MIKROBIOLOGIA - ćwiczenia 17.05.2010

MECHANIZMY OPORNOŚCI DROBNOUSTROJÓW -c.d.

1. OPORNOŚĆ NA AMINOGLIKOZYDY

• Zmiany w podjednostce 30S rybosomalnego RNA w miejscu docelowego działania aminoglikozydów

• Naturalna

• Zmiany w przepuszczalności błony komórkowej

• Oporność nabyta (brak możliwości osiągnięcia miejsca docelowego działania tych leków)

• Modyfikacja enzymatyczna antybiotyku

• Oporność nabyta (przeniesienie plazmidów/transpozonów kodujących enzymy modyfikujące; mutacje chromosomalne prowadzące do zmniejszenia powinowactwa leku do miejsca działania)

• Synteza enzymów modyfikujących cząsteczkę leków - jest najczęściej determinowaną informacją zakodowaną w genomie plazmidu, transpozonu lub chromosomie. Enzymy są wytwarzane konstytutywnie.

Klasy enzymów :

• Nukleotydotransferazy (ANT) -adenylacja grup hydroksylowych

• Fosfotransferazy (APH) -fosforylacja grup hydroksylowych

• Acetylotransferazy (AAC) -acetylacja grup aminowych

• Nabyta, wysoka oporność enterokoków na aminoglikozdy (HLAR) 30-90% szczepów

• Nabyta oporność gronkowców (enzym bifunkcyjny AAC6'/APH2'') i pałeczki G(-) na aminoglikozydy

• Zaburzenia (inaktywacja lub obniżenie) transportu czynnego do miejsca docelowego działania - oporność gatunkowo specyficzna chromosomalna

• Naturalna oporność beztlenowców na aminoglikozydy

• Naturalna oporność Enterococcus spp. na niskie stężenia aminoglikozydów

• Modyfikacja punktu uchwytu (nabyta oporność rybosomalna) → zmiana białka S12 podjednostki 30S wskutek jednostopniowej mutacji punktowej

• Oporność na streptomycynę S.aureus, N.gonotthoeae

• Zmiany mutacyjne w podniednostce 16S rybosomu, np. oporność na streptomycynę u Mycobacterium spp.

2. OPORNOŚĆ NA TETRACYKLINY

• Zaburzenia transportu leku do miejsca docelowego

• Aktywne usuwanie leku z komórki

• Enzymatyczna inaktywacja leku

• Geny oporności (16 klas genów tet A-tet X) są przeważnie zlokalizowane na plazmidach lub transpozonach, rzadziej na chromosomach

• Oporność najczęściej krzyżowa

• Charakter indukcyjny i konstytutywny

3. OPORNOŚĆ KRZYŻOWA NA MAKROLIDY, LINKOZAMIDY I STREPTOGRAMINY B ( oporność MLS_B)

• Fenotyp MLS_B oznacza oporność na : makrolidy, linkozamidy i streptograminę B przy zachowaniu wrażliwości na streptograminę A (u gronkowców i paciorkowców)

• Ekspresja MLS_B może być konstytutywna (oznacza krzyżową oporność niezależnie od obecności antybiotyku w środowisku) i indukcyjna (indukowana przez makrolidy C14- erytromycyna, klarytromycyna i C15-azytromicyna)

• Fenotyp M oznacza oporność tylko na makrolidy przy zachowanej wrażliwości na linkozamidy i streptograminy (u paciorkowców)

• Modyfikacja poprzez metylację punktu uchwytu - białka 23S rRNA (wspólne dla grupy MLS) związana z obecnością w komórce genów erm

• Oporność ta klinicznie oznacza oporność na wszystkie makrolidy, linkozamidy i streptograminy z wyjątkiem ew. makrolidów C16 i Synercidu

