Ćwiczenie 6

Transformacja bakterii, kolokwium zaliczeniowe

Materiały i odczynniki:

Komórki DH5, kompetentne

Mieszaniny ligacyjne z poprzedniego ćwiczenia

Pożywka do hodowli bakterii (LB) o składzie: Bakto-trypton 1%

Bakto-ekstrakt drożdżowy 0.5%

NaCl 1%

Szalki z agarem i ampicyliną (pożywka selekcyjna) o składzie: Bakto-trypton 1%

Bakto-ekstrakt drożdżowy 0.5%

NaCl 1%

Bakto-agar 1.5%

Ampicylina 50 μg/ml

Sterylne probówki 15 ml

Głaszczki

Łaźnie wodne

Wykonanie ćwiczenia

Wszelkie manipulacje z bakteriami wymagają zachowania sterylności

1. Przygotowane zawiesiny komórek przenieść do dwóch probówek umieszczonych
   w lodzie, dodać do jednej 50 μg mieszaniny ligacyjnej (grupy parzyste 3:1 i grupy nieparzyste 5:1), do drugiej:
   sekcje 1,4, 7 i 10 - 10 l świeżej pożywki
   sekcje 2,5, 8 i 11 - 50 g DNA plazmidowego nietrawionego enzymem
   sekcje 3,6, 9 i 12 - komórki zawierające plazmid (z banku)
   delikatnie wymieszać, zostawić na 30 minut w lodzie.

2. Przenieść probówki na dokładnie 90 sekund do łaźni wodnej ustawionej na 42⁰C.
   Nie mieszać.

3. Przenieść do lodu na 2 minuty.

4. Dodać po 800 μl świeżej pożywki i wstawić na 45 minut do wytrząsarki ustawionej na 37⁰C
   i łagodne wytrząsanie.

5. Przenieść po 60 μl stransformowanych komórek na 1/2 agaru zawierającego ampicylinę, rozprowadzić głaszczką. Na drugą część szalki należy nanieść:
   sekcje 1,4, 7 i 10 - niestransfomowane komórki DH5  z drugiej probówki.
   sekcje 2,5, 8 i 11 - komórki stransformowane samym plazmidem z drugiej probówki.
   sekcje 3,6, 9 i 12 - komórki zawierające plazmid z drugiej probówki.
   
   Szalki należy bardzo dokładnie opisać na wieczku, kreśląc oznaczenia na bocznych ścianach szalek!

6. Zostawić w temperaturze pokojowej do wchłonięcia cieczy, następnie odwrócić i wstawić do cieplarki (bez wytrząsania).
   

Sprawozdanie z trzech ćwiczeń: 4-6

1. Opis doświadczenia z wszystkimi obliczeniami i zdjęciem żelu oraz szalek z wyrosłymi koloniami.

2. Analiza wyników:

1. Na połówkach szalek zawierających komórki DH5 bez plazmidu nie powinno nic wyrosnąć (dlaczego?).

2. Na połówkach szalek zawierających komórki z plazmidem powinno wyrosnąć bardzo dużo kolonii.

3. Na połówkach szalek zawierających komórki DH5 transformowane całym plazmidem powinno wyrosnąć ok. 100x mniej komórek, niż w pkt. b.

4. Na połówkach szalek zawierających komórki DH5 transformowane plazmidem
   ze wstawką powinny wyrosnąć nieliczne kolonie (dlaczego?)

---