14. Aktywacja limfocytów

- proces dojrzewania limfocytów przygotowuje je do rozpoznania antygenu ale nie wystarcza aby efektywnie uczestniczyć w odpowiedzi immunologicznej

- dziewicze limfocyty muszą ulec aktywacji, której następstwem jest proliferacja i różnicowanie w komórki efektorowe

- większość limfocytów w fazie G0 cyklu komórkowego, pozostają w uśpieniu, w wyniku aktywacji przechodzą do fazy G1 i zaczynają intensywnie się dzielić

- kluczową rolę w procesie aktywacji odgrywa receptor antygenowy LimT TCR lub LimB BCR, ostateczny efekt jednak zależy od udziału innych cząstek modulujących proces aktywacji

Aktywacja limfocytów T

Rozpoznanie antygenu - pierwszy i drugi sygnał aktywacji

- dojrzałe LimT opuszczające grasicę mają fenotyp komórek spoczynkowych i określane są limfocytami dziewiczymi

- warunkiem aktywacji jest prezentacja przez cz.MHC swoistego antygenu

- w trakcie tego kontaktu limfocyt musi otrzymać dwa sygnały do aktywacji - pierwszy pochodzący z rozpoznania antygenu przez TCR, drugi z cząsteczek kostumulujących

- najważniejszą rolę w kostymulacji odgrywają interakcje receptorów CD28, ICOS1, CD2 na powierzchni limfocytu z cząsteczkami CD80/CD86, ICOS-L, LFA-3 oraz CD48 znajdującymi się na powierzchni komórki prezentującej antygen

- jeśli limfocyty dziewiczy który rozpoznał antygen nie otrzyma kostymulacji to nie tylko nie zostanie zaktywowany ale wejdzie w stan anergii (utraci na przyszłość zdolność do aktywacji po rozpoznaniu antygenu)

- w przeciwieństwie do limfocytów dziewiczych limfocyty pozostające w stanie aktywacji (jak również limfocyty pamięci) wymagają tylko pierwszego sygnału aby rozpocząć proliferację

- schematy aktywacji LimTh i LimTc są bardzo podobne, różnica wynika z innych cz.MHC które prezentują antygen i szlaku przekazywania sygnału do komórki przez CD4 lub CD8

Ryc. 14.2

Synapsa immunologiczna

- miejscem aktywacji LimT są zwykle obwodowe narządy limfatyczne

- większość antygenów które dostają się do organizmu dociera tam na powierzchni komórek prezentujących antygen

- jeśli obecny w węźle limfocyty rozpozna antygen może ulec aktywacji

- proces aktywacji zapoczątkowuje tworzenie synapsy między LimT i APC

- powierzchnia kontaktu wzbogacana jest w białka uczestniczące w adhezji i przekazywaniu sygnału z błony komórkowej do jądra

- w obrębie synapsy dochodzi do zagęszczania TCR i kompleksów peptyd-cząstka MHC (interakcje cz.adhezyjnych limfocytu i APC)

- jeśli nie dojdzie do rozpoznania swoistego antygenu limfocyt odłącza się od APC zachowując fenotyp komórki spoczynkowej!

- jeśli limfocyty rozpozna prezentowany antygen sygnał o aktywacji musi dotrzeć z TCR do wnętrza komórki

- stymulacja limfocytu antygenem doprowadza do przegrupowań w błonie i do powstania mikroskupisk aktywujących (odpowiednia długość połączenia, odpowiednie stężenie antygenu), są to zgrupowania cząsteczek które rozpoczynają proces aktywacji

- należą do nich TCR z kompleksem CD3, kinaza ZAP-70, białka adaptorowe LAT, Grb2, Gads, SLP-76 i białka odpowiedzialne za rearanżacje cytoszkieletu

- w miarę dojrzewania synapsy immunologicznej dochodzi do zlewania się skupisk i tworzenia grup białek przekaźnikowych w jej centrum

- bezpośrednie sąsiedztwo konglomeratów i cząsteczek kostymulujących ułatwia aktywację (niewiele kompleksów MHC-antygen może wystarczyć do aktywacji limfocytu)

- sąsiadujące ze sobą białka przekaźnikowe nawzajem się fosforylują, potęgując sygnały biegnące z powierzchni komórki

