Reakcja łańcuchowa polimerazy w skrócie PCR to reakcja służąca do amplifikacji (namnożenia) wybranego fragmentu DNA in vitro czyli w warunkach laboratoryjnych, polegająca na sekwencji wielokrotnego podgrzewania i oziębiania próbki. Technika wynaleziona w 1983 roku przez Kary Mullisa i współpracowników z kalifornijskiej firmy Cetus.
Do reakcji wprowadza się matrycowy DNA, trifosforany deoksyrybonukleotydów, startery (primery) oraz termostabilną polimerazę (np. polimeraza Taq wyizolowana z bakterii Thermus aquaticus lub polimeraza Pfu z bakterii Pyrococcus furiosis oraz inne polimerazy, będące z reguły modyfikacjami wyżej wymienionych). Startery (primery) są krótkimi (zazwyczaj 18-24 nukleotydów długości), jednoniciowymi fragmentami DNA, które łączą się z komplementarnym fragmentem DNA i umożliwiają polimerazie DNA rozpoczęcie reakcji.
Pierwszym etapem reakcji jest denaturacja podwójnej helisy DNA, która zachodzi w temperaturze ok. 95˚C. Następnie temperatura jest obniżana do ok. 50˚C, co umożliwia połączenie się starterów z komplementarnymi sekwencjami. W końcu, temperatura jest podnoszona do ok. 72˚C, następuje przyłączenie się kompleksu z polimerazą DNA i rozpoczyna się reakcja polimeryzacji, w wyniku której powielany jest fragment zawarty pomiędzy dwoma primerami. Ta sekwencja cykli jest powtarzana wiele razy, w zależności od ilości materiału, który chce się uzyskać. Następnie zostaje sprawdzona „czystość” sekwencji (np. przez elektroforeze czy spektrofotometrie przy długości fali 260-280nm)
Metoda PCR znajduje wiele zastosowań, m.in.
- Klonowanie genów,
- Diagnostyka kliniczna,
- Identyfikacja osób zaginionych,
- Kryminalistyka,
- Prace nad gatunkami, które wyginęły.
Stosuje się również modyfikacje metody PCR m.in:
PCR-DGGE - Elektroforeza w żelu z gradientem czynnika denaturującego (ang. Denaturating Gradient Gel Electrophoresis - DGGE) - Jest to jedna z metod identyfikacji i badań mikroorganizmów jak również przesiewowego wykrywania mutacji punktowych.
Badany DNA jest uzyskuje się z zastosowaniem metody amplifkacji PCR z zastosowaniem specjalnych starterów bogatych w sekwencje GC (ang. GC clamp); Przed elektroforezą produkty PCR poddaje się denaturacji a następnie renaturacji (losowej);
W trakcie elektroforezy dwuniciowego DNA w żelu poliakrylamidowym o wzrastającym stężeniu związku denaturującego (formamid, mocznik) niektóre fragmenty DNA ulegają niepełnemu rozdzieleniu na pojedyncze nici (denaturacja) przy niższym, a inne fragmenty przy wyższym stężeniu czynnika denaturującego;
Całkowitemu rozdzieleniu się podwójnej nici zapobiegają fragmenty GC clamp;
W momencie rozdzielania się nici (denaturacja) ich przemieszczanie w żelu zostaje gwałtownie przyhamowane;
Moment denaturacji fragmentu DNA zależy od jego budowy (składu zasad i długości). Im silniejsze wiązanie obu nici DNA, tym dalej wędruje w żelu denaturacyjnym
RT-PCR (Reverse Transcription) modyfikacja polegająca na użyciu mRNA jako matrycy. Synteza DNA na matrycy mRNA odbywa się przy użyciu odwrotnej transkryptazy (RT). Metoda ta pozwala na amplifikację wyłącznie sekwencji zawartej w dojrzałym mRNA, a więc tylko egzonów. Powstały DNA określany jest jako cDNA - komplementarny DNA.
Real time PCR - do środowiska rekacji wprowadzane są znakowane (np. barwnikami fluorescencyjnymi) nukleotydy, bądź sondy łączące się z DNA, które pozwalają na podstawie odczytów w kolejnych cyklach określić ilość matrycy użytej do reakcji, jak również śledzić ilość powstającego produktu.
Istnieje jeszcze kilkanaście innych modyfikacji metody PCR: PCR-RFLP, RG-PCR, ACRS-PCR, ARMS-PCR, ASA-PCR, PCR-ASO, PCR-HD, PCR-SSCP, PCR-DGGE, PCR-TGGE, inversed PCR, PCR-OLA, PCR-CCM, PCR-PTT.
Kolejne etapy w technice PCR
1. Izolacja DNA
2. Denaturacja DNA (t = 92-94 °C)
3. Wiązanie starterów (fragmenty 20-nukleotydowe komplementarne do końca 3' DNA dla
polimerazy DNA termostabilnej) w temp. 40-60 °C
4. Synteza DNA (t = 72 °C)
5. Sprawdzanie „czystości” uzyskanych sekwencji (elektroforeza, spektrofotometria przy
długości fali 260-280nm)
6. Czynność 2, 3, 4 - powtarzamy cyklicznie 20-25x
PCR-DGGE (elektroforeza w gradiencie żelu denaturującego)
PCR
Elektroforeza w gradiencie czynnika denaturującego
Wzrost gradientu czynnika denaturującego
Im silniejsze wiązanie obu nici DNA, tym dalej wędruje w żelu denaturacyjnym
Denaturing gradient gel electrophoresis
Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) works by applying a small sample of DNA (or RNA) to an electrophoresis gel that contains a denaturing agent. Researchers have found that certain denaturing gels are capable of inducing DNA to melt at various stages. As a result of this melting, the DNA spreads through the gel and can be analyzed for single components, even those as small as 200-700 base pairs . Further explicating how this technique works one author notes that what is unique about the DGGE technique is that as the DNA is subjected to increasingly extreme denaturing conditions, the melted stands fragment completely into single strands. This process is unique because it stands in direct contrast to how DNA denatures in vivo . "Rather than partially melting in a continuous zipper-like manner, most fragments melt in a step-wise process. Discrete portions or domains of the fragment suddenly become single-stranded within a very narrow range of denaturing conditions" (Helms, 1990). Because of this distinctive quality of DNA when placed in denaturing gel, it is possible for researchers to discern differences in DNA sequences or mutations of various genes: Sequence differences in otherwise identical fragments often cause them to partially melt at different positions in the gradient and therefore "stop" at different positions in the gel. By comparing the melting behavior of the polymorphic DNA fragments side-by side on denaturing gradient gels, it is possible to detect fragments that have mutations in the first melting domain (Helms, 1990). Placing two samples side-by-side on the gel and allowing them to denature together, researchers can easily see even the smallest differences in two samples or fragments of DNA. The principles outlined above provide a rudimentary understanding of how DGGE serves to differentiate between various fragments of DNA. Although the technique for procuring finished gels that can be utilized for investigative research requires several more steps (such as amplification of the samples from the gel), one can easily understand how denaturing gels work to fragment DNA and divide components based on the amount of denaturing that has taken place.