2012-01-04
Reakcje enzymów z wieloma substratami
(woda może być traktowana jako drugi substrat)
Przeważająca większość reakcji enzymatycznach przebiega przy udziale co najmniej dwuch substrató i powstaje w nich więcej niż jeden produkt
nomenklatura
A → P uni uni
A+B → P bi uni
A+B → P1+P2 bi bi
A+B+C → P1+P2 ter bi
W reakcji przenoszenia grup:
E+AX+B → E+A+BX która przebiega wg mechanizmu bi bi powstają pytania:
Czy pierwszy substrat wiąże się z enzymem i opuszcza kompleks zanim drugi substart zostanie zwiazany?
czy substarty wiążaą się w kolejności przypadkowej czy uporządkowanej?
czy grupa X jest przenoszona bezpośrednio z A do B czy...
te mechanizmy nazwano tak:
sekwencyjny uporządkowany
sekwencyjny przypadkowy
powdwójnego przeniesienia czyli ping pong bi bi
sekwencyjny - najpierw wiażą się substraty z enzymem zanim zostanie uwolniony jakikolwiek produkt
pirogronian --- (dehydrogenaza pirogronianowa fermentacja mlekowa) → mleczan
dehdro +NADH+pirogronian → enzym- NADH-pirogronian ->enzym - mleczan NAD → mleczan + nukleotyd
przypadkowy: kreatyna → fosfokretatyna
enzym |+kreatyna → e- E- kreatyna-ATP → ...
+ATP
reakcje podwujnego przeniesienia ping pong:
przynajmniej jeden z produktuw jest uwalniany przed związaniem wszystkich substratów przez enzym
przenoszenie grup aminoweych między aminokwasami i ketokwasami (aminotrafsferaza asparaginowa)
Po związaniu Asp enzym usuwa się z niego grupę aminową i wiąże ją tworząc formę pośrednią enzymu z podstawioną grupą. następnie uwalnia się pierwszy prodkut szczawiooctan Drugi substrat 2-oskogrutaran wiąże się do zmodyfkiowania enzymu i przyjmuej od niego grupę aminową następnie zostaje uwolnniony glutanian jako ostateczny produkt rakcji
W praktyce labolatoryjnej gdy badami kinetykę rakcji dwusubstratowej sprawdzamy ukąłd doświadczalny do warunków reakcji jedsubstratowej opiswanej kinetyką M-M Używamy stezenai wycycajacego dla jednego substratu a drugi substrat stosujemy w stezeniach wymagancyh do wyznacznai Km i V max Wtedy znajdowane Km jest Km app to samo czynimy dla drugiego substratu i wsyznaczoamy dla niego Km
czynniki wpływające na szybkość reakcji
Ze zwiększeniem stęż enzymu zwiększa się szybkość i absorbacja przestanie być liniowa bo znacząco zmienisza się stęzenie substratu
Może sugerować błędnie rakcje z inhibitorem
Pomiary szybkośći początkowej są wiarygodne gdy zużycie substratu nie przekracza 10%
Ogólnie najlepsza zdolność buforowania jest o jednostę powyżej i poniżej pKa
Rozcieńczone bufory zmienaiją pH w niewielkim stopniu w stosunku do roztworu wyjściowego ale trzeba to sprawdzać tym bardziej że temperatura zmienia pKa buforu Trzeba kalibrować pH-metr na temperaturę w ktroej prowadzi się pomiar. Jeśli mierzymy wpyw temperatruy na aktywność enzymu (oczwiście w stałym pH) to trzeba wybrać bufor PIPES, MOPS o niskiej wartości delta pKa/°C
(woda destylowana jest kwaśna)
Sprawdzając wpływ pH na szybkość reakcji enzymatycznej. Trzeba przygotwoać różne bufory o nadkąłdających się stezenaich i sprawdzić czy ich ich skad nie zmienai syzbkości reakcji
Wyznaczanie energii aktywancji
Jeśli wykreślilismy log (kcat( reakcji w zależności od 1/2,3RT to otrzymamy linię prosta o nacyleniu -Ea Energia aktywacji będzie w kcal/mol w mc Kcat możemy wstawić V max gdyż Vmax = k2 [Et]
wykres Arheniusa
pozwala wyznaczyć w przypadku stało i zmienno cieplnych zwirząt - energai aktywancji ich enzymów
Większość pomiarów prowadzi się w 28 lub 37 °C (w zależności od enzymu)
(substart rozpoczoynający reakcje powinien być ogrzany
enzymy dodajemy w ilośći 10-50 µl/1ml mieszaniny o rwónoważonej temperaturze wtedy enzym ogrzeewa się w trakcjie miesznaia
Wyrażanie aktywnośći enzymów
w jednostkach międzynarodowcy lub jed/mg białka - aktywność specyficzna (właściwa)
liczba obrotów (aktywność cząstekczowkao to liczba moli substrató przemienieonego w ciągu min przez mol enzymu (jednostki / µ mol enzymu)
stężenie substartu w nieoczyscoznycm preparacej podaje się jako specyficzną aktywność (jed/mg białak Miesrzym się ją przy nasycającym seżeniu substartu (v~V max) i optymalnych warunkach pH i temp dla makymalnej aktywności
warunki optyamalne do stabliności (przechowaywania) nie są toższame z warunkami reakcji
w glicerolu
szybko zamrozić
rozmarażanie powoli
stabilność enzymów
do przechowywania enzymó dobre są poli propylenowej polietylenowe Żeby zminiwalizoawć adsorpcje do roztworu enzymu dodaje się baiłek inernych w stężeniu dużo większym niż enzym