• Enzymatyczna modyfikacja antybiotyku

• Fosfotransferazy (MPH)- geny mph, oznaczają oporność tylko na makrolidy

• Nukleotydylotransferazy - grn linA, oporność tylko na linkozamidy

• Acetylotransferazy - geny sat, vat, opornośc tylko na Streptograminy A

• Aktywne usuwanie leku z komórki (active - efflux) - przeważnie izolowana oporność na jeden z antybiotyków z grupy MLS (występuje i paciorkowców tzw. fenotyp M /geny mef/, Neisseria gonorrhoeae i u gronkowców /geny msrA i msrB/)

• Oporność ta klinicznie oznacza oporność na makrolidy przy ewentualnie zachowanej wrażliwości na linkozamidy

4. OPORNOŚĆ NA CHINOLONY I FLUOROCHINOLONY

• Mutacja w genach gyrazy/topoizomerazy IV

• Mutacja w genach gyrazy DNA częściej u bakterii G(-),jest to związane z obecnością białek GyrA [częstsze mutacje warunkujące wyższy poziom oporności ] i/lub GyrB

• U bakterii G(+) mutacja w genie GyrA warunkuje niski stopień oporności…

• Mutacje białek GyrB- E.coli, S.typhimurim, M.tuberculosis, S.aureus, S.pneumoniae

• Mutacje w obrębie białek ParC i GyrA u bakterii G(-) - wysoki poziom oporności : E.coli, K.pneumoniae, C.freundii, P.aeruginosa, H.influenzae, N.gonorrhoeae

• Mutacja w genie syntezy gyrazy (gyrA,gyrB) lub topoizomerazy

• Powstaje enzym,który przestaje być miejscem docelowego działania dla antybiotyku

• Mutacja ma charakter wielostopiowy,w związku z czym szczepy nabywają oporności w coraz większym stopniu

• Mutacja ma charakter wielostopniowy w związku z czym szczepy nabywają oporności w coraz większym stopniu

• Oporność nabyta głównie dotyczy Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Serratia marcescens, E. coli,

• Aktywne usuwanie leku z komórki - active efflux pomp (tzw. oporność niskiego stopnia), kodowana chromosomalnie (geny nor ) - głównie pałeczki G(-) i Mycobacterium tuberculosis

5. OPORNOŚĆ NA GLIKOPEPTYDY

• Modyfikacja punktu uchwytu - oporność gatunkowo-specyficzna kodowana chromosomalnie lub nabyta kodowana chromosomalnie lub plazmidowo

6. OPORNOŚĆ ENTEROKOKÓW VRE NA GLIKOPEPTYDY

• Wiąże się z nabyciem genu van A, vanB, vanC, vanD lub vanE, które są odpowiedzialne za zmianę składu aminokwasowego łańcuchów białkowych peptydoglikanu

• Dochodzi do zamiany końcowej D-Ala-D-Ala na D-Ala-D-Lac lub D-Ala-D-Ser

• Wiąże się z utratą powinowactwa glikopeptydów do łańcuchów białkowych peptydoglikanu

Przykład :

*naturalna oporność Enterococcus casseliflavus, E.gallinarum. E.flavescenes (fenotyp vanC)

*nabyta oporność E.faecium i E.faecalis

7. ROZPRZESTRZENIANIE SIĘ OPORNOŚCI WŚRÓD ENTEROKOKÓW

• Powszechne występowanie enterokoków

• Nadużywanie cefalosporyn w terapii zakażeń (selekcja enterokoków)

• Nadużywanie i nieprawidłowe stosowanie glikopeptydów w terapii oraz profilaktyce

• Przenoszenie genów na transpozonach

8. OPORNOŚĆ GRONKOWCÓW NA GLIKOPEPTYDY

• VISA - szczepy S.aureus o obniżonej wrażliwości na wankomycynę

• Pogrubienie ściany komórkowej

• VRSA - szczep S.aureus oporny na wankomycynę

• Szczepy te są oporne na metycylinę

• Największe ryzyko wyselekcjonowania VRSA występuje w szpitalach z wysokim odsetkiem zakoażeń MSRA oraz obecnością w środowisku szpitalnym opornych na wankomycynę enterokoków

