Pojęcie biotechnologii
wykorzystanie techniki kultur in vitro
zastosowanie metod genetyki molekularnej do diagnostyki i selekcji
przenoszenie genów na drodze pozageneratywnej
Biotechnologia -definicja
Biotechnologia - zastosowanie wiedzy naukowej i inżynierii do przetwarzania organizmów , komórek lub ich części oraz molekularnych analogów w celu pozyskania dóbr i usług
Kultura in vitro
Kultura in vitro jest specyficznym sposobem uprawy materiału roślinnego w warunkach sterylnych, w różnego rodzaju pojemnikach.
Technika ta pozwala z małego fragmentu pobranego z organu rośliny uzyskać wzrost, rozmnożenie materiału i odtworzenie całej rośliny.
Technika in vitro znalazła zastosowanie do:
-otrzymywania form haploidalnych
rozmnażania wegetatywnego cennych materiałów
otrzymywania roślin wolnych od patogenów
kultury zarodków
kultury protoplastów (tworzenie mieszańców somatycznych)
selekcji w kulturach in vitro
produkcji metabolitów wtórnych, mikropropagacji i produkcji biomasy w bioreaktorach
otrzymywania roślin transgenicznych
Niezbędnymi warunkami prowadzenia kultury in vitro jest dobór właściwego materiału roślinnego, pożywki do jej uprawy i warunków zewnętrznych - oświetlenia i temperatury.
Redyferencjacja-
Bodźcem wyzwalającym odróżnicowanie w kulturach in vitro jest odizolowanie komórek i tkanek od rośliny matecznej oraz wpływ regulatorów wzrostu zastosowanych w pożywce
Haploidy - organizmy o gametycznej liczbie chromosomów
Monoploidy - haploidy powstałe z organizmu diploidalnego
Polihaploidy - haploidy powstałe z organizmu poliploidalnego
Rośliny haploidalne w kulturach in vitro można otrzymać poprzez:
kultury pylników i mikrospor
wykorystując zjawisko eliminacji chromosomów w zarodkach mieszańców oddalonych
wykorzystując geny stymulujące proces powstawania form haploidalnych
- metodami chemicznymi
Otrzymywanie haploidów w kulturach pylnikowych drogą androgenezy
Jest to proces złożony, zależny od wielu czynników:
stanu fizjologicznego rośliny, z której pobierane są pylniki
sposobu traktowania ściętych kłosów przed wyłożeniem pylników na pożywkę
stadium rozwojowego pyłku
komponentów pożywek indukcyjnych i regeneracyjnych
warunków fizycznych hodowli pylników
Istnieją dwa zasadnicze kierunki rozwoju androgenicznego
bezpośredni rozwój mikrospory w zarodek. W ciągu 4-8 tygodni z zarodków pojawiają się rośliny
pośredni poprzez kalus
Wykorzystanie form haploidalnych
Wykorzystanie form haploidalnych i linii podwojonych haploidów w hodowli umożliwia skrócenie cyklu hodowlanego oraz zapewnia homozygotyczność form wyjściowych
Haploidy można wykorzystać w hodowli roślin jeśli:
metodyka produkcji haploidów jest wydajna
rośliny haploidalne powstają w sposób losowy (odpowiadają losowej segregacji gamet)
znane są efektywne metody podwajania liczby chromosomów
Linie DH
Linie podwojonych haploidów (linie DH) są to formy powstałe w wyniku podwojenia liczby chromosomów u haploidów.
Podwajanie liczby chromosomów u haploidów przeprowadza się najczęściej przy użyciu kolchicyny.
Metody eliminowania wirusów
1.Kultura in vitro merystemów
2. Chemoterapia
3. Termoterapia
4. Krioterapia
W obrębie rośliny zainfekowanej znajdują się komórki, grupy komórek a nieraz tkanki, w których nie można wykryć wirusa. Możliwość uwolnienia od wirusów roślin rozmnażanych wegetatywnie zapoczątkowało lawinowy rozwój kultury merystemów. Opracowano procedury izolacji odpowiednio małych wierzchołków pędu
Etapy odwirusowywania roślin drogą izolowanych merystemów
1.Odkażanie materiału roślinnego
2.Inkubacja w temp. 18-22 stopni C na świetle
3.Pasaże co 2-3 tygodni
4.Przesadzanie roślin do ziemi
5.Testowanie na zdrowotność
Rodzaje kultury merystemów stosowane w procedurze odwirusowywania
1. Podział roślin na sadzonki węzłowe
Technika przydatna w masowej produkcji roślin ozdobnych i sadowniczych. Polega na pocięciu rośliny na fragmenty zawierające pęd z węzłem oraz znajdującymi się w węźle liśćmi oraz pąkami bocznymi. Uzyskane sadzonki węzłowe pasażuje się na kolejne pożywki.
