mikrobiologia-1kolos, niezbędnik rolnika 2 lepszy, Gleboznawstwo, mikrobiologia


Pożywką nazywamy zestaw składników pokarmowych odpowiednio dobranych pod względem ilościowym i jakościowym niezbędnych do hodowli drobnoustrojów.

Skład pożywki musi być tak dobrany, by gwarantował optymalne warunki wzrostu i rozwoju badanych mikroorganizmów.

Ze względu na charakter chemiczny składników wyróżnia się pożywki:

- naturalne (mleko)

- syntetyczne (agar odżywczy)

-półsyntetyczne (zw. syntetyczne + zw. naturalne np. agar odżywczy z dodatkiem krwi baraniej)

Pod względem konsystencji pożywki dzieli się na:

- płynne

- półpłynne 

- stałe

Zależnie od celu, jakiemu mają służyć, pożywki dzieli się na:

- ogólne (zawierają zw., które mogą być źródłem węgla i energii)

- selektywne (wybiórcze, różnicujące)

wybiórcze - rośnie tylko wybrana grupa bakterii (wg Bunta, wg Martina)

różnicujące - rośnie grupa bakterii i grzybów, możemy je wyróżnić (wg McConkey'a, dla bakterii kwaszących)

Substancje zestalające - są to substancje, które pozwalają na zestalenie pożywek. Do najczęściej używanych substancji zestalających należy agar i żelatyna.

- Żelatyna - jest substancją białkową. Otrzymuje się ją w wyniku hydrolizy kolagenu czyli białka występującego w tkance łącznej zwierząt. Temperatura upłynnienia podłoża z żelatyną wynosi około 25ºC, a temperatura zestalania około 20ºC. Wykorzystywana jest przez drobnoustroje o właściwościach proteolitycznych.

- agar - agar - stosowany do wszystkich pożywek stałych, wysuszony; otrzymuje się go z glonów morskich; temp. upłynnienia = 950C; temp. zastygnięcia = 450C

Jałowienie szkła i pożywek:

- sterylizacja termiczna (mokra, sucha)

- sterylizacja fizyczna

Sterylizacja termiczna sucha - wykorzystuje się suszarkę; powietrze podgrzane do 160oC; czas trwania 1 - 2h; wykorzystuje się je do sterylizacji szkła; płytki i pipety umieszcza się w tubusie.

Sterylizacja termiczna mokra - autoklawowanie, pasteryzacja i tyndalizacja.

Autoklaw - jest to kocioł o podwójnych ścianach i podwójnym dnie, zaopatrzony w manometry, termometr oraz zawór bezpieczeństwa i zawór odpowietrzający. W górnej części znajduje się pokrywa mocowana specjalnymi śrubami. Czynnikiem jałowiącym jest przegrzana para wodna pod zwiększonym ciśnieniem. Sterylizacja odbywa się przy ciśnieniu (1 atmosfery) w temp. 121OC - w ciągu 20 - 30 minut. Autoklaw jest najczęściej stosowanym aparatem do jałowienia, oprócz pożywek można w nim jałowić sprzęt, który w suszarce przy znacznie wyższej temperaturze może ulec zniszczeniu.

Tyndalizacja (proces długotrwały) - pasteryzacja I, poźniej inkubacja 24h w 300C, pasteryzacja II, poźniej inkubacja 24h w 300C, pasteryzacja III

Pasteryzacja - nie jest metodą sterylizacji; wyk. w aparacie Kocha; zabija formy wegetatywne

Wyjaławianie przez filtrację - metodę tę stosuje się do podłoży płynnych, które pod wpływem temperatury zmieniają właściwości fizyczne bądź chemiczne (surowica, roztwory mocznika i niektórych cukrów). Metoda filtracji polega głównie na mechanicznym zatrzymaniu drobnoustrojów na filtrze, którego pory są mniejsze od średnicy drobnoustrojów. Istnieje wiele rodzajów takich filtrów, różniących się materiałem z którego są wykonane oraz konstrukcją np.:

- Berkefelda - wykonany z ziemi okrzemkowej.

- Chamberlanda - z nieglazurowanej porcelany.

- Seitsa - azbestowe.