9. OPORNOŚĆ GRONKOWCÓW VISA NA GLIKOPEPTYDY

• Wzrost ilościowy prekursorów ściany komórkowej - znaczna nadprodukcja D-Alaniny - tak duża, że wszystkie dostępne cząsteczki leku wiążą się z wolną D-alaniną, a wiązania krzyżowe łańcuchów bocznych powstają bez przeszkód

• Spadek ilościowy proporcji dimerów do monomerów muropeptydu, co daje efekt słabego usieciowania ściany kom. I impregnacje ściany kom. Kompleksami glikopeptydu -D-Ala -> efekt pogrubionej ściany

• Nadprodukcja PBP2 i redukcja PBP4 ( u szczepów hVISA)

10. OPORNOŚĆ NA KOTRIMOKSAZOL

• Spadek powinowactwa reduktazy dihydrofolianowej do trimetoprimu i do enzymu syntezy dihydropterynianowej (DPSH) i sulfametoksazolu

• Nadprodukcja DPSH

• Obniżona przepuszczalność osłon komórkowych dla leków

11. OZNACZANIE WRAŻLIWOŚCI S.AUREUS NA GLIKOPEPTYDY

• Szczepy o obniżonej wrażliwości na wankomycynę - VISA (wg CLSI pozostają wrażliwe na wankomycynę i charakteryzują się MIC < 4μg/ml)

• Metoda krążkowo dyfuzyjna nie pozwala wykryć VISA

• Metody zalecane to : metoda przeglądowa (BHIA + wankomycyna) i E-test

• Odczyt w metodzie przeglądowej : wzrost nawet 1 kolonii oznacza oporność na wankomycynę

• Badanie w kierunku VISA należy bezwzględnie wykonać u pacjenta z przewlekłą chorobą podstawową (cukrzyca, choroby nerek u pacjentów dializowanych), stwierdzonym wcześniej zakażeniem MRSA oraz u pacjentów leczonych długotrwale glikopeptydami

VISA (Vancomycin Intermediate S.aureus) Staphylococcus aureus średniowrażliwy na wankomycynę

VRSA (Vancomycin Resistant S.aureus) Staphylococcus aureus oporny na wankomycynę

12. METODA PRZEGLĄDOWA Z WANKOMYCYNĄ

13. OZNACZANIE OPORNOŚCI MLS_B : Staphylococcus spp.

• Metoda krążkowo-dyfuzyjna : krążki z erytromycyną i linkomycyną

• Interpretacja : pojawienie się charakterystyczna strefa ścięcia przy krążku z linkomycyną od strony krążka z erytromycyną (wynik dodatni)

W TYM MIEJSCU SĄ TE ZDJĘCIA KRĄŻKÓW,ALE NIE CHCE MI SIĘ ICH SZUKAĆ ANI RYSOWAĆ ANI NIC,WIĘC ZOSTAWIAM,MOŻE PÓŹNIEJ COŚ ZNAJDĘ,A JAK NIE,TO JAKOŚ OPISZĘ SŁOWAMI.

14. IDENTYFIKACJA FENOTYPU OPORNOŚCI NA MAKROLIDY I LINKOZAMIDY U STREPTOCOCCUS SPP.

ERYTROMYCYNA Ś/O

15. OZNACZANIE WRAŻLIWOŚCI ENTEROCOCCUS SPP.

• Oznaczanie tzw. oporności wysokiego stopnia na aminoglikozydy - HLAR

• Nie oznaczać wrażliwości dla szczepów Enterococcus na niskie stęż. aminoglikozydów, cefalosporyn, klindamycyny i trimetoprim/sulfametoksazol, ponieważ enterokoki posiadają naturalną oporność na te leki

16.