Szeroko wykorzystywane w mikrorozmnażaniu Astromeria, Cymbidium, Gloriosa
2. Kultura poliferujących zarodków
Poprzez dodanie do pożywki cytokinin w dużym stężeniu uzyskuje się tzw. wieloroślinki. Ponowne podziały i pasaże pozwalają na uzyskanie tysięcy roślin potomnych.
Szeroko stosowana do rozmnażania Dianthus, Chrysanthemum, Rosa multiflora i wielu innych.
3. Za pośrednictwem kalusa
Wirusy uporczywe
Istnieją wirusy tzw. uporczywe, do których zwalczania konieczne jest zastosowanie w kulturach in vitro dodatkowo innych procedur.
Chemoterapia
Chemoterapia polega na dodaniu do pożywki tzw. antymetabolitów, czyli substancji o wysokiej aktywności przeciwwirusowej. Są to substancje włączające się w metabolizm wirusów i wywołujące zmiany w kodzie genetycznym RNA wirusowego, hamując ich rozmnażanie się.
Terapia in vitro
Pod wpływem długotrwałego działania podwyższoną temperaturą ( w granicach 26-45 stopni C. w czasie od 1-3 miesięcy) następuje inaktywacja wirusów w tkankach rośliny. Terapii cieplnej poddaje się całe rośliny lub ich organy wegetatywne. Po zakończeniu procesu termoterapii, z roślin tych pobiera się tkanki merystematyczne i dalej prowadzi kulturę in vitro w celu uzyskania roślin. Metoda ta znalazła zastosowanie między innymi do odwirusowywania chryzantem i goździków.
Krioterapia
Krioterapia - działanie niskimi temperaturami (0d +1-4 stopni)
Mikrorozmnażanie roślin na skalę wielkotowarową
Kwalifikowany materiał rozmnożeniowy
Uzyskany na drodze mikrorozmnażania materiał musi być wolny od patogenów.
Producent powinien wydać certyfikat międzynarodowy (ISO-9001 lub HACCP) gwarantujący jakość produktu jak i zachowania odpowiednich procedur w procesie produkcji
Materiał rozmnożeniowy musi spełniać jakościowe normy genotypu
OWT (oryginalność, wyrównanie, trwałość)
Prawidłowa kondycja roślin
Adaptacyjność rozwojowa
Zanieczyszczenia mikrobiologiczne eksplantatów
Patogeny (bakterie, mikoplazmy, grzyby)
Epifity zasiedlające powierzchnię organów:
mikoplazmy (charakteryzują się brakiem ściany komórkowej)
bakterie
grzyby
Bakterie epifityczne
Bakterie gramujemne na ogół stymulują mechanizmy odpornościowe roślin na niesprzyjające warunki środowiska, oraz mechanizmy obronne na patogeny grzybowe i bakterie
Występują zarówno pojedynczo jak i w grupach często w trudno dostępnych miejscach (pod łuskami przylistkami, w pąkach itp..). Trudne do dezynfekcji.
Endofity- grzyby i bakterie przeżywające większą część życia wewnątrz organizmów. Często uważa się, że żyją w symbiozie z rośliną.
Przykłady: bakterie tzw. brodawkowe (Acetobacter)
Bakterie wydzielające toksyczne dla owadów i nicieni metabolity (lolitrem B i ergowalinę). Ochraniają rośliny przed tymi organizmami
Zapobieganie infekcji materiału w stadium początkowym kultury in vitro
Pojawiające się w początkowym okresie kultury in vitro drobnoustroje na eksplantatach lub pożywce są wnoszone z eksplantatami
Zapobieganie : specjalne traktowanie roślin w fazie prekultury (poprzedzającej pobieranie eksplantatów), tzw. stadium „0”
„Punkty kontrolne” i etapy pracy w procesie mikrorozmnażania wielkotowarowego
1.Prekultury
2.Stabilizacja eksplantatów
3.Namnażanie eksplantatów
4.Przygotowanie do wzrostu in vivo
5.Aklimatyzacja
6.Testowanie
1.Prekultura - zespół zabiegów pozwalających otrzymać odmłodzone eksplantaty , częściowo lub całkowicie wolne od patogenów.