- Schotta - ze spiekanego szkła 

membranowe (molekularne) - przygotowywane z żelatyny, pergaminu, poliwęglanów, błon zwierzęcych itp.

Dezynfekcja - nie jest metodą sterylizacji; zabija głównie formy wegetatywne (z nastawieniem na organizmy chorobotwórcze)

Sterylizacja - zabija zarówno formy wegetatywne jak i przetrwalnikowe; na sucho - wyjaławianie w suszarkach; na mokro - autoklawowanie.

Posiew - wprowadzenie badanego materiału (np. zawiesiny drobnoustrojów, zawiesiny wodnej gleby, cząsteczek gleby) na podłoże hodowlane lub do pożywki.

Przesiew - przeniesienie drobnoustrojów z podłoża na podłoże.

Opalanie - polega na krótkotrwałym kontakcie płomienia np. z brzegami naczyń zawierających pożywki, wlotami probówek. Głaszczkę opala się zanurzając w alkoholu i zapalając w płomieniu palnika.

Wyżarzanie - to sterylizacja przez rozgrzanie do czerwoności w płomieniu palnika, a następnie 3 krotne przesunięcie w płomieniu palnika oprawki wyżarzanego narzędzia - ezy lub igły.

Posiew redukcyjny - zmniejsza liczbę drobnoustrojów wysiewanych na jednostkę powierzchni podłoża zestalonego i ma na celu uzyskanie kolonii z jednej komórki macierzystej (czysta kultura).

Do czynników fizycznych mających wpływ na drobnoustroje zaliczyć można:

- temperaturę

- ciśnienie osmotyczne i hydrostatyczne

- potencjał oksydacyjno- redukcyjny

- napięcie powierzchniowe

- pH

- promieniowanie

Natomiast do czynników chemicznych zaliczamy:

- konserwanty 

- barwniki

- środki dezynfekcyjne np. fenole, alkohole, związki chloru itp. antybiotyki.

1. Temperatura - zależy od niej metabolizm bakterii oraz stan fizyko-chemiczny makrocząsteczek białkowych i nukleinowych, czyli struktura.

* temperatury kardynalne - mają najbardziej znaczący wpływ na rozwój organizmów

- minimalna - poniżej której wzrost i rozmnażanie się bakterii ulega zahamowaniu. Procesy chemiczne ulegają zwolnieniu lub zahamowaniu.

- optymalna - drobnoustroje rozmnażają się i rosną najszybciej; temp. optymalna dla wzrostu niekoniecznie jest temp. optymalna dla procesów metabolicznych

- maksymalna - powyżej której mikroorganizmy przestają rosnąć a znacznemu zwolnieniu lub zahamowaniu ulega aktywność enzymatyczna

Na podstawie punktów kardynalnych wyróżniamy: 

* Zimnolubne - psychrofilne (bakterie morskie - fotosyntetyzujące i bakterie żelazowe np. Gallionella)

- optymalna temperatura do wzrostu < 20°C

- minimalna ok. temperatury zamarzania

- maksymalna 25 - 30°C

- dzielimy je na bezwzględne (temp. max. nie przekracza 20oC), względne (rozwijają się w temp. powyżej 20oC)

* Mezofilne - liczne patogeny, bardzo powszechne saprofity (E. coli, Salmonella typhi, Brucella bovis, Shigella sp.).

- optymalna temperatura do wzrostu 20 - 40°C

- minim. 10 - 25°C

- maks. 40 - 45°C

* Termofile - ciepłolubne, występują w glebie, rozkładających się resztkach roślinnych, gorących źródłach (B. stearothermophilus, Thermoactinomyces vulgaris).

- optymalna temperatura do wzrostu 45 - 60°C

- min. 25 - 45°C

- maks. 70 - 80°C

- biorą udział w kompostowaniu, zasiedlają gorące źródła i jelita niektórych zwiarząt,

- dzielimy je na bezwzględne (temp. optymalna = 60-75oC), względne (temp. optymalna = 45-60oC)

Część praktyczna

Należy wysiać po jednym oczku ezy zawiesiny bakterii do probówek z bulionem:

a). 2 probówki zaszczepione Escherichia coli 

b). 2 probówki zaszczepione Bacillus subtilis

Po jednej probówce z bulionem zaszczepionym E. coli i B. subtilis należy wstawić do łaźni wodnej o temp. 85oC na 10 minut. Po tym czasie należy probówki schłodzić w strumieniu zimnej wody. Hodowle spasteryzowane i kontrolne E. coli i B. subtilis należy wstawić do cieplarki na 24 h o temp. odpowiednio: 37oC i 28oC. 

