Ćwiczenie 1
Izolacja jąder komórkowych i ekstraktów jądrowych
Przygotowanie teoretyczne:
Budowa komórki (szczegółowo)
Metody lizy komórek (nie tylko zwierzęcych)
Zadania
A. Materiały:
zamrożone komórki z hodowli
PBS (phosphate buffered saline - sól fizjologiczna w buforze fosforanowym):
13.7 mM NaCl
0.27 mM KCl
0.43 mM Na2HPO4
0.14 mM KH2PO4
wirówka stołowa wychłodzona w witrynie/wirówka z chłodzeniem
bufor do izolacji EC (ekstraktu cytoplazmatycznego)
20 mM Tris:HCl pH 7.6 (bufor)
10 mM KCl
2 mM MgCl2
1 mM ditiotreitol [DTT] (substancja redukująca)
0.5 mM EDTA (chelator jonów II-wartościowych)
0.5% NP40 (niejonowy detergent)
2.5% glicerol (substancja zagęszczająca)
Mieszanina inhibitorów proteaz (hamują działanie enzymów proteolitycznych)
bufor niskosolny (0.02 M NaCl) (low)
20 mM Hepes pH 7.9
25% glicerol
1.5 mM MgCl2
0.02 M NaCl
0.2 mM EDTA
Mieszanina inhibitorów proteaz
bufor wysokosolny I (0.8 M NaCl) (high 0.4)
20 mM Hepes pH 7.9
25% glicerol
1.5 mM MgCl2
0.8 M NaCl
0.2 mM EDTA
Mieszanina inhibitorów proteaz
wytrząsarka
mikroskop optyczny, szkiełka podstawowe i nakrywkowe
0.4% fiolet krystaliczny do barwienia komórek
B. Wykonanie:
Wszystkie czynności należy wykonywać w lodzie, lub szafie chłodniczej
Wszystkie probówki należy dokładnie opisywać wpisując grupę, sekcję, datę i nazwę preparatu!
Probówki należy opisywać przed dodaniem preparatu
Preparaty wyizolowane na ćwiczeniach będą potrzebne do następnych zajęć!
Zamrożone komórki rozmrozić w lodzie, zawiesić w 500 μl PBS 1x, zmierzyć objętość (potrzebna do obliczenia objętości komórek), zanotować. Obliczyć objętość samych komórek.
Odpipetować 10 μl do osobnej probówki (podpisać „komórki”), resztę odwirować
10 minut, 180-186xg (RCF).
Ściągnąć i odrzucić supernatant, osad komórek zawiesić w 5-krotnej objętości buforu
do izolacji EC. Probówkę inkubować 10 minut w lodzie kilkakrotnie mieszając.
Po inkubacji komórki lekko wytrząsnąć i odwirować 10 minut, 300-321xg (RCF).
Zebrać supernatant do osobnej probówki (podpisać: EC = ekstrakt cytoplazmatyczny).
Osad zawiesić w trzech objętościach buforu niskosolnego (po konsultacji z prowadzącym ćwiczenia).
Ostrożnie zmierzyć objętość, odpipetować 10 μl zawiesiny do osobnej probówki (podpisać „jądra”).
Do reszty dodać równą objętość buforu wysokosolnego „high 0.8”
Mieszaninę wytrząsać 30 minut w 40C, a następnie odwirować na maksymalnych obrotach przez 30 minut.
W czasie inkubacji odpipetowane wcześniej komórki i jądra obejrzeć pod mikroskopem (kroplę zawiesiny nanieść na szkiełko podstawowe, dodać barwnika [fiolet krystaliczny], nakryć ostrożnie szkiełkiem nakrywkowym). Obrazy narysować w dzienniku laboratoryjnym.
Po zakończonym wirowaniu wyjąć probówki, delikatnie ściągnąć supernatant i przenieść do nowej probówki (podpisać: EJ 0.4 M = ekstrakt jądrowy). Zmierzyć i zapisać objętości preparatów.
Przygotować 2 probówki, do każdej z nich odpipetować po 798 l H2O. Odpipetować po 2 l ekstraktów białkowych: do probówki 1 - EC, do probówki 2 - EJ 0.4 M. Dodać po 200 l odczynnika Bradforda, wymieszać, po ok. 5 minutach zmierzyć stężenie białek przy użyciu spektrofotometru (próba ślepa: H2O + odczynnik Bradforda, jedna na grupę).
Do obliczeń stężenia białka skorzystać ze wzoru:
C [μg/μl] = A595 x b : c
gdzie b jest współczynnikiem wyznaczanym z krzywej wzorcowej i wynosi 16.2,
a c jest ilością białka pobranego do pomiaru (tu: 2 μl)
Preparaty - ekstrakty cytoplazmatyczne i jądrowe zamrozić w suchym lodzie i przenieść do zamrażarki.
W sprawozdaniu należy umieścić:
Krótki opis procedury, z uwzględnieniem mierzonych objętości komórek i preparatów.
W wynikach:
Rysunki preparatów komórkowych i jąder. Należy zwrócić uwagę, czy udało się wyizolować jądra komórkowe.
Wyniki pomiaru stężeń preparatów białkowych, obliczenia stężenia białka
(czyli ilości g/l) oraz całkowitej ilości białka w preparacie (stężenie x objętość preparatu). Te same informacje muszą się znaleźć w dzienniku laboratoryjnym, będą potrzebne na kolejnych ćwiczeniach!
3. We wnioskach: porównać własne wyniki z przewidywaną wydajnością (ze 100 l komórek powinno się uzyskać około 2 mg białka w EC i około 600 g białka w 0.4 M EJ), wyjaśnić ewentualne rozbieżności (należy wziąć pod uwagę obrazy mikroskopowe).