Laboratorium „Inżynieria bioreaktorów” dla kierunku „Biotechnologia”
Prowadzący: Dr hab. Jolanta Bryjak, prof. PWr
Mgr inż. Marta Bochno
Mgr inż. Karolina Labus
Wyznaczanie stałych równania kinetycznego reakcji hydrolizy sacharozy
Cel ćwiczenia: zapoznanie się z procedurą postępowania przy wyznaczaniu stałych równania kinetycznego
MATERIAŁY I METODY
Materiały
inwertaza otrzymana nieodpłatnie z firmy Novozyme;
2 M roztwór sacharozy;
0.1 M bufor octanowy, pH 4.5;
odczynnik do oznaczania stężenia glukozy - odczynnik I
Aparatura specjalna
spektrofotometr UV-VIS Shimadzu;
termostatowane reaktory mieszalnikowe
Metody
Przygotowanie roztworów
Substrat. Do cylindra miarowego na 100 ml wprowadzić 50 ml 2M sacharozy (roztwór 1), dodać 50 ml 0.1 M buforu octanowego i dobrze wymieszać (roztwór 2). Następnie 50 ml świeżo przygotowanego roztworu wlać do kolejnego cylindra miarowego i uzupełnić buforem do 100 ml (roztwór 3). Analogicznie przygotować roztwory 4 i 5 przez 2-krotne rozcieńczenie roztworu poprzedzającego. Kolejne 4 roztwory przygotować przez 3-krotne rozcieńczenia (15 ml roztworu sacharozy + 30 ml buforu). Należy pamiętać o dokładnym wymieszaniu roztworów.
Enzym. Przygotować 20 ml roztworu wyjściowego inwertazy o stężeniu 1 mg/ml w 0.1 M buforze octanowym. Dobrze wymieszać. Przygotować przez rozcieńczenie 2 roztwory enzymu:
I - do badań kinetycznych - 25x (2 ml E + 48 ml buforu);
II - do procesu w reaktorze okresowym - 4x (2,5 ml E + 7,5 ml buforu).
Oznaczanie stężenia glukozy testem enzymatycznym.
Zasada metody. Glukoza pod wpływem oksydazy glukozowej utlenia się do kwasu glukonowego z wytworzeniem nadtlenku wodoru. Ten ostatni reaguje w obecności peroksydazy z kwasem hydrobenzoesowym (HBA) i 4-aminoantypiryną (AAP) tworząc czerwony barwnik chinonoiminę, którego intensywność zabarwienia mierzona przy długości fali 500 nm jest wprost proporcjonalna do stężenia glukozy w próbce.
Glukoza + O2 + H2O kwas glukonowy +H2O2
H2O2 + HBA + AAP chinonoimina + 4 H2O
Odczynniki: Odczynnik I (składniki aktywne: oksydaza glukozowa, peroksydaza, AAP, HBA, bufor fosforanowy), stabilizowany standard glukozy 15 mM.
Oznaczanie stężenia glukozy. Do suchych i czystych probówek wprowadzić po 1 cm3 odczynnika do oznaczania glukozy. Przygotować również 4 probówki na standardy glukozowe i kontrolę (próbkę do zerowania aparatu). Z reaktorów pobierać próbki po 10 ul (lub 50 ul w przypadku reaktora 8 i 9) i dozować je bezpośrednio do probówek zawierających odczynnik I. Analogicznie postąpić ze standardami i kontrolą (próbka do zerowania aparatu). Każdorazowo kilkakrotnie przepłukać końcówkę odczynnikiem I. Probówki pozostawić przez 5 min w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni, a następnie zmierzyć absorbancję (500 nm) wobec próby kontrolnej (1 ml odczynnika I + 10 ul 0,1 M buforu octowego pH 4,5).
Obliczanie stężenia glukozy. Wartości absorbancji dla 3 standardów glukozy uśrednić i przyjąć, że Cśr = 15 mM. Z proporcji obliczyć stężenie w próbkach badanych, a otrzymane wartości pomnożyć przez (ewentualne) rozcieńczenie. W efekcie otrzymuje się stężenie glukozy w mM roztworu reakcyjnego.
Pomiar zmiany stężeń reagentów w początkowych etapach reakcji.
Przygotować roztwory sacharozy o stężeniach:
Nr reaktora |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
Csacharozy [M] |
2,0 |
1,0 |
0,5 |
0,25 |
0,125 |
0,0417 |
0,0139 |
0,0046 |
0,0015 |
Do termostatowanych (35°C) reaktorów mieszalnikowych wprowadzić po 20 cm3 przygotowanych roztworów, włączyć mieszanie i zamknąć korkiem. Po 10-15 min preinkubacji do reaktorów wprowadzić kolejno dokładnie po 4 ml roztworu enzymu (I), włączając jednocześnie stoper. Po 10-15 sec pobrać z reaktora dokładnie 10 ul (lub 50 ul) mieszaniny reakcyjnej i dodać do probówki zawierającej 1 cm3 odczynnika I. Probówkę zamieszać i wstawić na 5 minut do łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni. Kolejne próbki do analiz pobierać po 1, 2, 3, 4 i 5 minucie lub po 2, 4, 6, 8 i 10 min (dla roztworów (1), (2) i (3)).
Pomiar zmiany stężenia glukozy podczas procesu hydrolizy sacharozy
Do termostatowanego (35°C) reaktora mieszalnikowego wprowadzić 20 cm3 przygotowanego roztworu substratu nr 5, włączyć mieszanie i zamknąć korkiem. Po 10-15 min preinkubacji do reaktora wprowadzić 4 ml roztworu enzymu (II), włączając jednocześnie stoper. Po 10-15 sec pobrać z reaktora 0,1 ml mieszaniny reakcyjnej i dodać do probówki zawierającej 0,4 cm3 0,1 M buforu octowego o pH 4,5 (5-krotne rozcieńczenie próbek). Probówkę zamieszać i pobrać z niej 10 ul i postępować jak opisano wcześniej. Kolejne próbki do analiz pobierać po 5, 10, 15, 20 min, a następne co 10 min. Uwzględnić 5-krotne rozcieńczenie próbki pobranej z reaktora.
Sprawozdanie winno zawierać: wstęp (np. o enzymie, jego wykorzystaniu w przemyśle), metodykę (należy pamiętać o formie bezosobowej np. dodano, zmierzono...), wyniki i dyskusję wyników.
Uwaga! Enzymatyczna metoda oznaczania stężenia glukozy jest mikrometodą. Zlewki, cylindry, probówki, itd. należy przed myciem przepłukać wodą z kranu, następnie umyć wodą z dodatkiem niewielkiej ilości “Ludwika”, po czym płukać dużą ilością wody z kranu (15x) i 3x wodą destylowaną. I należy pamiętać, że wszystko ma też powierzchnię zewnętrzną. Ponieważ wszystkie grupy ćwiczeniowe korzystają z tego samego szkła, nieuwaga 1 osoby może być przyczyną złych wyników grup następnych. Konsekwencje braku utrzymania odpowiedniej czystości szkła laboratoryjnego: kłopoty z wyznaczeniem stałych równania kinetycznego, brak możliwości symulacji procesu w reaktorze okresowym, problemy z oceną z ćwiczeń.
Oksydaza glukozowa
Peroksydaza
Wyszukiwarka