Wykład 3 18.03.2006

Diagnostyka mikrobiologiczna

Pośrednia Bezpośrednia

szukamy odpowiedzi immunologicznej szukamy drobnoustroju lub jego fragmentów

Wszystkie patogeny są antygenami.

Najwięcej przeciwciał obserwujemy w okresie rekonwalescencji.

DIAGNOSTYKA POŚREDNIA

• badanie odpowiedzi humoralnej

- obecność przeciwciał

- miano przeciwciał

- dynamika narastania miana (1 raz mierzy się w okresie ostrych objawów choroby; 2 raz -2tyg później, obserwowany wzrost miana)

- miano przeciwciał w klasie IgM i IgG

• badanie odpowiedzi komórkowej

- odczyny skórno-alergiczne

ODCZYNY SEROLOGICZNE

- uwidaczniają reakcję antygenu z przeciwciałem w warunkach in vitro

- stosowane są różne techniki

- zawsze jeden element musi być wzorcowy (albo antygen,, albo przeciwciała) a drugiego szukamy

MIANO PRZECIWCIAŁ - największe rozcieńczenie surowicy badanej, gdzie jeszcze zachodzi reakcja serologiczna

Pierwsze w odpowiedzi immunologicznej powstają IgM. Jeśli ktoś ma większe IgM niż IgG oznacza to, że badana osoba jest chora, bądź chorowała niedawno.

Przeciwciała swoiście reagują z antygenem.

Wielocukry mogą być przeciwciałami.

ODCZYNY SEROLOGICNE

• Aglutynacyjne (zlepianie dużych cząstek)

- aglutynacji bakteryjnej

- aglutynacji lateksowej (używamy do poszukiwania antygenu)

- hemaglutynacji biernej ( dużą cząsteczką jest krwinka) krwinka opłaszcza się w sposób sztuczny antygenem

• Precypitacji (precypitacja obrączkowa lub dyfuzyjna w żelu/ rzadko stosowana)

• Neutralizacja (ważne w wirusologii, antygen neutralizowany przez przeciwciało i przestaje być zakaźny)

• Odczyny wiązania dopełniacza (OWD)

• Odczyny immunofluorescencji - najczęściej stosowane, przeciwciała znakuje się

• Odczyny immunoenzymatyczne - --//-- --//-- --//-- --//-- --//--

Możemy ocenić gołym okiem czy antygen połączył się z przeciwciałem

INTERPRETACJA ODCZYNÓW

• wynik + lub -

• miano wyższe niż norma

• narastanie miana

• oznaczanie przeciwciał w różnych klasach

METODY BEZPOŚREDNIE

materiał od chorego

metody hodowlana metody niehodowlane (szybkie)

mikroskopowe serologiczne molekularne

(poszukiwanie antygenu) (poszukiwanie DNA lub RNA)

METODY BARWIENIA BAKTERII

• Pozytywne

@ proste (stosujemy jeden barwnik i bakterie barwią się w ten kolor)

@ złożone (barwników kilka, barwienie różne)

- metoda Grama (+ lub -) - na czerwono +na fioletowo

- metoda Ziehl-Nielsena - odróżnia prądki (bakterie na niebiesko, prądki na czerwono)

• Negatywne

@proste (barwi się tło, bakteria niezabarwiona)

• Pozytywno-negatywne (barwi się i tło i bakterie) uwidacznia otoczkę bakterii, która nie jest zabarwiona

BARWIENIE METODĄ GRAMA

(-) (+)

białe Ubarwienie białe

|

niebieskie fiolet krystaliczny niebieskie

|

niebieskie płyn Lugola niebieskie

|

odbarwiają się odbarwienie alkoholem niebieskie

|

fiolet/róż safranina niebieskie

SCHEMAT BADANIA BAKTERIOLOGICZNEGO

Badanie bakteriologiczne materiał od chorego

preparat bezpośredni posiewy na podłoża

mikroskopowy (metoda Grama)

wzrost (ocena morfologii kolonii)

izolacja

identyfikacja

antybiogram

prep.gram biochemiczna testy dodatkowe

metody molekularne budowa antygenu chorobotwórczość

IDENTYFIKACJA BAKTERII

TESTY BIOCHEMICZNE

fermentacja cukrów rozkład aminokwasów redukcja azotanów inne np. kataliza oksydaza

INDOL

H2S

inne

Posiewy wykonujemy przy pomocy ezy. Sterylizacja ez przez wyparzenie

POCHODZENIE EPIDEMIOLOGICZNE

• ustalenie czy szczepy tego samego gatunku bakterii od różnych chorych lub nosicieli są tym samym szczepem, czy są szczepami różnymi.

PODZIAŁ PODŁÓŻ DO HODOWLI BAKTERII

• naturalne

• syntetyczne

• półsyntetyczne

SZTUCZNE POŻYWKI - składniki dodane osobno, czyste

NATURALNE - dodajemy naturalne produkty

Wirusy hodujemy na zwierzętach, albo na zarodkach kurzych.

Bakterie wewnątrzkomórkowe: Rikecje, Hlamydie, Erlihie

| | |

powodują dur ziarnica weneryczna w Polsce nie występują

plamisty jaglica

PODZIAŁ PODŁÓŻ DO HODOWLI BAKTERII

• namnażające

• wybiórcze

• różnicując

• wybiórczo-różnicujące

• specjalne

MATERIAŁY DO BADAŃ MIKROLOGICZNYCH wymaz z:

• ucha

• rany

• oka (spojówki)

• gardła

• nosa

• owrzodzenia

• zmian skórnych

• pochwy

• odbytu

Do badań mikrologicznych pobiera się: kał, krew, mocz, plwocinę, płyn mózgowo-rdzeniowy, materiały z biopsji, materiały pobierane śródoperacyjnie, punktaty (pobrane z punkcji)

• CZYSTE - z miejsc normalnie jałowych

- krew, płyn mózgowo-rdzeniowy, mocz z pęcherza pobrany przez nakłucie

• z miejsc w których występuje normalna flora

- kał, wymaz gardła, skóry

• zanieczyszczenia w trakcie pobierania normalną florą

- plwocina, mocz

MORFOLOGIA KOMÓREK BAKTERYJNYCH

• kształt

- cocci (kuliste)

- pałeczki i laseczki (cylindryczne)

- spiralne lub zakrzywione

• ułożenie wzajemne komórek

- pojedynczo

- gronka

- łańcuszki

• gram dodatnie lub ujemne

Metody molekularne opierają się o komplementarność nici DAN

METODA PCR

- reakcja łańcuchowa polimerazy, prowadzi do amplifikacji określonego fragmentu DNA

- istnieje wiele modyfikacji tej metody

Szybka diagnostyka bez hodowli. Kiedy stosujemy:

• słabo rosną

- izolacja wymaga długiego czasu

• wogóle nie rosną

- izolacja niemożliwa

• hodowla nie ma znaczenia w klinice

SZYBKIE METODY

• Serologiczne

- szukamy antygenów, wirusów, bakterii

• Molekularne

- szukamy DNA (RNA) głównie metodą PCR

---