2. Wpływ promieniowania ultrafioletowego na mikroorganizmy - odznaczają się mniejszą wrażliwością na promieniowanie UV niż organizmy wyższe.

Działanie promieni UV polega na tym, że przy pewnej długości fali są pochłaniane przez białka i dochodzi do tworzenia się wiązań miedzy białkami a kwasami nukleinowymi. Dodatkowo w środ. tlenowym promienie UV powodują powstawanie wolnych rodników oraz związków niestałych o charakterze ponadtlenku. Najsilniejsze działanie bakteriobójcze mają fale o długości 230-275nm.

Przetrwalniki i zarodniki grzybowe są 2 razy bardziej odporne na działanie promieni UV niż formy wegetatywne.

Część praktyczna

O zabójczym działaniu promieni UV na bakterie można się łatwo przekonać. Na płytkę Petriego wylano agar odżywczy a następnie wysiano szczep E. coli. Płytkę otworzono i poddano promieniom UV, część płytki przykryto.

Obejrzeć, narysować i opisać płytkę z hodowlą E. coli na agarze odżywczym po naświetleniu promieniami UV.

3. Ciśnienie osmotyczne - mikroorganizmy są mało wrażliwe na zmiany ciśnienia środowiska (grzyby są bardziej odporne).

Na ciśnienie osmotyczne mają wpływ:

- stężenie chlorku sodu - 0-0,15% NaCl

- stężenie glukozy

Ciśnienie osmotyczne komórki bakteryjnej jest równoważne 10-20% roztworowi sacharozy. Jeżeli jest za wysokie ciśnienie to woda z komórki będzie wypływała w sposób niekontrolowany (plazmoliza).

4. Stężenie jonów wodorowych (pH) - zakres jednakowy dla wszystkich gatunków

- bakterie pH ~ 7 (najlepiej rosną: acydofile - wolą środ. kwaśne; alkalofile - wolą środ. zasadowe)

- grzyby pH ~ 5-6

S

 

Glukoza

NaCl

pH

1 %

10 %

50 %

1 %

3 %

10 %

4

7

10

K

1

-

-

-

 -

-

 

 

 -

 

 

 -

 

 

 -

 

 

 -

 

E.c

1

 

 

 +

 

 

 -

 

 

 ++

 

 

 +

 

 

 -

 

 

 -

 

 

++ 

 

 

 ++

 

droż

1

 

 +

 

 

 +

 

 

 -

 

 

 ++

 

 

 +

 

 

 -

 

 

 ++

 

 

 ++

 

 

 -

 

Wpływ środków dezynfekcyjnych (sublimat) na bakterie (Escherichia coli) - demonstracja.

Działanie środków dezynfekcyjnych można sprawdzić metodą studzienkową. Na płytkę Petriego wylano agar odżywczy i zaszczepiono zawiesiną przygotowaną z hodowli E. coli. W podłożu z hodowlą wycięto korkoborem (zanurzony w denaturacie i opalony) studzienkę, którą napełniono 0,1% roztworem sublimatu (HgCl2). Płytkę zamknięto i wstawiono do cieplarki gdzie inkubowano ją w temp. 28oC przez 1 tydzień.

Część praktyczna

Należy obejrzeć, narysować i opisać płytkę z hodowlą E. coli poddaną działaniu roztworu sublimatu (w stężeniu 0,1%).

korkobór - wycięto nim otwór na środku płytki; do otworu naniesiono 0,1ml HgCl2 i wstawiono do lodówki 4-5oC (czas preinkubacji); dyfunduje do studzienki; im dalej tym mniej środka; później nastąpiła inkubacja 37oC

intensyfikacja wzrostu - odpowiedź na zagrożenie

4. Wpływ detergentów i alkoholu na mikroorganizmy - wpływają na przepuszczalność błon komórkowych; naruszają gospodarkę pierwiastkami i mogą prowadzić do ich śmierci. Alkohol najbardziej skuteczny przy 75%; powoduje denaturację białek.