- odpowiedź komórki na zmiany w jej środowisku przebiega szybko i ze zwielokrotnioną siłą, proporcjonalnie do zagrożenia

- ostateczna dojrzała forma synapsy tworzy się w ciągu kilku minut od kontaktu Lim z APC

- zawiera ona uporządkowane wielkocząsteczkowe agregaty molekuł uczestniczących w adhezji i przekazywaniu sygnału do aktywacji do wnętrza komórki (supramolecular activation clusters - SMACs)

- w centrum synapsy (cSMAC) zgrupowane są receptory TCR wraz z CD3, CD4/CD8, kompleksy peptyd-cz.MHC, cząsteczki kostymulujące i ich ligandy (CD28/CD80) oraz cytoplazmatyczne białka przekaźnikowe: kinazy PKC-θ (protein kinase C) i IKK (IκB kinase), wydaje się że cSMAC może stanowić miejsce degradacji kompleksów TCR i cząsteczek sygnałowych oraz obejmować przestrzeń, do której po aktywacji limfocytu wydzielane są cytokiny i chemokiny

- bardziej na zewnątrz synapsy znajduje się obwodowa (peryferyjna) część - pSMACs, utworzona przede wszystkim z pierścienia cząsteczek adhezyjnych, białka ADAP, taliny i receptora dla transferyny które ułatwiają stabilizacje połączenia limfocytu z APC

- jako ostatni występuje dystalny obszar dSMAC zawierający cząsteczki CD43 i niektóre fosfatazy, ze względu na duże rozmiary cząsteczki CD43 mogą hamować interakcje białek przekaźnikowych ze sobą, fosfatazy natomiast poprzez działanie defosforylujące znoszą efekt kinaz aktywujących szlak przekazywania sygnału do komórki

Ryc. 14.5

Przekazanie sygnału do aktywacji do wnętrza komórki

- TCR składa się z części wiążącej i z części przekazującej sygnał do wnętrza komórki

- w swojej strukturze nie zawiera miejsc katalitycznych które mogłyby fosforylować białka komórkowe

- niezbędny w tym procesie jest udział niereceptorowych kinaz tyrozynowych:

• kinazy Lck i Fyn z rodziny kinaz Src-podobnych

• kinazy ZAP-70 i Syk z rodziny kinaz Syk-podobnych

• kinaza Itk z rodziny kinaz Tec-podobnych

• kinaza z rodziny kinaz Csk-podobnych

- kinazy fosforylują reszty tyrozynowe sekwencji ITAM, sekwencje te znajdują się w obrębie cząsteczek CD3 kompleksu receptora TCR

- do ufosforylowanych tyrozyn sekwencji ITAM może się przyłączyć kinaza ZAP-70, jest ona niezbędna do prawidłowego dojrzewania tymocytów i aktywacji limfocytów na obwodzie

- rezultatem aktywacji kinaz tyrozynowych jest uruchomienie kaskady białek odpowiedzialnych za dalsze przekazywanie sygnału do komórki

- część z nich należy do tak zwanych białek adaptorowych

- cechą charakterystyczną tych białek jest obecność domen odpowiedzialnych za interakcje z innymi białkami, nie wykazują one aktywności enzymatycznej, ich funkcja jest regulowana przez fosforylację, działają jako molekularny łącznik między receptorami powierzchniowymi a cząsteczkami które uczestniczą w przekazywaniu sygnału do wnętrza komórki (np. kaskady kinaz serynowo-treoninowych)

- najlepiej poznanymi białkami adaptorowymi są cząsteczki LAT i SLP-76

- białka adaptorowe mogą regulować nawzajem swoją aktywność

- w wewnątrzkomórkowym procesie przekazywania sygnału do aktywacji LimT główną rolę odgrywają dwa rodzaje szlaków:

• pierwszy z nich zostaje zapoczątkowany przez metabolizm fosfatydyloinozytolu (PI) w błonie komórkowej (przekaźniki drugiego rzędu to trisfosforan inozytolu IP3 i diacyloglicerol DAG) i wiąże się z aktywacją zależnych od wapnia kinaz i fosfataz

• w drugim dochodzi do uaktywnienia białek o właściwościach GTPaz a następnie do przekazania sygnału za pośrednictwem tak zwanych kinaz białkowych aktywowanych przez mitogen (MAPK)