Selekcja wartościowych okazów, które będą podlegały klonowaniu
1. Zabezpieczenie roślin przed infekcją (opryski, sposób podlewania
2. Zidenyfikowanie bakterii i grzybów Test ELISA, PCR i inne)
3. Przygowanie rośliny , części roślin lub eksplantatów do kultury in vitro, termoterapia
4. Dezynfekcja powierzchniowa
5. Dezynfekcja wewnętrzna (np. zieleń malachitowa)
6. Stosowanie fungicydów i pestycydów
2. Stabilizacja eksplantatów
Cel: uzyskanie zdrowych eksplantatów poprzez zapobieganie infekcją.
Na tym etapie prac szczególną uwagę zwraca się na:
umiejętną sterylizację
sprawny sprzęt (kontrola sterylności pomieszczeń, stołów laminarnych)
eliminację eksplantatów zaatakowanych patogenami
indeksację roślin matecznych
Indeksacja roślin matecznych
Indeksację na obecność patogenów można przeprowadzać bezpośrednio na roślinach matecznych lub/i eksplantatach
Dwustopniowość kontroli poprzez testowanie roślin matecznych i test izolowanych z nich eksplantatów stanowi wystarczającą gwarancję , że nie będą namnażane tkanki z bakteriami wolno rosnącymi lub trudnymi do wykrycia
Na podstawie obecności bakterii lub grzybów w eksplantatach w fazie stabilizacji kultury można wnioskować stanie zdrowotności roślin donorowych.
Pozwala na eliminację z mateczników roślin chorych, a w szczególności roślin zainfekowanych patogenami kwarantannowymi (np. Phytophthora, Xanthomonas)
Indeksacja pozwala więc ograniczyć liczbę eksplantatów odrzucanych w procesie produkcji z powodu zainfekowania patogenami
Metody identyfikacji patogenów
obserwacje właściwości fizjologicznych i biochemicznych na pożywkach wybiórczo-różnicujących
testy bakteriologiczne oparte na wykorzystywaniu różnych źródeł węgla przez badane szczepy bakterii (kupuje się gotowe zestawy).
techniki oparte na markerach molekularnych (PCR)
3. Namnażanie roślin
Na tym etapie prac szczególną uwagę zwraca się na:
testowanie kultury in vitro na obecność patogenów (monitoring kultur)
kontrola procesu mikrorozmnażania (monitoring kultur)
Monitoring kultur
Produkcja wielkotowarowa musi być stale monitorowana mikrobiologicznie
Monitorowanie przeprowadza się poprzez testowanie fragmentów eksplantatów na specjalnej pożywce (pożywce testowej dla wykazania obecności bakterii lub grzybów). Test ten pozwala na ujawnienie 50-70% wniesionych do pożywki z eksplantatem drobnoustrojów
4. Biotyzacja
Biotyzacja- wprowadzenie do pozywki mikroflory korzystnej dla rozwoju roślin
5. Aklimatyzacja
Aklimatyzacja- przygotowanie roślin do wysadzenia w szklarnii
6. Kontrola stabilności genetycznej i zdrowotności dla uzyskania certyfikatu
Kultury protoplastów
Protoplastem nazywamy komórkę roślinną pozbawioną ściany komórkowej, najczęściej wskutek trawienia enzymami. Za pomocą łączenia protoplastów różnych gatunków można otrzymać mieszańce somatyczne między odległymi systematycznie roślinami.
Mieszańce somatyczne są to komórki i zregenerowane z nich rośliny otrzymane w wyniku fuzji protoplastów komórek somatycznych
Kultury protoplastów pozwalają na otrzymywanie mieszańców somatycznych nie tylko przez połączenie jąder komórkowych, ale również przez zlanie się cytoplazmy partnerów, wnoszące dodatkowo cechy dziedziczone plazmatycznie (poprzez informację zawartą w mitochondriach i chloroplastach).
