)

Przykłady oznaczeń:

• hormony (adrenalina, noradrenalina)

• witaminy (tiamina, ryboflawina)

• aminokwasy

• kwas foliowy

• cholesterol

• histamina

• fenyloamina

• środki farmaceutyczne ( antybiotyki, witaminy syntetyczne- barbiturany, aflatoksyny, testy wrażliwości na antybiotyki -aspiryna, chloropromucyna, morfina- toksykologia.)

• środki żywnościowe ( tłuszcze, węglowodany, cukry proste, zafałszowania win - sacharyna)

• związki nieorganiczne ( kation Al., Be, Ca, Ga, pierwiastki ziem rzadkich)

• środowiskowe ( stopień czystości wody - olej, zanieczyszczenia gleby, algi, bakteriologiczne E. Coli)

---