- szlaki kinaz MAP prowadzą do aktywacji czynników transkrypcyjnych, w aktywowanym limfocycie dochodzi do indukcji wielu genów

Cząsteczki powierzchniowe wpływające na proces aktywacji limfocytów T

- cząsteczka CD28 i ICOS oraz ich ligandy odpowiednio CD80/86 oraz ICOSL uczestniczą w najważniejszym szlaku aktywującym w procesie kostymulacji

• CD28 należy do nadrodziny białek Ig-podobnych, występuje konstytutywnie na 50% ludzkich LimT CD8+ i 95% LimT CD4+

• sygnał kostymulujący w znaczący sposób potęguje wydzielanie Il-2 i proliferację LimT

• ponadto zwiększa się wydzielanie Il-4, Il-5, CXCL8, Il-13, INF-gamma, TNF i GM-CSF oraz ekspresja podjednostek α i β receptora dla Il-2 i lagandu dla CD40

• wiązanie się z CD80 ma większe znaczenie przy wykształcaniu się odpowiedzi immunologicznej typu Th1

• wiązanie się z CD86 odgrywa większą rolę przy odpowiedzi typu Th2

• cząsteczka ICOS wykazuje około 30% homologii z CD28 i CTLA-4

• jej ligandem jest ICOSL obecna na APCs

• w przeciwieństwie do CD28 ICOS nie występuje na powierzchni limfocytów dziewiczych

• ulega natomiast ekspresji na stymulowanych LimT w ciągu 48h po aktywacji

• znajduje się również na powierzchni komórek pamięci

• moduluje aktywność LimTh1 i Th2

• zwiększa wydzielanie przez nie Il-4, Il-5, Il-10, IFN-gamma, TNF, ale nie Il-2!

• zwiększa również ekspresję CD154 (CD40L) na powierzchni limfocytów

- z kolei CTLA-4, choć wykazująca dużą homologię do CD28, dostarcza tak zwanej negatywnej kostymulacji, czyli hamuje proces aktywacji

• jest również cząsteczką Ig-podobną

• występuje w błonie komórkowej jako homodimer i wykazuje około 30% homologii do CD28

• ligandami dla niej są CD80 i CD86

• wykazuje około 100-krotnie większe do nich powinowactwo niż CD28

• w przeciwieństwie do CD28 jest indukowana na powierzchni aktywowanych LimT i przekazuje do wnętrza komórki sygnał hamujący aktywację

Ryc. 14.19

Anergia limfocytów T

- przekazanie sygnału z kompleksu TCR nie zawsze musi prowadzić do aktywacji limfocytu

- jego konsekwencją może być również wejście w stan anergii

- limfocyty w stanie anergii nie ulega aktywacji po rozpoznaniu swoistego antygenu nawet jeśli równolegle otrzymuje sygnały kostymulujące, wystarczające do aktywacji limfocytu dziewiczego

- do przyczyn anergi z jednej strony można zaliczyć brak odpowiedniej kostymulacji przy pierwszym rozpoznaniu antygenu przez limfocyt, z drugiej strony za taki stan rzeczy może być odpowiedzialna struktura peptydu rozpoznawanego w kontekście cząsteczki MHC (podstawienie kilku aminokwasów może być przyczyną powstania antygenu częściowo aktywującego - częściowy agonista, lub też nawet hamującego aktywację - antagonista)

- anergia na skutek braku kostymulacji jest jednym z podstawowych mechanizmów fizjologicznej tolerancji własnych antygenów na obwodzie

- anergia wywołana przez zmienione peptydy odgrywa ważną rolę w patogenezie chorób zakaźnych (np. HIV, białka powstające na skutek mutacji mogą nie tylko powodować brak ich rozpoznania przez aktywowane LimT ale również hamować poprzez działanie antagonistyczne aktywację LimT)

- konsekwencją rozpoznania antygenu może być również apoptoza LimT (selekcja tymocytów w grasicy)

Aktywacja limfocytów B

- kompleks receptora BCR rozpoznającego antygen podobnie jak u LimT składa się z dwóch głównych części funkcjonalnych

- jedną z nich jest błonowa forma immunoglobuliny (receptor immunoglobulinowy), odpowiadająca za rozpoznanie antygenu

