Wydział Biotechnologii i Nauk o Żywności

Kierunek: biotechnologia sem.VI

Gr. 5

Lasota Aleksandra

Lis Piotr

Majkowska Justyna

Pietras Barbara

Ćwiczenie nr 7

UWALNIANIE PRODUKTÓW WEWNĄTRZKOMÓRKOWYCH

Wydzielanie wewnątrzkomórkowej lipazy Mucor circinerolloides z zastosowaniem różnych metod dezintegracji komórki.

Data wykonania ćwiczenia: 24.04.09

Data oddania sprawozdania: 15.05.09

Data oddania poprawionego sprawozdania: 22.05.09

Wprowadzenie:

Lipazy należą do klasy hydrolaz. Charakteryzują się niewielką specyficznością i katalizują rozkład estrów, np. lipaza trzustkowa (3.1.1.3) rozkłada wiązanie między grupą -OH glicerolu a wyższymi kwasami tłuszczowymi w triacylogricerolach.

Znajdują zastosowanie w przemysłach: farmaceutycznym, mleczarskim, środków czyszczących, kosmetycznym, oleochemicznym i innych. Pleśnie rodzaju Mucor są producentami enzymów proteolitycznych, amylolitycznych oraz lipaz na skalę przemysłową. Lipazy pozyskane z Mucor circinelloides oraz Mucor racemosus są wykorzystywane m.in. w procesie bioremediacji gleb skażonych produktami ropy naftowej.

Enzymy wewnątrzkomórkowe mikroorganizmów, w związku z trudnościami w czasie wyodrębniania ich z komórki, są w mniejszym stopniu poznane niż enzymy pozakomórkowe.

W celu wydzielenia lipaz wewnątrzkomórkowych można stosować standardowe, ale jednak mało wydajne metody, np. ultradźwięki, rozcieranie z materiałem twardym, zamrażanie i rozmrażanie czy zmiany ciśnienia. Mogą one powodować jednak inaktywację lipazy, dlatego też bardziej efektywną metodą jest ekstrakcja detergentami połączona ze wstępną mechaniczną dezintegracją komórek (pomocne może być przemycie komórek rozpuszczalnikami organicznymi, np. acetonem).

Wykonanie ćwiczenia:

Cel ćwiczenia:

Celem ćwiczenia jest poznanie różnych metod wyodrębniania produktów wewnątrzkomórkowych na przykładzie lipazy Mucor circinelloides.

Materiał biologiczny:

Szczep grzybów nitkowatych Mucor circinelloides z kolekcji Instytutu Biochemii Technicznej hodowano na wstrząsarce w czasie 72 godz. w temperaturze 30°C na podłożu zawierającym namok kukurydziany i olej oliwkowy. Do kolby o pojemności 1000 ml wprowadzono 300ml podłoża hodowlanego i szczepiono kultura mateczną za pomocą ezy. Nagromadzoną w wyniku hodowli biomasę sączono na przegrodzie celulozowej i przemywano wodą destylowaną.

Wydzielenie lipazy Mucor cricinelloides z komórki wykonano następującymi metodami. Dla wszystkich poniższych metod odważono po 0,5g otrzymanej biomasy przemytej wodą destylowaną.

Tab.1. Zestawienie metod wydzielania lipazy Mucor circinelloides

Metoda:	Wykonanie :
Metoda I: ekstrakcja buforem fosforanowym o pH=7	Biomasę przeniesiono do kolby i zalano 0,05M buforem fosforanowym o pH 7,0 a następnie inkubowano próbę w temperaturze 37˚C przez 15 minut. Po wyjęciu z inkubatora przesączono próbę na przegrodzie celulozowej (sączku). W otrzymanym przesączu oznaczono następnie aktywność lipazy.
Metoda II: ekstrakcja z dodatkiem cholanu sodu	Biomasę przeniesiono do kolby i dodano 0,05M buforu fosforanowego o pH 7,0 i roztworu cholanu sodu, a następnie inkubowano próbę w temperaturze 37˚C przez 15 minut. Po wyjęciu z inkubatora przesączono próbę na przegrodzie celulozowej (sączku). W otrzymanym przesączu oznaczono następnie aktywność lipazy.
Metoda III: rozcieranie kulkami szklanymi	Biomasę przeniesiono do moździerza, dosypano niewielką ilość bezołowiowych kulek szklanych i dodano 0,05M buforu fosforanowego o pH 7,0. Następnie roztarto aż do otrzymania równomiernej masy.Całość przeniesiono do kolby i dodano roztworu cholanu sodu oraz inkubowano próbę w temperaturze 37˚C przez 15 minut. Po wyjęciu z inkubatora przesączono próbę na sączku. W otrzymanym przesączu oznaczono następnie aktywność lipazy.
Metoda IV: homogenizacja	Biomasę przeniesiono do naczynia i dodano 0,05M buforu fosforanowego o pH 7,0 a następnie homogenizowano próbę przez ok. 2 minuty. Całość przeniesiono do kolby, dodano 0,5cm^3 roztworu cholanu sodu i inkubowano próbę w temperaturze 37˚C przez 15 minut. Po wyjęciu z inkubatora przesączono próbę na sączku. W otrzymanym przesączu oznaczono następnie aktywność lipazy.
Metoda V: zamrażanie i rozmrażanie	Biomasę przeniesiono do naczynka wykonanego z folii aluminiowej, dodano 0,05M buforu fosforanowego o pH 7,0 i dwukrotnie zamrożono przez ok. 15 minut i rozmrożono. Następnie całość przeniesiono do kolby, dodano roztworu cholanu sodu i inkubowano próbę w temperaturze 37˚C przez 15 minut. Po wyjęciu z inkubatora przesączono próbę na sączku. W otrzymaymo przesączu oznaczono następnie aktywność lipazy.
Metoda VI: przemywanie acetonem	Ćwiczenie wykonywane było pod wyciągiem. Biomasę przeniesiono kolby, dodano acetonu i mieszano przez ok. 5 minut, po czym całość przesączono na sączku. Czynność przemywania acetonem powtarzana była 3-krotnie. Następnie odwodnioną grzybnię rozłożono pod wyciągiem na sączku, na szkiełku zegarowym i suszono do momentu, kiedy grzybnia będzie całkowicie sucha. Wysuszoną biomasę przeniesiono do kolby, dodano 0,05M buforu fosforanowego o pH 7,0 oraz roztworu cholanu sodu i inkubowano próbę w temperaturze 37˚C przez 15 minut. Po wyjęciu z inkubatora przesączono próbę na sączku. W otrzymanym przesączu oznaczono następnie aktywność lipazy.