Czynniki:

- bakteriobójcze - powodują śmierć

- bakteriostatyczne - powodują zahamowanie wzrostu

Część praktyczna

Aby zbadać skuteczność dezynfekcyjnego działania alkoholu etylowego i mydła na mikroflorę skóry i dłoni należy płytkę Petriego z agarem odżywczym podzielić na 3 części. 

W każdej z nich zrobić lekki odcisk palca:

  1. brudnego

  2. umytego wodą i mydłem 

  3. przemytego watą zwilżoną etanolem (75%)

Założone hodowle należy umieścić w cieplarce w temperaturze 28oC na ok. 48h.

Wybrane metody stosowane do hodowli mikroorganizmów.

Hodowle mieszane - różne gatunki mikroorganizmów na 1 pożywce

Hodowle czyste - mamy tu do czynienia z bakteriami i grzybami należącymi do 1 szczepu

Czyste kultury - 1 gatunek bądź szczep organizmu, które są jednorodne genetycznie

Kolonia - charakterystyczne dla rodzaju lub gatunku skupienie dużej ilości komórek wyrosłych na podłożu stałym, przy założeniu, że namnożyły się z 1 komórki. Są one najczęściej widoczne gołym okiem.

jtk (cfu) - jednostka tworząca kolonie, używa się jej przy określaniu liczny organizmów w danym środowisku.

Cechy kolonii:

1. Wzrost kolonii:

- powierzchniowy,

- podpowierzchniowy,

- wgłębny,

2. Wielkość kolonii:

- mała - o średnicy do 1 mm,

- średnia - o średnicy 1-3 mm,

- duża - o średnicy powyżej 3 mm.

3. Kształt kolonii:

a). punktowa, b). okrągła, c). rizoidalna, d). nieregularna, e). strzępiasta.

 4. Profil kolonii:

a). płaski, b). lekko wypukły, c). silnie wypukły, d). stożkowaty, e). wypukły z powierzchnią brodawkowatą, f). wrastający w podłoże, g). kraterowaty.

5. Brzeg kolonii:

a). regularny, b). falisty, c). nieregularny, d). rozlany, strzępiasty

6. Przejrzystość kolonii:

- przejrzysta,

- nieprzejrzysta,

- półprzejrzysta

7. Fluorescencja kolonii - obecna lub brak.

- nieindukowana (po 72h na kolor zielony)

- niebieska, zielona (indukuje się trzymając otwartą płytkę pod lampą UV)

8. Barwa kolonii - obejmuje obecność pigmentu lub jego brak (kolonia bezbarwna), intensywność zabarwienia, zabarwienie otoczenia kolonii związane z dyfuzją barwnika do podłoża;
9. Struktura kolonii

- ziarnista (przy dotknięciu wyczuwalna ziarnistość),

- krucha, pylista (przy dotknięciu rozpada się),

- włóknista (przy podnoszeniu widoczne włókna),

- skórzasta (zwarta i trudna do rozmazania)

- mazisto-kremowa (ciągnąca się) 

10. Zapach kolonii - obecny lub kolonia bez zapachu, określa się intensywność zapachu i czy jest charakterystyczny

E. coli nie wytwarza przetrwalników. Proces pasteryzacji zabija ją.

B. subtilis wytwarza przetrwalniki. Proces pasteryzacji nie powoduje jej śmierci.

Hodowle tlenowe i beztlenowe.

Ćwiczenie. Zastosowanie bulionu odżywczego lub słupków z agaru. Zaszczepiamy ezą (bulion) lub igłą (agar). Inkubacja 24h. Jeżeli wzrost jest w postaci kożuszka to tlenowiec. Jeśli w środku pożywki mamy zmętnienie to beztlenowiec względny. Jeśli na dnie pożywki mamy osad to beztlenowiec bezwzględny.

Bezwzględne tlenowce — drobnoustroje, dla których tlen jest czynnikiem niezbędnym nie tylko dla wzrostu i rozwoju, lecz także dla utrzymania się przy życiu. Do takich drobnoustrojów należą np. autotroficzne bakterie utleniające amoniak do azotanów. Do bezwzględnych tlenowców zalicza się jednak i takie organizmy, które wprawdzie nie mogą rosnąć i rozwijać się bez udziału tlenu, ale zachowując żywotność mogą przetrwać pewien okres w środowisku o niskiej zawartości tlenu. Do takich organizmów należy większość drobnoustrojów glebowych.

