Piotr Domański 14.10.2008

Laboratorium z biochemii

Aminokwasy

1. Podstawy teoretyczne

• Aminokwasy są to związki organiczne zawierające dwie grupy funkcyjne: aminową (-NH₂) oraz karboksylową (-COOH).

• Podstawową funkcją aminokwasów w przyrodzie jest tworzenie białek. Te aminokwasy, które biorą udział przy tworzeniu białek nazywa się proteinogennymi, a pozostałe nieproteinogennymi.

• Wszystkie aminokwasy proteinogenne oprócz proliny posiadają jednakową strukturę cząsteczki, którą można przedstawić za pomocą ogólnego wzoru:

Gdzie `R' oznacza łańcuch boczny

• Aminokwasy proteinogenne są pierwszorzędnymi aminami z wyjątkiem proliny i hydroksyproliny, ich podstawowe dwie grupy funkcyjne (aminowa i karboksylowa) są przyłączone do węgla w pozycji alfa oraz posiadają konfigurację przestrzenną izomerów L.

• Właściwości chemiczne łańcucha bocznego `R' pozwalają podzielić aminokwasy na: niepolarne; polarne lecz nie zjonizowane; kwasowe i zasadowe.

• Aminokwasy mają właściwości amfoteryczne ulegają zatem dysocjacji i w zależności od odczynu środowiska występują w różnych postaciach. Każdy aminokwas posiada charakterystyczną dla siebie wartość pH zwaną punktem izoelektrycznym. Gdy pH odpowiada wartością punktowi izoelektrycznemu to aminokwas występuje jako jon obojnaczy, gdy pH jest niższe od wartości punktu izoelektrycznego występuje w postaci kationu, a gdy wyższe w postaci anionu.

• Dla większości aminokwasów punkt izoelektryczny przyjmuje wartości pomiędzy pH 5-6. W tym punkcie aminokwasy wykazują najsłabszą rozpuszczalność oraz najmniejsze przewodnictwo elektryczne.

2. Część doświadczalna

1. Amfoteryczne właściwości aminokwasów

Sposób wykonania: szczyptę krystalicznej L-tyrozyny rozpuściłem na ciepło w kilkunastu kroplach roztworu HCl 0,1 M, następnie ochłodziłem zawartość probówki pod strumieniem zimnej wody i dodałem kilka kropel roztworu NaOH 0,05 M aż do momentu wytrącenia się osadu, po czym dodałem kolejną porcję roztworu zasady.

Obserwacje: L-tyrozyna rozpuszcza się w roztworze kwasu na ciepło, przy określonej wartości pH wytrąca się w postaci białego osadu, a w roztworze zalkalizowanym ponownie rozpuszcza.

Wnioski: L-tyrozyna posiada właściwości amfoteryczne.

2. Metody oznaczania aminokwasów

1. Metody ogólne:

1. Odczyn ninhydrynowy

Sposób wykonania: Do 0,5 ml roztworu badanego aminokwasu dodałem identyczną objętość odczynnika ninhydrynowego, a następnie ogrzewałem mieszaninę w łaźni wodnej przez 15 minut w 100^oC. Równolegle wykonałem próbę odczynnikową.

Obserwacje: w obecności L-glicyny mieszanina po ogrzaniu barwi się na granatowo; w obecności L-tryptofanu na brudno zielony; w obecności L-tyrozyny na czerwono; w obecności L-histydyny na niebiesko; w obecności wyłącznie wody destylowanej mieszanina jest bezbarwna.

Wnioski: Ninhydryna może służyć do wykrywania obecności aminokwasów w roztworze z wyjątkiem proliny, nie posiadającej wolnej grupy aminowej.

2. Reakcja z kwasem azotawym (wg. Van Slyke'a)

Sposób wykonania: Do 2 ml roztworu NaNO₂ dodałem 2 ml roztworu CH₃COOH, wymieszałem, następnie wprowadziłem roztwór badanego aminokwasu. Równolegle wykonałem próbę dla białka oraz próbę odczynnikową.

Obserwacje: Po wprowadzeniu do przygotowanej mieszaniny azotynu i kwasu octowego roztworu badanego aminokwasu (zarówno dla L-glicyny i L-tryptofanu) zaobserwowałem powstawanie w probówce pęcherzyków gazu, czyli ulatnianie się azotu z roztworu; w przypadku roztworu białka wynik był identyczny; w przypadku próby odczynnikowej nie zaobserwowałem żadnych oznak reakcji chemicznej w probówce.