W procesie otrzymywania mieszańców somatycznych wyróżniamy następujące etapy:
izolacja i zmieszanie ze sobą protoplastów form przeznaczonych do fuzji
fuzja protoplastów spowodowana czynnikami powodującymi bezpośredni kontakt błon protoplastów (czynnikami chemicznymi lub elektrofuzją), ich odwracalne niszczenie i odbudowanie
identyfikacja i selekcja komórek mieszańcowych
kultura in vitro komórek mieszańcowych i regeneracja roślin.
Bezpośrednio po fuzji cytoplazma komórek mieszańcowych zawiera wszystkie organelle obu komponentów fuzji. Z upływem czasu skład takiej komórki znacznie się zmienia, tak że w końcu powstają na ogół komórki o składzie genetycznym znacznie różniącym się od wyjściowego.
Selekcja w kulturach in vitro
Warunkiem skuteczności selekcji w kulturze in vitro jest występowanie korelacji między reakcją komórki lub tkanki w kulturze, a reakcją otrzymanej z niej rośliny. Selekcja jest prowadzona zazwyczaj przy użyciu czynnika selekcyjnego. W przypadku hodowli odpornościowej mogą być to np. mykotoksyny a hodowli na suszę określone sole.
Zalety selekcji w kulturze in vitro
możliwość oceny dużej liczby komórek lub osobników na małej powierzchni (przy założeniu iż istnieje szansa znalezienia korzystnego rekombinanta z częstotliwością 1:10000, u ogórka 10 płytek Petriego o średnicy 6 cm zastępuje 30 ha doświadczeń polowych)
możliwość badania wielu osobników równocześnie
uniezależnienie się od występowania interakcji genotypowo-środowiskowej
ochrona środowiska przed szkodliwością czynnika selekcyjnego.
Zmienność somaklonalna
Otrzymane w wyniku mikrorozmnażania rośliny z tego samego genotypu mogą fenotypowo różnić się od siebie przez pewien czas lub na stałe.
Zmienność somaklonalna - definicja
Pojawienie się nowych cech u roślin uzyskiwanych z kalusa w hodowli tkankowej. Zmienność taka jest wynikiem mutacji punktowych, translokacji chromosomowych.
Zmienność somaklonalna wywoływana kulturą in vitro jest indukowana na skutek wzrostu komórek, tkanek, zachodzenia procesu regeneracji itp. w oderwaniu od środowiska naturalnego jakim jest cały organizm rośliny
Źródła zmienności somaklonalnej
1. Zmienność w komórkach transplantatu pierwotnego
2. Zmienność wywołana kulturą in vitro
Zmienność w komórkach transplantatu pierwotnego
Eksplantaty mogą posiadać komórki o różnej ploidalności i zmutowane komórki somatyczne, które poza kulturą nie miałyby możliwości przekazania zmienionych cech drogą generatywną.
Podatność na zmienność somaklonalną
Podatność zależy od:
1.Gatunku rośliny
nie ulegają zmienności somaklonalnej lilia i hiacynt
podatne: tytoń, trzcina cukrowa
2. Ploidalności (poliploidalne łatwiej ulegają zmianą)
3. Fragmenty pobrane ze starszych fragmentów organów zwiększają częstotliwość pojawiania się zmienności somaklonalnej
4. Sposób prowadzenia kultury
Pasaże
Płynne pożywki
Regulatory wzrostu (szczególnie 2,4D)
Zmienność somaklonów charakteryzuje się dużą niestabilnością a kierunek zmian nie jest możliwy do przewidzenia.
Selekcja pozytywna jest wykorzystywana w hodowli dla poszerzenia zakresu zmienności genetycznej
Zmienność somaklonalna wywiera niekorzystny wpływ na proces uzyskiwania roślin modyfikowanych genetycznie (GMO)
Odmiany wyhodowane z wykorzystaniem zmienności somaklonalnej
Najwięcej odmian roślin ozdobnych z wykorzystaniem zjawiska zmienności somaklonalnej wyhodowano u D. Grandiflora, Ficus sp., Orchids sp., Pelargonium sp., Syringa.,
Linie DH
Linie podwojonych haploidów (linie DH) są to formy powstałe w wyniku podwojenia liczby chromosomów u haploidów.