- w przeciwieństwie jednak do LimT antygen rozpoznawany jest w formie natywnej (nie potrzeba MHC)

- druga część kompleksu BCR odpowiada za przekazywanie sygnału do wnętrza komórki, część tą tworzy heterodimer którego składnikami są błonowe cząsteczki określane nazwami Igα i Igβ, w obrębie każdej z tych cząsteczek znajduje się po jednej sekwencji ITAM

Przekazywanie sygnału do aktywacji do wnętrza komórki

- we wczesnych etapach przekazywania sygnału z BCR dochodzi do aktywacji odpowiednich kinaz tyrozynowych, jako pierwsze aktywowane są kinazy Src-podobne, spośród których trzem (Lyn, Fyn i Blk) przypisuje się największe znaczenie

- aktywacja kinaz Src-podobnych powoduje między innymi fosforylację tyrozyn w obrębie sekwencji ITAM cząsteczek Igα i Igβ

- do ufosforylowanych ITAM przyłączają się kolejne białka biorące udział w przekazywaniu sygnału do wnętrza komórki, jednym z nich jest kinaza tyrozynowa Syk

- w procesie wewnątrzkomórkowego przekazywania sygnału z BCR uczestniczą białka wielu szlaków, z których ważną rolę pełni PLC-γ, GTPazy, Ras i Rac oraz kinaza 3-fosfatydyloinozutolu (PI-3K)

Ryc.14.23

Cząsteczki powierzchniowe wpływające na proces aktywacji limfocytów B

- ostateczny efekt wywoływany przez bodziec działający na receptor antygenowy LimB zależy w dużej mierze od wpływu wywieranego przez inne cząsteczki powierzchniowe

- największą rolę w kostymulacji przypisuje się cząsteczkom CD40, kompleksowi CD19/CD21/CD81, cząsteczce CD22 oraz FcγRIIB (CD32)

• CD40 należy do nadrodziny receptorów dla cząsteczek TNF-podobnych i występuje na wielu typach komórek, ligandem dla niej jest cz.CD154 (CD40L) obecna na LimT, przekazywanie sygnału przez CD40 powoduje aktywację w LimB między innymi kinaz Lyn i Syk, PI-3K oraz fosfolipazy PLC-γ, aktywacja LimB przez CD40 prowadzi również do zwiększonej ekspresji na ich powierzchni cząsteczek Fas, czyni to je podatnymi na apoptozę indukowaną przez FasL

• CD19 jest glikoproteiną występującą wyłącznie na LimB, jej ekspresja zanika po przekształceniu się LimB w komórkę plazmatyczną, jednoczesne związanie CD19 i BCR znacznie obniża próg aktywacji LimB, w błonie występuje w kompleksie z CD21 oraz CD81, jako całość kompleks ten wzmaga kostymulację LimB przez CD40, CD38, CD72 oraz indukuje adhezję LimB do fibronektyny

• CD22 jest cząsteczką należącą do nadrodziny białek Ig-podobnych, w błonie komórkowej LimB jest konstytutywnie związana z BCR, pobudzenie BCR prowadzi do fosforylacji tyrozyn w CD22, konsekwencją tego jest przyłączenie się różnych czynników determinujących przekazywanie sygnału przez BCR

• CD32 (FcγRIIB) jest negatywnym regulatorem przekazywania sygnału z BCR, jednym z mediatorów jego działania jest fosfataza SHP-1 przyłączająca się do sekwencji ITIM receptora, innym enzymem jest fosfataza tyrozynowa SHIP

• CD134L (OX40L) jest cząsteczką występującą na powierzchni aktywowanych LimB, pozbawienie LimB tej cząsteczki uniemożliwia przełączanie klas!

• CD30 i CD153 są cząsteczkami powierzchniowymi LimB związanymi z negatywną regulacją odpowiedzi humoralnej, przekazywanie sygnału przez te cząsteczki hamuje proces przełączania klas, ogranicza również aktywację LimB o małym powinowactwie do antygenu

- pomimo iż procesy aktywacji LimB i LimT zostały opisane oddzielnie należy pamiętać, że oba te procesy są ze sobą w ścisłym związku, LimB mogą pełnić rolę profesjonalnych komórek prezentujących antygen, a LimT pomocnicze są potrzebne w większości przypadków do prawidłowej aktywacji LimB

ryc. 14.25

---