Klasa: Actinobacteria

Rząd: Actinamycetales

Rodzina: Mycobacteriaceae

Rodzaj: Mycobacterium

Grupa 1: MTC- Mycobacterium Tuberculosis Complex (TG)

Grupa 2: MOTT- Mycobacterium Other than tuberculosis

MTC: Mycobacterium tuberculosis (gruźlica)

Mycobacterium bovis (głównie przeżuwacze)

Mycobacterium bovis BCG (szczepionkowy atenuowany szczep)

Mycobacterium africanum najgroźniejsze

Mycobacterium microti

Mycobacterium canettii

Grupa 3: Runyon podzielił prątki w zależności od czasu wzrostu i warunków produkcji barwnika:

1. Skotochromogenne- wolno rosnące (powyżej 7 dni), wytwarzające barwnik żółtopomarańczowy w ciemności i w świetle

2. Fotochromogenne- wolno wytwarzające barwnik żółtopomarańczowy tylko w świetle

3. Niefotochromogenne- wolno rosnące, niewytwarzające barwnika, należą tu M. avium oraz M. intracellulare określane łącznie MAC- Mycobacterium Alium Complex

M. avium subsp. Paratuberculosis (M. johnei) poza kompleksem MAC

4. Fortuitum- Szybko rosnące(rosną do 7 dni)

M. leprae- wywołuje trąd u ludzi, nie rośnie na sztucznych podłożach

1. Charakterystyka

• 1822 r.- R. Koch odkrył bakterie w Olsztynie

• 1905 r.- R. Koch dostał nagrodę Nobla

2. Morfologia

• G+ ale bardzo trudno barwią się metodą Gramma

• Barwimy metosą Ziehl- Neelsena

• Wymiary od kilku dokilkunastu µm, saprofityczne nitki powyżej 10 µm

• Rzęski -

• Otoczki -

• Endospory -

• Ściana komórkowa jest bardzo specyficzna

• Kwasoodporne!

• Budowa ściany:

• 60% masy stanowią lipidy, są tu kwasy mykolowe mają od 70- 90 atomów węgla

• kwasy tłuszczowe od 10- 20 atomów węgla, wśród których wyróżniamy kwas tuberkulostearynowy

• glikolipidy: lipoarabinomannan (funkcja antygenu O w LPSie innych batkerii) oraz lipoarabinogalaktan

• Fosfolipidy z enzymem mannozydaza fosfatydyloinozytolowa, która nie dopuszcza do tworzenia się fagosomu i niszczenia prątków

• Sulfolipidy

• Woski: trehaloza dwumykolowa zwana woskiem C lub cord factor- powoduje, że prątki zjadliwe rosną w postaci pofałdowanych wiązek- preparat MTC- skupiska, a formy typowe- rozsiane, nieposiadaną kortfaktora, mało zjadliwe

• Białka 15% masy ściany i należą tu: białka transportujące i białka porynowe a oczyszczone noszą nazwę PPD wykorzystywane do testów skórnych przy gruźlicy

• Dzięki takiej budowie ściana jest immunostymulatorem i służy do produkowania adiuwantów Freunda, dodatkowo do szczepionek gdyż pobudza immunogenność

3. Chorobotwórczość

• Prątki są oporne na czynniki środowiska zewnętrznego, działa na nie światło słoneczne ok. 5h, są bardzo oporne na 6% HCl, 2% ług sodowy, 2% formalinę, 4% związki chloru, ogrzewanie w 65 stopniach przez 30 minut, w zakwaszonym mleku przeżywają do 2 tygodni

4. Właściwości biochemiczne

• Wytwarzają enzymy: katalaza, dysmutaza ponadtlenkowa, peroksydaza, fosfataza i ureaza

5. Czynniki wirulencji

• Brak toksyn

• Mechanizmy związane z budową ściany

• Prątki dostają się do makrofaga przez receptory CR1/ CR2, które nie stymulują oksydacyjnej reakcji sójczej makrofaga czyli nie dochodzi do aktywacji makrofagów. Sulfonamidy hamują połączenie fagosomu z lizosomom czyli chronią prątek przed enzymami lizosomalnymi. Jeśli powstanie fagolizosom to makrofag dopuszcza do zakwaszenia a prątki nie pozwalają na zakwaszenie. Katalaza, dysmutaza ponadtlenkowa i peroksydaza niszczą reaktywne formy tlenu.. Bakterie produkują mechanizmy podwyższające jej odporność na reaktywny azot ( w fagolizosomie). Trehaloza dwumykolowa- hamuje oddawanie tlenu w mitochondriach i hamuje chemotaksję makrofagów. Glikolipidy pełnią funkcję ochraniającą prątki:

1. Neutralizują rodniki tlenowe

2. LAM- nie dopuszcza do aktywacji i proliferacji limfocytów T, blokuje gen, który odpowiada za produkcję INF- γ, a jeśli INF-γ pojawi się to LAM nie dopuszcza do interakcji z białkami- lipazy C, przez co nie dochodzi do aktywacji makrofaga

3. Blokują receptory białkowe na powierzchni makrofaga, wiążące fibronektynę co powoduje, że nie dochodzi do aktywacji limfocytów T

4. LAM jest silnym induktorem TNF- α, który uszkadza tkankę zwłaszcza miąż płucny

5. Gromadzące się makrofagi i limfocyty tworzą wał włóknisty wokół i powstaje guzek gruźlicowy- ziarnicowy z masą serowatą w środku. Jeśli jest słabe działanie makrofagów to następuje uogólnienie procesu gruźliczego i prątki rozprzestrzeniają się drogą limfy i krwi. Jeśli organizm jest silny to masa serowata ulega zwapnieniu, bakterie w tych ogniskach przeczekują sobie, a gdy organizm nie może sobie poradzić to zaczynają swoją działalność

6. Obrona

• Po wniknięciu bakterii następuje aktywacja makrofagów i wytwarzenia IL-1 i IL-2. IL-1 aktywuje limfocyty T i powoduje ich proliferację do limfocytów Th1 i komórek NK. Limfocyty Th1 produkują INF- γ, który aktywuje makrofagi i powoduje, że wytwarzają one cytokiny: 3, TNF- α i cytokinę GM- CSF, która powoduje kolonizację granulocytów i makrofagów. IL-2 ciągle aktywuje nowe klony limfocytów, współdziała z IL-1. Pojawiają się limfocyty TCR- rozpoznają fosfolipidy oraz limfocyty restrykcyjne z markerem CD1, które rozpoznają glikolipidy. Wytwarza się klon limfocytów Th2, które biorą udział w stymulacji komórek do produkcji IL: 4, 5, 12 i 13, pobudzające limfocyty B do produkcji przeciwciał.

• Przeciwciała przy zakażaniu prątkami nie odgrywają żadnej roli!

7. Diagnozowanie:

• Aby zobaczyć pod mikroskopem musi być 10 tysięcy prątków w 1 ml, aby wyhodować musi być 1 tysiąc prątków w 1 ml. Należy zagęścić czyli homogenizować.

• Materiał: plwocina 3-5 ml, wymazy z krtani, popłuczyny z tchawicy z oskrzeli, płyn z opłucnej, otrzewnej, płyn mózgowo- rdzeniowy, mocz, mleko, szpik

• Płyn wirujemy a osad poddajemy homogenizacji

• Homogenizacja powoduje zagęszczanie i zniszczenie flory towarzyszącej.

1. Metoda Petroffa- ługowa- próbkę w stosunku 1:1 zalewamy 4% ługiem sodowym, wytrząsamy przez 30 minut w 30 stopniach, nautralizujemy w 9% HCl, wirujemy, osad do badań

2. Metoda fosforanowa- próbkę w stosunku 1:1 zalewamy 10% Na3 PO4, przetrzymujemy w temperaturze pokojowej całą noc, neutralizujemy 9% HCl i wirujemy

3. Metoda z 0,2% chlorheksydyną- próbkę w stosunku 1:2 mieszamy z chlorheksydyną, wytrząsamy 30 minut w 37 stopniach, wirujemy, osad do badań

4. Metoda z N- acetylo-L- cysteiną- przygotowujemy roztwór: 50 ml 4% ługu sodowego, 50 ml 2,9% cytrynianu sodu i 0,5g N- acetylo- L- cysteiny w stosunku 1:2 do próbki, wstrząsamy przez 30 minut w 37 stopniach, wirujemy, osad do badań

DIAGNOSTYKA

1. Badanie bezpośrednie mikroskopowe- rozmaz na szkiełku, suszymy, utrwalamy i barwimy metodą Ziehl- Neelsena: zalewamy fuksyną fenolową na 5 minut i 3 razy podgrzewamy, spłukujemy wodą i dobarwiamy 3% kwasem solnym (kilka sekund), spłukujemy wodą i dobarwiamy błękitem metylowym na 5 minut. Prątki barwią się na czerwono w skupiskach- zjadliwe

Hodowla:

1. Podłoże Lowensteina- Jensena- glicerol, który przyśpiesza wzrost prątków ludzkiego i ptasiego

2. Podłoże Stonebrinka- pirogronian sodu, który przyśpiesza wzrost prątków głównie bydlęcych

3. Podłoże Ogawy- glicerol, glutaminian sodu

4. Podłoże Middlebrooka- glicerol, kwas oleinowy

5. Podłoże Petragmanego- glicerol i mąka ziemniaczana

Podłoża te zamiast agaru mają masę jajową, mają asparaginę i zieleń malachitową, która wyhamowuje wzrost flory towarzyszącej.