OZNACZANIE STOPNIA OPORNOŚCI ENTEROCOCCUS SPP.

NA ANTYBIOTYKI AMINOGLIKOZYDOWE - HLAR

• HLAR - wysoki stopień oporności enterokoków na aminoglikozydy

• Metoda przeglądowa z gentamycyną 500μg i streptomycyną 2000μg

• Interpretacja : wzrost > 1 kolonii oznacza oporność na wysokie stężenie aminoglikozydów

• Metoda krążkowo-dyfuzyjna: krążki z gentamycyną i streptomycyną (strefy zahamowania wzrostu wokół krążków z genatmycyną (streptomycyną) - 6 mm szczep HLAR)

• E-test z gentamycyną [MIC>500mg/l] /streptomycyną [MIC> 1000mg/l] - HLAR

• Oporność HLAR uniemożliwia stosowanie w leczeniu podstawowej terapii skojarzonej (łączenie aminoglikozydów z penicyliną, ampicyliną (?), wankomycyną czy teikoplaniną)

17. OZNACZANIE OPORNOŚĆI NA GLIKOPEPTYDY U ENTEROCOCCUS SPP. - VRE

• Metoda krążkowo - dyfuzyjna : krążki z wankomycyną/teikoplaniną

• Interpretacja : strefa zahamowania wzrostu 15-16mm,należy wykonać oznaczenie metodą przeglądową lub oznaczyć MIC

• Bardzo ważna jest dokładna identyfikacja : E. casseliflavus, E. gallinarum i E. flavescens - naturalna oporność niskiego stopnia, nabyta oporność E. faecium i E. faecalis,

• Metoda przeglądowa z wankomycyną : wzrost < 1 kolonii oznacza oporność

• E-test z wankomycyną i teikoplaniną [MIC ≥ 32 mg/l] - VRE

• Wykrywanie genów vanA, vanB, vanC techniką PCR

6

Enterokoki

Modyfikacja enzymatyczna prekursora (D-Ala-D-Lac) kodowana przez zespół genów vanA i vanB

Przeniesienie genu vanA z enterokoków na gronkowce

Gronkowce VISA

Pogrubienie ściany komórkowej

Gronkowce VRSA

Modyfikacja enzymatyczna prekursora (D-Ala-D-Lac),

Kodowana przez zespół genów vanA

DODATNI WYNIK HODOWLI

ZWERYFIKOWAĆ WYNIK BADANIA POPRZEZ ZASTOSOWANIE MAKROMETODY Z UŻYCIEM E-TESTÓW

MIC Va ≥ 16mg/l i TEI ≥ 32mg/l (szczepy VRSA)

MIC 4 - 8 mg/l i TEI 16mg/l (szczepy VISA)

Należy je przesłać do laboratorium referencyjnego

UJEMNY WYNIK HODOWLI

SZCZEP WRAŻLIWY NA WANKOMYCYNĘ

[ MIC Va ≤ 2mg/l ]

[ MIC TEI ≤ 8mg/l ]

SZCZEP OPORNY NA GLIKOPEPTYDY

KLINDAMYCYNA Ś/O

MLS_B INDUKCYJNY LUB KONSTYTUTYWNY

ERM

NIE POWINNO SIĘ STOSOWAĆ ŻADNYCH MAKROLIDÓW I KLINDAMYCYNY

KLINDAMYCYNA W (brak spłaszczenia strefy zahamowania wzrostu)

M-fenotyp

mefA

NIE POWINNO SIĘ STOSOWAĆ MAKROLIDÓW 14 I 15-WĘGLOWYCH

KLINDAMYCYNA W (spłaszczenie strefy zahamowania wzrostu)

MLS_B indukcyjny

ERM

NIE POWINNO SIĘ STOSOWAĆ ŻADNYCH MAKROLIDÓW I KLINDAMYCYNY

---