Podwajanie liczby chromosomów u haploidów przeprowadza się najczęściej przy użyciu kolchicyny.
Kultura zarodków
Kultury zarodków wykorzystuje się w celu:
przerwania okresu spoczynku nasion
Przyspieszenia okresu rozwoju roślin
uzyskania roślin z nasion, których zarodki nie są zdolne do kiełkowania
otrzymania roślin mieszańcowych
otrzymania form haploidalnych
Przerwanie okresu spoczynku nasion
Okres spoczynku nasion jest cechą indywidualną i charakterystyczną dla danego gatunku. W rodzaju Irys okres spoczynku wynosi do kilkudziesięciu miesięcy. Przerwanie okresu spoczynku nasion można uzyskać między innymi poprzez izolację zarodków z nasion na pożywki sztuczne.
Przyspieszenie okresu rozwojowego roślin
Wykorzystanie kultury in vitro do przyspieszenia okresu rozwojowego roślin coraz powszechniej wykorzystuje się w rodzaju Rosa. Poprzez kulturę in vitro zarodków przyspiesza się kwitnienie i skraca cykl rozwojowy
Uzyskiwanie roślin z nasion, których zarodki nie są zdolne do kiełkowania
Często w nasionach mieszańcowych bielmo ulega znacznym zaburzeniom w swoim rozwoju. Zarodek pozbawiony substancji odżywczych jakich dostarcza bielmo nie ma w warunkach naturalnych żadnych szans rozwoju. Przeniesienie takiego zarodka na pożywkę sztuczną zastępującą bielmo pozwala uzyskać wiele różnych mieszańców międzygatunkowych lub haploidów. W przypadku roślin ozdobnych metoda ta znajduje zastosowanie w hodowli róż.
Inne zastosowania
- Otrzymywanie form haploidalnych
uzyskanie siewek z wielu drzew owocowych
ocena żywotności nasion między inymi roślin ozdobnych, krzewów i drzew owocowych
Kultura zalążków z zarodkami
W praktyce często zamiast izolować zarodki, przenosi się całe zalążki zawierające zarodki we wczesnych stadiach embriogenezy. W przypadku roślin ozdobnych technika ta znalazła wykorzystanie w takich gatunkach jak Pisum, Helianthus, Glycine. Technika ta jest szczególnie przydatna w produkcji siewek storczyków, z uwagi na bardzo małe nasiona tego gatunku.
Przykłady : Petunia, Alstromeria, Lilium, Helianthus, Glycine, Gossypium
Zapylanie in vitro zalążni i zalążków
Niezgodność gatunkowa często uniemożliwia uzyskanie metodami klasycznymi interesujących hodowcę form
Bariery niekrzyżowalności można omijać poprzez zapylanie in vitro zalążni lub zarodków
Pozwala to na:
* ominięcie barier samoniezgodności i uzyskanie nowych rekombinantów roślin
* uzyskanie poprzez indukcję partenogenezy form haploidalnych
Sposób postępowania:
Zapobieżenie niekontrolowanemu zapyleniu
Sterylizacja materiału (odpowiednich dla danego gatunku eksplantatów np. słupki, słupki z szypułką kwiatową i fragmentami okwiatu
Przygotowanie pyłku do zapylenia
Przykłady:Larix, Picea, Pinus, Cayophyllaceae, Liliaceae ,Malvaceae, Primulaceae
Kultura niezapłodnionych zalążków
Jest to metoda alternatywna do techniki uzyskiwania haploidów drogą androgenezy. Wykorzystuje się tu zjawisko gynogenezy, czyli rozwoju zarodków z niezapłodnionych komórek gametofitu żeńskiego w warunkach kultury in vitro zarodków). U roślin ozdobnych stosunkowo łatwo jest uzyskać haploidy tą techniką u gerbery
Sztuczne nasiona
Produkt składający się z zarodka somatycznego lub zaczątku rośliny umieszczony w osłonce ochraniająco - odżywczej, zdolny do regeneracji roślin na skale komercyjną.
Najczęściej występują jako toczkowane odwodnione zarodki somatyczne lub uwodnione zarodki w otoczce hydrożelowej