Oznaczenie aktywności esterazowej lipazy:

Substratem do oznaczenia aktywności jest octan p-nitrofenolu. Związek ten pod wpływem esteraz oraz lipaz hydrolizuje z wydzieleniem p-nitrofenolu, który wykazuje maksimum pochłaniania światła przy długości fali λ=399nm.

Za jednostkę aktywności przyjmuje się taką aktywność (ilość lub wielkość aktywności), która hydrolizuje octan p-nitrofenolu powodując uwolnienie 1 μmola p-nitrofenolu w czasie 1 minuty.

Do przygotowanych 6 probówek wprowadzono odpowiednio buforu fosforanowego o pH 7,0, odpowiedni ekstrakt lipazy oraz rozcieńczony roztwór p-nitrofenolu. Wykonano również próbę ślepą, do której na miejsce ekstraktu lipazy wprowadzono wodę. Otrzymane próby inkubowano w temperaturze pokojowej przez 15 minut.

Następnie zmierzono absorbancję prób wobec próby ślepej przy długości fali λ=399nm. Wyniki dla wszystkich grup zestawiono w tab.2 :

Tab. 2. Wartości zmierzonych absorbancji

Grupa: Metoda:	I	II	III	IV	Wartości średnie: A399
Metoda I: Ekstrakcja buforem fosforanowym o pH=7	0,160	0,122	0,169	0,184	0,159
Metoda II: ekstrakcja z dodatkiem cholanu sodu	0,157	0,187	0,357	0,261	0,240
Metoda III: rozcieranie kulkami szklanymi	0,664	0,434	1,528	0,970	0,897
Metoda IV: homogenizacja	0,777	0,380	1,136	0,674	0,742
Metoda V: zamrażanie i rozmrażanie	0,160	0,174	0393	0,250	0,244
Metoda VI: przemywanie acetonem	0,840	0,494	0,613	0,616	0,641

Aktywność lipazy obliczono ze wzoru:

gdzie:

V - objętość enzymu wzięta do reakcji (5ml)

t - czas prowadzenia reakcji (15 min)

A - aktywność esterazowa lipaz [μmol/min*g]

m - waga biomasy (0,5g)

c - stężenie p-nitrofenolu [μmol/ml], obliczony ze wzoru:
, gdzie: k = 0,076 [μmol/ml] (współczynnik kierunkowy odczytany z krzywej wzorcowej), A₃₉₉ - absorbancja badanej próby

Przykład obliczeń:

[μmol/ml]

[μmol/min*g]

Wyliczone wartości aktywności dla wszystkich metod zebrano w tab. 3.

Tab. 3. Wyliczone aktywności lipazy dla wszystkich metod

Metoda	I	II	III	IV	V	VI
Aktywność lipazy [μmol/min*g]	1,395	2,105	7,869	6,509	2,140	5,623

Podsumowanie:

Najbardziej efektywnymi metodami uwalniania lipaz wewnątrzkomórkowych okazały się metoda IV polegająca na ekstrakcji detergentem po wstępnej mechanicznej dezintegracji komórek za pomocą homogenizatora oraz metoda VI, w której zastosowano przemywanie komórek roztworem rozpuszczalnika organicznego w celu wstępnego usunięcia składników błony. Z tak przygotowanej, odwodnionej, wysuszonej grzybni enzym został łatwo wypłukany z błony komórkowej przy użyciu detergentu.

Dość wysoką aktywność lipazy otrzymano w metodzie III wykorzystującej wstępną dezintegrację przez rozcieranie w moździerzu z kulkami szklanymi. Jednak istnieje ryzyko, że taki duży wskaźnik aktywności może być spowodowany pozostałością roztartych w trakcie wyodrębniania produktu kulek szklanych, które, powodując zmętnienie roztworu, zawyżyły wyniki absorbancji a przez to i wyliczenia aktywności produktu.

Metody chemiczne (I i II) nie należą do metod efektywnych, gdyż aktywność lipazy jest niewielka.

Metoda V, w której wielokrotnie zamrożono i rozmrożono biomasę, nie uzyskano zbyt wysokiej aktywności lipazy. Jedną z przyczyn mogło być to, że biomasa nie została do końca zamrożona przez co nie wszystkie komórki uległy rozbiciu i wyekstrahowanie enzymu z wnętrza komórek było utrudnione.

---