Mikroaerofile — czyli względne tlenowce, stanowią grupę pokrewną tlenowcom bezwzględnym. Są one bardzo rozpowszechnione w przyrodzie, a zwłaszcza w glebie. Rosną i rozwijają się najlepiej wtedy, gdy stężenie tlenu w środowisku jest niskie.

Względne beztlenowce — drobnoustroje, które mogą żyć w obecności lub przy braku tlenu wykorzystując do procesów utleniania tlen wolny lub inny substrat energetyczny. Do tej grupy zalicza się takie organizmy jak drożdże, które mogą oddychać zarówno tlenowo, jak i w warunkach beztlenowych fermentując wtedy cukry. Względnymi beztlenowcami są też niektóre gatunki bakterii fotosyntetyzujących.

Bezwzględne beztlenowce drobnoustroje, których wzrost jest hamowany nawet przez małe ilości tlenu, prawdopodobnie ze względu na nieodwracalne utlenienie przenośników elektronów i wytwarzanie się toksycznych nadtlenków np. H2O2. Do tej grupy należą niektóre gatunki Clostridium.

Hodowle tlenowe - na pożywkach płynnych; stosuje się niski słup pożywki, żeby była najbardziej natleniona;

hodowle w kolbkach - większy dostęp tlenu;

na pożywkach stałych - na płytkach Petriego i w probówkach;

Hodowle beztlenowe - ograniczamy dostęp tlenu.

Metody usuwania tlenu:

* metody biologiczne:

- płytki Fortnera - bakterie beztlenowe wykorzystują cały dostępny tlen w czasie inkubacji i stwarza to dogodne warunki do rozwoju beztlenowca; beztlenowiec bezwzględny nie będzie żył

- zast. tkanek rośl. i zw., które mają naturalną zdolność do adsorpcji tlenu; pożywa płynna wg Wrzostka - wykorzystuje się marchewkę lub pokrojoną wątrobę

* fizyczne - odcinamy dostęp tlenu:

- na swojej powierzchni posiadają warstwę ciekłej parafiny. W przypadku stałych stosuje się agar wodny 10%. Wylewa się go na płytce z pożywką i beztlenowcem. Agar zastyga i odcina dostęp tlenu do pożywki.

- wykorzystanie anaerostatów - gaz obojętny: propan butan, azot, CO2 - odprowadzają tlen, wprowadzany jest gaz obojętny

* chemiczne:

- wykorzystuje się zw. chem., które wykazują właściwości adsorpcji tlenu np. pyrogallol, który w środowisku alkalicznym zaczyna wiązać tlen;

- gaspack - torebki z kwasem węglowym, odcinamy róg, wlewamy 10ml wody i wrzucamy do anaerostatów; wydziela się H2 i CO2

- mieszane



Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
3 ok, niezbędnik rolnika 2 lepszy, Gleboznawstwo, mikrobiologia
ĆWICZENIE X, niezbędnik rolnika 2 lepszy, Gleboznawstwo, mikrobiologia
cw12, niezbędnik rolnika 2 lepszy, Gleboznawstwo, mikrobiologia
10 ok, niezbędnik rolnika 2 lepszy, Gleboznawstwo, mikrobiologia
3kolos, niezbędnik rolnika 2 lepszy, Gleboznawstwo, mikrobiologia
13 ok, niezbędnik rolnika 2 lepszy, Gleboznawstwo, mikrobiologia
ĆWICZENIE III, niezbędnik rolnika 2 lepszy, Gleboznawstwo, mikrobiologia
ĆWICZENIE VIII, niezbędnik rolnika 2 lepszy, Gleboznawstwo, mikrobiologia
ĆWICZENIE VII, niezbędnik rolnika 2 lepszy, Gleboznawstwo, mikrobiologia
ĆWICZENIE XI, niezbędnik rolnika 2 lepszy, Gleboznawstwo, mikrobiologia
Ćwiczenie IX, niezbędnik rolnika 2 lepszy, Gleboznawstwo, mikrobiologia

więcej podobnych podstron