0 Ćwiczenie 4 II rok, Biotechnologia, III semestr, BKiIG, Instrukcje


Ćwiczenie 4

Izolacja plazmidu do klonowania z wykorzystaniem zestawów
do izolacji DNA (miniliza), trawienie i elektroforeza plazmidu.

Materiał do kolokwium - instrukcja, metody izolacji DNA plazmidowego, klonowanie

Metoda ta jest wykorzystywana przede wszystkim do izolacji plazmidowego DNA z wielu małych hodowli. Może być wykorzystywana do identyfikacji klonów.

Procedura opiera się na tzw. metodzie alkalicznej, w której roztwory zasadowe użyte są
do denaturacji DNA, a następnie wykorzystując różnice w czasie renaturacji (koliste plazmidy, zawierające sczepione ze sobą nici DNA renaturują znacznie szybciej, niż DNA chromosomu bakteryjnego) można oczyścić DNA plazmidowe od DNA chromosomowego. Roztwór GL3 zobojętnia środowisko, a równocześnie powoduje wytrącenie DNA chromosomowego i białek. Istotne jest w tej metodzie przestrzeganie czasu trwania denaturacji alkalicznej, ponieważ zbyt długie przetrzymywanie DNA w roztworach zasadowych powoduje nieodwracalną denaturację. Takie DNA nie poddaje się reakcjom trawienia lub ligacji.

Zasada działania kolumny opiera się na zdolności DNA do adsorpcji na powierzchni krzemionki w obecności związków chaotropowych (denaturujących białka,
np. chlorowodorek guanidyny). Po przemyciu czysty DNA jest wymywany buforami o niskiej sile jonowej lub wodą.

Materiały i odczynniki:

Całonocna hodowla bakteryjna w 2 ml pożywki z antybiotykiem, schłodzona w lodzie
i odwirowana w temp. pokojowej, zamrożona

Kolumna do izolacji DNA (pojemność 20 μg DNA)

Roztwór L1 (do zawieszania bakterii: 50 mM Tris:HCl, pH 8.0; 10 mM EDTA; 100 ug/ml RNaza A)

Roztwór L2 (do lizy bakterii: 0.2 N NaOH; 10% SDS)

Roztwór GL3 (zobojętniający: 3 M CH3COOK; 5% CH3COOH; 8 M chlorowodowek guanidyny)

Roztwór W (do przemywania kolumny)

Roztwór A1 (do przemywania kolumny)

H2O (do wymywania DNA z kolumny)

Mikrowirówka

Termoblok

Enzym restrykcyjny EcoRI (10 U/μl)

Bufor do trawienia EcoRI 10x: (0.5 M Tris-HCl pH 7.5; 0.1 M MgCl2; 1 M NaCl;
0.2% Triton X-100; 1mg/ml albuminy)

Agaroza (naważka 0.24 g)

Bromek etydyny (20 mg/ml)

Bufor LB do obciążania DNA (0.25% błękit bromofenolowy; 0.25% cjanol ksylenu;
30% glicerol)

Marker do DNA (DNA  /HindIII)

Bufor TAE do elektroforezy 50x (0.2 M Tris:octan; 0.05 M EDTA)

Aparat do elektroforezy horyzontalnej

Transiluminator

Wykonanie

  1. Osad bakterii z całonocnej hodowli należy zawiesić dokładnie w 200 μl roztworu L1, dodać 200 μl roztworu L2 i wymieszać delikatnie przez odwracanie probówki 5-6 razy. Inkubować 3 min. w temperaturze pokojowej.

  2. Dodać 400 μl roztworu GL3 i obracać probówkę delikatnie 6-8 razy. Odwirować
    przy maksymalnych obrotach przez 10 minut.

  3. Supernatant nanieść na kolumnę i wirować 1 minutę na maksymalnych obrotach.

  4. Przefiltrowany roztwór odrzucić, kolumnę przemyć 500 μl roztworu W, wirować
    1 minutę na maksymalnych obrotach, przefiltrowany roztwór odrzucić.

  5. Przemyć kolumnę 700 μl roztworu A1, wirować 2 minuty na maksymalnych obrotach, przefiltrowany roztwór odrzucić.

  6. Do elucji DNA przenieść suchą kolumnę do nowej probówki (podpisanej - DNA plazmidowe) i dodać 60 μl H2O bezpośrednio na membranę. Inkubować 3 minuty
    w temperaturze pokojowej i odwirować 1 minutę na maksymalnych obrotach. Kolumnę wyrzucić.

  7. 4 μl DNA zawiesić w 200 μl H2O, zmierzyć ilość DNA spektrofotometrycznie, wykorzystując wzór:
    C [μg/μl] = (A260 -A320) x rozcieńczenie x 0.05
    W dzienniku laboratoryjnym musi być zapisane stężenie DNA plazmidowego oznaczone na ćwiczeniach.

  8. Trawienie plazmidu enzymem EcoRI - Sporządzić mieszaninę do trawienia:
    DNA 0,5 μg
    10x bufor do EcoRI 2 μl
    EcoRI 0,5 μl (dodaje prowadzący ćwiczenia)
    H2O do 20 μl
    Trawić w temperaturze 370C, 1 godzinę

  9. W tym czasie z naważki agarozy przygotować i wylać żel (0.8%, 30 ml)
    i przygotować preparat DNA nietrawionego:
    DNA 0.25 μg + H2O do 10 μl + 2 μl Buforu LB

  10. Po trawieniu nanieść próby DNA nietrawionego i DNA potrawionego EcoRI (10 μl + 2 μl buforu LB). Elektroforezę prowadzić 15-30 minut.

  11. Preparaty nietrawionego i trawionego DNA należy dokładnie podpisać nazwą grupy, sekcji i datą, a następnie oddać do zamrożenia - będą wykorzystywane na następnych ćwiczeniach.



Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
0 Ćwiczenie 2 II rok + spraw, Biotechnologia, III semestr, BKiIG, Instrukcje
Chromatografia, Biotechnologia, III semestr, BKiIG, Instrukcje
Ćwiczenie 4 II rok ze wstępem, Biotechnologia POLSL, Semestr III, BKiIG, Laboratorium, Instrukcje
0 Cwiczenie 6 II rok spraw, biotechnologia inż, sem3, BKiIG, laborki, sprawka
0 Cwiczenie 1 II rok spraw, biotechnologia inż, sem3, BKiIG, laborki, sprawka
0 Cwiczenie 3 II rok spraw, biotechnologia inż, sem3, BKiIG, laborki, sprawka
2010 KD mgr zaocz teczka, Skrypty, PK - materiały ze studiów, II stopień, pomoc, III semestr, KBI 2
tematy cwiczen - ii rok biologii, Biol UMCS, IV semestr, Biologia molekularna, Egzamin
cwiczene 5, II rok, II rok CM UMK, Giełdy, od Joe, histologia i embriologia, HISTOLOGIA, Materiały n
Instrukcja II rok, Biotechnologia, Współczesne metody analizy materiału biologicznego
Praca na analize- gotowa, biotechnologia UP poznań, III semestr, analiza instrumentalna
Ćwiczenie 1, II rok, Immunologia
warzywa szczegolowa, OGRODNICTWO UP WRO, II rok OGR, III sem, UPRAWA ROŚLIN ROLNICZYCH
zarządzanie jakością karaś II rok, Po I-III rok

więcej podobnych podstron