Mrożenie nasienia u Bo
Rozrzedzalniki:
1. Cytrynianowo-żółtkowo-
glicerolowy
2H2O cytrynian sodu 2,9% 76 ml
fruktoza 1,25 g
glicerol 4 ml
żółtko 20 ml
2. Laktozowo-żółtkowo- glicerolowy
laktoza 76 ml
fruktoza 1,25 g
glicerol 4 ml
żółtko 20 ml
Metody konserwacji nasienia buhaja w niskich temp.:
1. Metoda ampułkowa
2. Cassou (słomkowa)
3. Minitub
4. Kulkowa (japońska)
1. Met. ampułkowa
-pobranie, ocena nasienia
-rozrzedzenie wstępne 1:1
-schłodzenie do temp. pokojowej przez 10 minut
-rozrzedzenie ostateczne: w 1 ml 20mln plemników, po rozmrożeniu zazwyczaj pozostaje 8-10mln plemników o ruchu prawidłowym
-automatyczne napełnienie ampułek i „zatopienie” (w czasie do 10 minut)
-ekwilibracja (przystosowanie) w temp 0-4 ºC - przez 6 godzin
-obniżanie temp. sterowane elektronicznie w tempie:
*10ºC/minutę do 3ºC
*4ºC/minę do -26ºC
*5ºC/minutę do -76ºC/minutę - temp. „suchego lodu”
*zanurzenie ampułek w ciekłym azocie -196ºC
*rozmrażanie: 40ºC/ 50 sekund (łaźnia wodna)
2.Metoda słomkowa
Sporządzenie rozrzedzalnika
-opakowanie (52 g proszku) do 1 cylindra z 400 ml wody 42ºC
-do 2 cylindra 109 ml H2O redestylowanej, 50 ml żółtka, 17 ml glicerolu,podgrzać do 40ºC i rozmieszać
-zawartość obu cylindrów połączyć 1 plus 2 = 576 ml rozrzedzalnika nr 1 z 3% zawartością glicerolu
-z powyższego roztworu pobrać 276 ml płynu i dodać do niego 24 ml glicerolu - (11% rozwór glicerolu - rozrzedzalnik nr 2
-mamy po 300ml 2 rozrzedzalników z 3 i 11% zaw. glicerolu
-rozrzedzalnik 3% służy do rozrzedzenia wstępnego 1:1 lub 1:3
-po 2 minutach rozrzedzenie tym samym do połowy rozrzedzenia końcowego
-schłodzenie roztworu nasienia przez 1 godzinę do 5ºC
-rozrzedzenie ostateczne rozrzedzalnikiem nr 2 z 11% zawartością glicerolu w 3 lub 2 porcjach w odstępach 15 minut tak, aby w 0,25 ml dawki inseminacyjnej było 8-10mln plemników
-ekwilibracja w 5ºC rozrzedzonego nasienie przez 4h
-automat napełnia po 3 słomki
-drugi koniec słomki zamykany ultradźwiękami
-słomki „wędrują” na 9 min do -130ºC (5 cm nad lustrem LN2)
-słomki pakuje się do gobleów i transportuje do kontenerów z LN2
-rozmrażanie- 15 sekund 37ºC
3.Metoda Minitub
-świeży ejakulat na 16 minut do łaźni o temp. 27ºC
-następnie na 5 minut do łaźni o temp. 23ºC
-w tej temp. podajemy rozrzedzalnik nr 1 w objętości równej objętości nasienia, a następnie
-rozrzedzalnik nr 2 w objętości równej objętości rozrzedzalnika nr 1
-Rozrzedzalniki podaje się wolno „pipetując”.
-Porcjowanie i napełnianie minitubek w temp. pokojowej
-pęcherzyk powietrza w środku minituby
-ekwilibracja w temperaturze 5ºC przez 4 godziny
-5 rureczek w 1 koszyczku
-zamrażanie w parach ciekłego azotu -130ºC przez 20min na rusztach 5 cm nad lustrem LN2
-gromadzi się po 300 rurek w pojemniku (goglecie)
-Rozmrażanie -10 sekund w temp. 40 ºC
-Unasiennianie -Pipetą inseminacyjną (pistoletem inseminacyjnym) ze specjalnym zakończeniem uniemożliwiającym wyciśnięcie minituby
4. Metoda kulkowa (japońska)
-rozrzedzenie nasienia 1:1 lub 1:3 np. cyrynianowo-żółkowo-frukozowym lub innym
-ekwilibracja w 4 ºC przez 4-6 godzin
-nakrapianie nasienia na płycie suchego lodu
-objętość kulki 0,25 ml o koncentracji 20-30mln plemników
-po 5 minutach wysypanie drażetek do ciekłego azotu
-kuleczki zbieramy do oznakowanych pojemników i składujemy w kontenerze
-ginie około 50 - 70% plemników
-dawka jest dobra jeśli po rozmrożeniu 30% komórek porusza się ruchem postępowym
-rozmrażanie kulki w 1,2 ml płynu fizjologicznego lub 2,9% cytrynianu sodu
-inseminacja jak przy konserwacji w stanie płynnym -AI tuż lub w czasie owulacji