Mycobacterium tuberculosis- wzrost obfity czyli eugoniczny, kolonie twarde, skórzaste, kalafiorowa te, barwy jasnoróżowej, trudno zawieszalne

Prątek bydlęcy: kolonie małe, białe, płaskie, tlenowe, gładkie

M. avium kolonie małe, gładkie, wypukłe, lepkie, białawe, śluzowe

6. Szybkie metody hodowli na podłoży płynnym bulionowym Middlebrooka C14 węglan i oceniamy poziom wzrostu, rośnie około tygodnia.

RÓŻNICOWANIE

1. Test niacynowy- prątki ludzkie wytwarzają dużo niacyny a inne- ptasie i bydlęce mniej

Hodowla 30 dniowa (płynna lub zestalona) dodaje się cyjanku potasu w obecności chloraminy, żółto- niacyna dodatnie dla prątku ludzkiego

2. Test z glicerolem gdzie wzrost engoniczny dla M. avium natomiast wzrost agoniczny dla M. bovis (skąpy)

3. Odczyn cytochemiczny- prątki zjadliwe wiążą czerwień obojętną do 30 minut, a prątki niezjadliwe nie wybarwiają się

4. Szereg amidazowy- składa się z 10 substancji z których najważniejsze to acetamid, pyrazydamid, mocznik. M. tuberculosis rozkłada enzymy w szeregu tworząc związki

5. Zjadliwość dla zwierząt laboratoryjnych:

• Świnka- wrażliwa na M. tuberculosis

• Świnka i królik- M. bovis

• Drób- M. avium

6. Badanie biologiczne- dwóm świnkom domięśniowo podajemy 0,5 ml homogenizatu w kończyny w pobliżu węzłów. Usypiamy jedną świnkę a po 6 tygodniach a drógą po 10-12 tygodniach. Robimy sekcję i oglądamy zmiany anatomopatologiczne

GRUŹLICA- nadwrażliwość typu opóźnionego, stąd test tuberkulinowy. Prątek z komórekami prezentującymi dostaje się do najbliższych węzłów chłonnych i dochodzi do aktywacji limfocytów T- około miesiąca. Aktywne limfocyty T utrzymują się w organizmie przez lata. Przy ponownym wniknięciu prątka, te limfocyty T produkują Th1 a te stymulują wytwarzanie cytokin prozapalnych IL-1,6, TNF- α i IL-8 hemotaktyczną. W ciągu 24-48 h następuje ścignięcie do miejsca wprowadzenia komórek- makrofagów, limfocytów, monocytów, granulocytów, histiocytów. Tworzy się odczyn zapalny, który ulega zropieniu, zrogowaceniu i zanika- świadczy to o obecności prątków. Na tym polega próba tuberkulinowa (tuberkulina to białko, do 10 kDa, podawane śródskórnie!)

Rodzaje tuberkuliny:

1. Starakocha- otrzymał ją Koch na podłożu płynnym, hodowla 30 dniowa, filtrat zabijamy w autoklawie przez 1 h, zagęszczony przez odparowanie

2. Produkowane na podłożach syntetycznych - tak samo robiona (jak Kocha), ale oprócz białka prątka były produkty metabolizmu, kwasy nukleinowe, węglowodany, które też dawały reakcje nieswoiste

3. Białko PPD- wytwarzane przy pomocy kwasu trój chlorooctowego i oczyszczone, dlatego zawiera tylko czyste białka ze ściany prątka

Szczepionka- żywy, atenuwany szczep M. bovis

FENOMEN KOCHA- jeżeli zdrowej śwince podamy podskórnie zjadliwe prątki to po 2 tygodniach tworzy się naciek, owrzodzenie i uogólnienie procesu a następnie zgon. Jeżeli prątki te zjadliwe podamy śwince chorej to po 24- 48h powstanie odczyn zapalny i płytkie owrzodzenie, które goi się i nie dochodzi do rozprzestrzeniania się zmian gruźliczych

1

---