Wnioski: Reakcja z kwasem azotawym może służyć do wykrywania obecności aminokwasów w roztworze. Metoda ta pozwala również wykryć białka.

2. Metody wybiórcze:

1. Reakcja ksantoproteinowa

Sposób wykonania: Do 1 ml roztworu badanego aminokwasu dodałem 0,5 ml stężonego HNO₃, ogrzewałem próbkę w łaźni wodnej przez 30 sekund, następnie schłodziłem pod strumieniem zimnej wody i zalkalizowałem 30% roztworem NaOH.

Obserwacje: W przypadku zarówno L-tyrozyny i L-tryptofanu roztwór po ogrzaniu barwi się na pomarańczowo, a po zalkalizowaniu lekko ciemnieje; w przypadku L-glicyny nie zaobserwowałem objawów reakcji.

Wnioski: Reakcja ksantoproteinowa może służyć do wykrywania obecności aminokwasów aromatycznych w roztworze.

2. Reakcja Millon'a (charakterystyczna dla tyrozyny)

Sposób wykonania: Do 0,5 ml roztworu L-tyrozyny dodałem 0,5 ml odczynnika Millon'a, następnie ogrzewałem roztwór w łaźni wodnej.

Obserwacje: po dodaniu odczynnika Millon'a do roztworu L-tyrozyny roztwór pozostaje bezbarwny natomiast po ogrzaniu barwi się na czerwono.

Wnioski: Reakcja Millon'a może służyć do wykrywania obecności L-tyrozyny w roztworze.

3. Reakcje charakterystyczne dla tryptofanu:

1. Odczyn aldehydowy wg. Rosenheim'a

Sposób wykonania: Do 1 ml roztworu L-tryptofanu dodałem 3 krople aldehydu mrówkowego, 1 ml stężonego kwasu siarkowego oraz 2 krople nasyconego roztworu siarczanu rtęci, a następnie dokładnie wymieszałem.

Obserwacje: Po dodaniu nasyconego roztworu siarczanu rtęci i wymieszaniu roztwór był niemal czarny.

Wnioski: Opisana powyżej próba może służyć do wykrywania obecności L-tryptofanu w roztworze.

2. Reakcja wg. Adamkiewicza

Sposób wykonania: Do 1 ml L-tryptofanu dodałem 1 ml kwasu glioksalowego, dokładnie wymieszałem, a następnie ostrożnie po ściance probówki dodałem 1 ml stężonego kwasu siarkowego.

Obserwacje: Na granicy warstw pojawiła się ciemnofioletowa obrączka.

Wnioski: Opisana powyżej próba może służyć do wykrywania obecności L-tryptofanu w roztworze.

1. Odczyn Pauly'ego dla histydyny

Sposób wykonania: Do 1 ml L-histydyny dodałem 2 ml roztworu kwasu sulfanilowego oraz 1 ml roztworu azotynu sodu. Całość wymieszałem i dodałem 1 ml 30% roztworu NaOH

Obserwacje: Roztwór zabarwił się na karminowo.

Wnioski: Opisana powyżej próba może służyć do wykrywania obecności L-histydyny w roztworze.

2. Reakcja cystynowa

Sposób wykonania: Otrzymaną próbkę L-cysteiny rozpuściłem w 0,5 ml wody, po czym dodałem kilka kropli roztworu octanu ołowiałego i 1 ml 30% roztworu NaOH, a następnie ogrzewałem próbkę przez ok. 30 minut w łaźni wodnej.

Obserwacje: Po ogrzaniu z roztworu wytrącił się szaro-czarny osad.

Wnioski: Reakcja cystynowa może służyć do wykrywania obecności L-cysteiny w roztworze.

3. Zadanie

Po otrzymaniu roztworu do badania zacząłem od wykonania próby z użyciem ninhydryny, która dała wynik negatywny. Dla upewnienia się wykonałem również próbę z użyciem kwasu azotawego, która również dała wynik negatywny. Wyniki obu prób świadczyły o tym, że otrzymanym roztworem do badania była woda.

---